Name: Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a analisar biofilmes orais mediados por estreptococos do grupo mutans usando uma caixa de ferramentas analítica integrada com imagem confocal e software personalizado. Este método combina análise estrutural e transcriptômica para compreender a organização microbiana.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Gary Xie e Herbert Lee para o desenvolvimento do MDV. Agradecemos também os drs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches, e Ms. Stacy Gregoire por sua contribuição técnica e científica para os componentes analíticos da caixa de ferramentas. Este estudo foi apoiado em parte pela USPHS Research conceder DE018023 do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial.

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sucrose+in+cariogenic+dental+biofilm+formation--new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight.</a> J Dent Res. 85, 878-887 (2006).</li>
<li>Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+and+tt-farnesol+with+fluoride+effects+on+S.+mutans+biofilms+and+dental+caries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries.</a> J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).</li>
<li>Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharides+produced+by+Streptococcus+mutans+glucosyltransferases+modulate+the+establishment+of+microcolonies+within+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms.</a> J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).</li>
<li>Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+naturally+occurring+agents+in+combination+with+fluoride+on+gene+expression+and+structural+organization+of+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms.</a> BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).</li>
<li>Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Streptococcus+mutans+transcriptome+in+response+to+starch+and+sucrose+during+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development.</a> PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).</li>
<li>Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+Study+the+Physiology+of+Oral+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms.</a> Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).</li>
<li>Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+mutans+biofilm+accumulation+and+polysaccharide+production+by+apigenin+and+tt-farnesol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol.</a> J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).</li>
<li>Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apigenin+on+gtf+gene+expression+in+Streptococcus+mutans+UA159%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+basis+of+the+role+of+starch+and+sucrose+in+Streptococcus+mutans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).</li>
<li>Cury, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+purification+of+total+RNA+from+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms.</a> Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).</li>
<li>Xiao, J., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+and+dynamics+of+exopolysaccharide+matrix+and+microcolonies+formation+by+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms.</a> J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+macromolecules+within+an+in+vitro+model+of+supragingival+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).</li>
<li>Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+metabolic+activity+indicator+in+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms.</a> J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nesta apresentação, demonstramos dois componentes críticos do Analytical caixa de ferramentas (EPS / bactérias imagem e microarray de mineração de dados / processamento), a versatilidade e utilidade das várias análises integradas no sistema. Claramente, a caixa de ferramentas facilitou a análise abrangente (comparativo) e simultânea dos vários aspectos da bioquímica biofilmes, arquitetura e expressão gênica em resposta às diferentes condições experimentais, utilizando um modelo in vitro. 7 C...

<table><tbody><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Syto 60</td><td>Invitrogen</td><td>S11342</td><td></td></tr><tr><td>Dextrana conjugada com alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio a laser de varredura com dois fótons Olympus FV1000</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e transcriptoma abrangente de biofilmes oral mediada por estreptococos do grupo mutans

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilmes são altamente dinâmicas, comunidades organizadas e estruturadas de células microbianas enredados em uma matriz extracelular de densidade variável e composição 1, 2. Em geral, os biofilmes se desenvolvem a partir de fixação microbiana inicial em uma superfície seguido pela formação de grupos de células (ou microcolônias) e um maior desenvolvimento e estabilização do microcolônias, que ocorrem em uma matriz complexa extracelular. A maioria dos exopolissacarídeos biofilme matrizes porto (EPS), e biofilmes dentários não são excepção, especialmente aqueles associados à doença cárie, que são principalmente mediadas por estreptococos mutans 3. O EPS são sintetizados por microrganismos (S. mutans, um dos principais contribuintes), por meio de enzimas extracelulares, tais como glucosyltransferases usando principalmente sacarose como substrato 3. Estudos de biofilmes formados nas superfícies dos dentes são particularmente desafiadora devido à sua exposição constante aos desafios ambientais associados a complexos dieta-host-microbial interações que ocorrem na cavidade oral. Melhor compreensão da dinâmica de mudança da organização estrutural e composição da matriz, fisiologia e transcriptoma / profile proteoma de biofilme células em resposta a essas interações complexas seria avançar o conhecimento atual de como biofilmes orais modular a patogenicidade. Por isso, temos desenvolvido uma caixa de ferramentas analíticas para facilitar a análise do biofilme em níveis estruturais, bioquímicos e moleculares, combinando técnicas comumente disponíveis e romance com custom-made software para análise de dados. Padrão de análise (ensaios colorimétricos, RT-qPCR e microarrays) e novas técnicas de fluorescência (para a rotulagem simultânea de bactérias e EPS) foram integrados com software específico para análise de dados para resolver a complexa natureza da pesquisa biofilme oral. A caixa de ferramentas é composto por 4 etapas distintas, mas interligadas (Figura 1): 1) Os bioensaios, 2) entrada de dados brutos, 3) Processamento de Dados, e 4) Análise de Dados. Nós usamos o nosso modelo in vitro de biofilme e específicas condições experimentais para demonstrar a utilidade ea flexibilidade da ferramenta-box. O modelo de biofilme é simples, reprodutíveis e várias réplicas de um único experimento pode ser feito simultaneamente 4, 5. Além disso, permite a avaliação temporal, inclusão de diversas espécies microbianas 5 e avaliação dos efeitos de diferentes condições experimentais (por exemplo, tratamentos 6; comparação de mutantes knockout vs cepa parental 5; carboidratos disponibilidade 7). Aqui, descrevemos dois componentes específicos da caixa de ferramentas, incluindo (i) novo software para microarray de mineração de dados / organização (MDV) e análise de imagens de fluorescência (DUOSTAT), e (ii) in situ EPS rotulagem. Nós também fornecemos um caso experimental mostrando como a caixa de ferramentas pode ajudar com biofilmes análise, os dados da organização, integração e interpretação.

Biofilmes formados nas superfícies dos dentes são altamente complexos e expostos a constante inata e exógenos desafios ambientais, que modulam sua arquitetura, fisiologia e transcriptoma. Nós desenvolvemos uma caixa de ferramentas para examinar a composição, organização estrutural e expressão gênica de biofilmes orais, que pode ser adaptado para outras áreas de pesquisa biofilme.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Biofilmes são comunidades de células microbianas altamente dinâmicas, organizadas e estruturadas, envoltas em uma matriz extracelular de densidade variável e ...

Os biofilmes formados nas superfícies dentárias são altamente complexos e estruturados. Comunidades microbianas envoltas em uma matriz extracelular, expostas a desafios ambientais constantes. O objetivo geral aqui é apresentar dois componentes específicos de uma caixa de ferramentas analítica projetada para facilitar estudos estruturais e moleculares, considerando a natureza complexa dos biofilmes orais, combinando uma nova técnica de imagem de fluorescência com um software personalizado para processamento e análise de dados.Isso é realizado primeiramente pela seleção de ensaios específicos para análise de biofilme, transcriptoma e estrutura, incluindo uma nova abordagem de imagem confocal para visualização simultânea de EPS e bactérias. O segundo passo do procedimento é coletar os dados brutos dos bioensaios. O terceiro passo é processar os dados brutos utilizando softwares específicos, incluindo o duo stat recém-desenvolvido para análise de colocalização.O passo final é analisar os dados do processo, incluindo o uso de mineração de dados de microarranjo e software de organização de microarranjos, visualizador de dados ou MDV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mo

an-analytical-tool-box-for-comprehensive-biochemical-structural

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um protocolo para análise estrutural e de composição do biofilme oral natural de aparelhos ortodônticos...

Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning

Fonte: Schlafer, S, e Frost Kristensen, M. Monitorando o pH Extracelular em Biofilmes Cruzados do Reino usando Microscopia Confocal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o cultivo de biofilmes cruzados entre Streptococcus mutans e Candida albicans sob condições semelhantes às orais para modelar interações bactéria-fúngico, possibilitando o estudo da sinergia microbiana, adesão mediada pelo glucano e virulência acidogênica na patogênese oral.

Estabelecimento de biofilmes entre reinos bacterianos-fúngicos para estudo da patogênese oral

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.

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Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, incluindo a análise de viabilidade de células bacterianas e características morfológicas. Um modelo in situ associado com técnicas de microscopia poderoso é usado para a análise do biofilme oral.

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

Os produtos naturais representam pontos de partida promissores para o desenvolvimento de novas drogas e agentes terapêuticos. No entanto, devido à alta diversidade química, encontrar novos compostos terapêuticos das plantas é uma tarefa desafiadora e demorada. Descrevemos uma abordagem simplificada para identificar moléculas antimicrobianas e antibiofilmes a partir de extratos e frações vegetais.

Abordagem Sistemática para Identificar Novas Moléculas antimicrobianas e antibiofilmes de extratos e frações de plantas para prevenir cárie dentária

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho modular BSL-2 que combina ensaios de biomassa cristal-violeta, cinética de contraste de fase em time-lapse, mapeamento confocal 3D/matricial, ultraestrutura SEM e um módulo in vivo de infecção por hamster para cultivar, quantificar, caracterizar e investigar o papel funcional do biofilme de Leptospira , possibilitando avaliação padronizada de mutantes e intervenções anti-biofilme em laboratórios.

Um Fluxo de Trabalho Modular para Análise Quantitativa, Estrutural e Funcional de Biofilmes de Leptospira

Aprenda a analisar biofilmes orais mediados por estreptococos do grupo mutans usando uma caixa de ferramentas analítica integrada com imagem confocal e software personalizado. Este método combina análise estrutural e transcriptômica para compreender a organização microbiana.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans (Vídeo) | JoVE Journal

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