Name: A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a manipulação mecânica de neurônios para controlar o desenvolvimento axonal usando agulhas de vidro calibradas. Este método permite medir forças na faixa de microdinas durante a elongação axonal.

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Agradecemos as importantes contribuições do Dr. Robert E. Buxbaum no desenvolvimento desta metodologia.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Técnicas para aplicar e medir forças celulares têm uma longa história 9. Nosso método foi originalmente motivado pelo trabalho de Dennis Bray, que usou agulhas de vidro semelhante ao nosso para &quot;rebocar&quot; os neurônios em uma taxa constante através de um dispositivo motorizado hidráulico 10. Existem muitos meios alternativos de aplicação de forças para as células que incluem: motores de passo 11, 12 esferas magnéticas, vigas microfabricated 13 e fluxos de fluido 1...

<table><tbody><tr><td>Tubo capilar R-6</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>Tubo de vidro R-6, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>Puxador BB-CH</td><td>Mecanex S.A., Genebra, Suíça</td><td>BB-CH puller</td><td>Utilize o Modo 4 Alt com CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>Fio de Cromel 0,001&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>Fio termopar sem revestimento, carretel de 50 pés, agora chamado Chromega</td></tr><tr><td>Fio de Constantan 0,003&quot;</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>Fio termopar sem revestimento, carretel de 50 pés</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox nº 5</td></tr><tr><td>Suporte universal para microscópio com braço articulado</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 ou 90430</td><td>A maioria das marcas ou tipos de suporte com braço articulado funcionará para este uso</td></tr><tr><td>Micromanipulador mecânico</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>Micromanipulador mecânico de três eixos com acionamento direto</td></tr><tr><td>Micromanipulador hidráulico</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>Agora disponível como MMO-203, tipo com três eixos móveis</td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Jogo com 3 unidades</td></tr><tr><td>Suporte simples para instrumento</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Suporte duplo para instrumento</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador mecânico</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Montagem em haste, 1 suporte para sonda, modelo RH 430001</td></tr><tr><td>Micromanipulador mecânico com joystick</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscópio invertido</td></tr><tr><td>Mesa de isolamento Vibraplane</td><td>Kinetic Systems</td><td>Série 1200</td><td>O nosso é o modelo 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>Construído artesanalmente (ver referência 19)</td><td></td><td>Referência 19, requer controlador atualizado listado abaixo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura programável</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>Substitui o controlador de temperatura descontinuado PXV3</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Microscópio invertido, aproximadamente de 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10, binocular para dissecação</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Outros microscópios para dissecação funcionarão</td></tr></tbody></table>

a manipulação mecânica de neurônios para controlar o desenvolvimento axonal

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Manipulações de células e extensão de axônios neuronal pode ser realizado com vidro calibrado micro-fibras capazes de medir e aplicação de forças na faixa de 1,2 1-10 μdyne. Medidas de força são obtidos através da observação da Hookean flexão das agulhas de vidro, que são calibrados por um método direto e empírica 3. Requisitos de equipamentos e procedimentos para a fabricação, calibração, tratamento e usando as agulhas sobre as células estão completamente descritos. A força de regimes tipos de células usadas anteriormente e diferente para que estas técnicas foram aplicadas demonstrar a flexibilidade da metodologia e são dados como exemplos para futuras investigações 4-6. As vantagens técnicas são as &quot;visualização&quot; contínua das forças produzidas pelas manipulações ea capacidade de intervir diretamente em uma variedade de eventos celulares. Estes incluem a estimulação direta e regulação do crescimento axonal e retração 7, assim como desapego e medições mecânicas em qualquer tipo de células cultivadas 8.

Aplicação e medições diretas de forças sobre os neurônios na faixa Microdyne 2000-1000 são obtidos com alta precisão usando agulhas de vidro calibrado. Esta metodologia pode ser usada para controlar e medir vários aspectos do desenvolvimento axonal, incluindo a iniciação axonal, a tensão axonal, a velocidade de alongamento axonal, e vetores de força.

A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal

Manipulações celulares e a extensão de axônios neuronais podem ser realizadas com microfibras de vidro calibradas, capazes de medir e aplicar forças na...

O objetivo deste experimento é estender um axônio enquanto se medem com precisão as forças. Isso é alcançado por meio da confecção de uma agulha de referência de arame diretamente calibrada, seguindo-se a calibração da agulha de referência de arame; agulhas calibradas, intermediárias e de trabalho são preparadas na faixa de força desejada. Em seguida, cones de crescimento são rebocados com uma agulha de trabalho para promover o alongamento de um axônio.O alongamento axonal resultante é registrado e as forças são medidas com base na flexão da agulha calibrada. Este método pode responder perguntas fundamentais sobre a biofísica do alongamento axonal. Inicie este procedimento utilizando um puxador de microsserrote ajustável e tubos capilares de vidro para fabricar agulhas com pontas afiladas de aproximadamente quatro milímetros de comprimento.Armazene as agulhas em uma placa de Petri de 160 milímetros com tampa. Em seguida, prepare uma agulha de calibração de arame inserindo um arame de cromel de 0,001 polegada no interior de uma agulha de vidro com a ponta quebrada. Puxe o arame para fora da ponta até um comprimento de 26 milímetros e fixe-o com cola instantânea.Dobre o milímetro dis

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método de engenharia de tecido exclusivo foi desenvolvido para alongar as fibras nervosas numerosos na cultura recapitulando crescimento estiramento do axônio, uma forma de crescimento do sistema nervoso através do qual os nervos alongados em conjunto com o crescimento do corpo aumentando.

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Imagem de dois fótons, acoplado a nanodissection laser, são ferramentas úteis para estudar processos degenerativos e regenerativos no sistema nervoso central, com resolução subcelular. Este protocolo mostra como rotular, imagem e dissecar fibras escalada individuais no córtex cerebelar in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Este manuscrito detalha a fabricação de redes neurais manipuladas com micro-tecidos: construções tridimensionais de tamanho micrométrico, constituídas por longos trilhos axonais alinhados que abrangem a (s) população (s) neuronal agregada (s) envolvida (s) em um hidrogel tubular. Esses andaimes vivos podem servir como relés funcionais para reconstruir ou modular circuitos neurais ou como bancas biofidais que imitam a neuroanatomia de matéria cinza-branca.

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Este procedimento descreve como iniciar rapidamente, estender e conectar neurites organizados em câmaras microfluídicas usando pérolas revestidas de poli-D-lisina fixadas em micropipetas que guiam o alongamento de neurites.

Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

Os ensaios de crescimento de neuritos fornecem um valor quantitativo sobre os processos neuronais regenerativos. A vantagem deste software semiautomático é que ele segmenta corpos celulares e neurites separadamente, criando uma máscara e mede vários parâmetros, como comprimento de neurites, número de pontos de ramificação, área de aglomerado de células-corpo e número de aglomerados de células.

Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos 

Este protocolo descreve um sistema microfluídico modelando a dinâmica metabólica neuronal pós-lesão axonal, permitindo imagens, análise multiômica e estudos mecanicistas de remodelação metabólica intrínseca.

Chip microfluídico para construção de modelos de lesão axonal e habilitação de análise multiômica

Aprenda a manipulação mecânica de neurônios para controlar o desenvolvimento axonal usando agulhas de vidro calibradas. Este método permite medir forças na faixa de microdinas durante a elongação axonal.

A manipulação mecânica de Neurônios para controlar o desenvolvimento Axonal

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