Experimento Perfil bioenergética usando células C2C12 mioblastos

O objetivo geral do experimento a seguir é testar o estado funcional das mitocôndrias em células vivas e mitocôndrias isoladas, medindo múltiplos parâmetros do metabolismo oxidativo com o analisador de fluxo extracelular XF 96. Esses parâmetros são a respiração basal, a conversão de ATP, o vazamento de prótons e a respiração máxima ou capacidade respiratória de reserva. Isso é realizado adicionando sequencialmente moduladores específicos da respiração mitocondrial a células de mioblastos C two C 12 e medindo a alteração na taxa de consumo de oxigênio, ou OAR, um indicador da respiração, e a conversão de glicose em lactato, que gera ATP através da glicólise.

O outro principal caminho de energia nas células também é medido como ECAR ou taxa de acidificação extracelular. Podem ser obtidos resultados de perfil mitocondrial que fornecem informações sobre o papel central que a função mitocondrial desempenha na determinação da longevidade das células. Olá, meu nome é David Nichols.

Sou um artista mitocondrial ao longo de toda a minha carreira, e o equipamento mais importante que utilizei nos meus estudos foi o eletrodo de oxigênio. Se você conseguir medir a taxa de consumo de oxigênio sob diferentes condições com mitocôndrias isoladas, obterá uma quantidade enorme de informações relevantes. Quando se passa para células, especialmente aquelas cultivadas em uma placa de múltiplos poços ou sobre um lamínula, os métodos clássicos não funcionam.

Este é um problema importante, que foi superado há alguns anos com o desenvolvimento de um ensaio em placa de múltiplos poços, permitindo-nos estudar a respiração celular em paralelo em formato de placa de múltiplos poços. O que você verá hoje é um experimento muito simples, mas rico em informações, que desenvolvemos para monitorar a função bioenergética mitocondrial básica em células cultivadas. Para começar, semeie as células em placas de cultura celular XF 96 com 10.000 células por poço em 100 microlitros de meio de crescimento e coloque em um incubador a 37 °C com 10% de dióxido de carbono.

As células podem ser analisadas no XF 96, 24 horas após a semeadura, utilizando o ensaio. O assistente gera um modelo com o seguinte layout de grupos. As colunas de um a doze contêm todas 10.000 células C2C12.

O grupo um, em azul, é usado como células controle. O grupo dois, em vermelho, receberá os fármacos oligo Micina, FCCP e roone. Em seguida, prepare os compostos no meio de ensaio X-F-D-M-E-M conforme descrito na parte escrita do protocolo.

Oligomicina, FCCP, rotenona. Esses compostos são pré-dispensados no kit de teste de estresse mitocondrial XF. Utilizando a estação de preparo XF, substitua o meio de crescimento pelo meio de corrida DMEM.

Finalmente, incubar as células em uma incubadora a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono durante 60 minutos para permitir que as células pré-equilibrem com o meio do ensaio antes de adicionar os compostos injetáveis ao cartucho do sensor, aquecendo os compostos a 37 graus Celsius. Em seguida, carregue-os nas portas injetoras conforme a seguir. Para as colunas de um a quatro, adicione 16, 18 e 20 microlitros de meio de ensaio XF ou DMEM nas portas A, B e C, respectivamente.

Para as colunas cinco a doze, carregue 16 microlitros de toda a ligamicina no porto A, 18 microlitros de FCCP no porto B e 20 microlitros de rotenona no porto C. Em seguida, defina os comandos do protocolo: defina o ciclo para três vezes. Misture por três minutos e meça por três minutos. Em seguida, clique em iniciar.

Siga as instruções na tela, que indicarão ao usuário quando carregar a cartela após a conclusão da calibração. Siga os avisos ao usuário e adicione a placa de células para o experimento. Em seguida, clique em continuar e permita que o ensaio seja executado.

Remova a placa quando o experimento tiver terminado. Este ensaio é derivado do experimento clássico para caracterizar a função mitocondrial e serve como uma estrutura para desenvolver experimentos mais complexos destinados a compreender os diversos efeitos de compostos sobre o metabolismo celular, a função mitocondrial e as atividades bioenergéticas gerais. Aqui, observamos a resposta esperada na taxa de consumo de oxigênio conforme as células foram tratadas com cada composto sucessivamente.

A produção de ATP diminuiu como resultado do bloqueio da síntese de ATP no complexo mitocondrial V pela oligomicina. Como as células não conseguiram sintetizar ATP via fosforilação oxidativa após o tratamento com oligomicina, recorreram à glicólise para atender à sua demanda por ATP. Assim, observamos um aumento na taxa de acidificação extracelular (ECAR), um indicador da glicólise, conforme demonstrado anteriormente. O FCCP atua como agente desacoplador e remove a limitação da reentrada de prótons.

A respiração acelera e agora é limitada pelo transporte de elétrons. Por fim, o rotenona inibe o complexo I mitocondrial, o que faz cessar o fluxo de elétrons na cadeia de transporte de elétrons e, consequentemente, o consumo de oxigênio foi drasticamente reduzido. Aqui se obtém informações sobre a respiração basal das células, a porcentagem do consumo de oxigênio destinada à produção de ATP, bem como a quantidade destinada à manutenção do gradiente de prótons devido ao vazamento de prótons.

Além disso, podemos obter a taxa respiratória máxima sob condições de respiração desacoplada, às vezes denominada capacidade respiratória residual. E, finalmente, podemos determinar a quantidade de consumo de oxigênio não atribuível a processos mitocondriais. Você acabou de ver com o seahorse.

XF 96, uma série de experimentos que fornece uma quantidade enorme de informações sobre a bioenergética mitocondrial nas células. O experimento básico, que é tão importante que o chamamos de experimento número um, fornece informações sobre a respiração basal, a renovação de ATP, o vazamento mitocondrial de prótons e a capacidade respiratória de reserva. Esses parâmetros fornecem informações fundamentais sobre o estado bioenergético das mitocôndrias na célula.