Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Os biofilmes formados nas superfícies dentárias são altamente complexos e estruturados. Comunidades microbianas enredadas em uma matriz extracelular, que estão expostas a constantes desafios ambientais. O objetivo geral aqui é mostrar dois componentes específicos de uma caixa de ferramentas analítica projetada para facilitar estudos estruturais e moleculares, considerando a natureza complexa dos biofilmes orais, combinando uma nova técnica de imagem de fluorescência com software personalizado para processamento e análise de dados.

Isso é feito selecionando primeiro ensaios específicos para análise de biofilme, transcriptoma e estrutura, incluindo uma nova abordagem de imagem confocal para visualização simultânea de EPS e bactérias. A segunda etapa do procedimento é coletar os dados brutos dos bioensaios. A terceira etapa é processar os dados brutos usando um software específico, incluindo o recém-desenvolvido duo stat para análise de colocalização.

A etapa final é analisar os dados do processo, incluindo o uso de software de mineração e organização de dados de microarray microarray, visualizador de dados ou MDV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram como os patógenos orais alteram seu transcriptoma e a arquitetura dos biofilmes em resposta a interações microbianas complexas da dieta e do hospedeiro usando nossa caixa de ferramentas analítica integrada exclusivamente, fornecendo uma análise de biofilme e interpretação de dados mais abrangentes. Olá, meu nome é Michelle Kuh, professora associada do centro de biologia foral aqui no Universal of Rochester Medical Center.

Hoje, apresentamos uma caixa de ferramentas analítica para análise de biofilme. Esta caixa de ferramentas pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa de biofilme, como a forma como as células do biofilme são estruturadas, organizadas com matriz extracelular e como elas respondem a desafios ambientais complexos no nível transcriptômico. Meu nome é Jean, ela, sou bolsista de pós-doutorado no laboratório Dr.Ks.

Hoje vou demonstrar a parte de imagem da nossa caixa de ferramentas. Olá, sou Aise Klein. Sou professor assistente de pesquisa no laboratório Dr.Ks.

Hoje, apresentarei o software MDV para análise de dados de microray. Neste procedimento, discos de apetite hidroxi revestidos com saliva são usados como substitutos da superfície do dente nos quais os biofilmes são cultivados. Primeiro, adicione 2,8 mililitros de meio de cultura inoculado com mutantes S em cada poço de uma placa de 24 poços protegendo a placa da luz no corante conjugado com dextrina LOR 6 47 a cada poço até uma concentração final de um micromolar e pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar o corante no meio de cultura.

Em seguida, usando uma pinça estéril, lave os discos de hidroxiapatita revestidos com saliva estéril duas vezes em tampão AB estéril para remover qualquer excesso de saliva ou componentes salivares não ligados. Em seguida, coloque os discos verticalmente no meio de cultura suplementado com corante, garantindo que cada disco esteja totalmente submerso. Cubra a placa com papel alumínio e incube-a a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por 20 horas para permitir que os biofilmes se formem e a textura conjugada seja incorporada aos exopolissacarídeos produzidos pelas células bacterianas.

Para rotular as células bacterianas primeiro, prepare uma placa de 24 poços com 2,8 mililitros de água mili Q estéril por poço. Adicione 1,5 microlitros de corante cyto nine a cada poço até uma concentração final de um micromolar e proteja a placa da luz. Uma vez formado o biofilme, remova a placa contendo os discos do mergulho da incubadora.

Lave cada disco em uma solução de cloreto de sódio a 0,89%. Em seguida, transfira-os para a nova placa contendo o corante cyto nine. Cubra a placa com papel alumínio e incube-a por 30 minutos em temperatura ambiente.

Uma vez que as células tenham sido coradas, mergulhe, lave os biofilmes e o cloreto de sódio como antes. Em seguida, usando uma pinça, libere os biofilmes do fio em uma placa de Petri contendo cloreto de sódio. Embrulhe a placa de Petri com papel alumínio.

Os biofilmes estão agora prontos para visualização por microscopia confocal usando um microscópio confocal de varredura a laser. Digitalize cada biofilme em cinco a 10 posições selecionadas aleatoriamente e gere séries Z em cada posição. Para permitir reconstruções 3D, abra as imagens confocais e processe-as usando um software de espelho.

Esta renderização tridimensional de imagens confocais produzidas usando o programa, Amira mostra um biofilme de mutantes S formado na superfície apática usando o procedimento demonstrado. As células bacterianas e as microcolônias são visíveis em verde e estão embutidas na matriz de biofilme contendo exopolissacarídeos. Em vermelho, uma visão aproximada de uma área selecionada pode ser gerada, o que ilustra a relação estrutural específica da bactéria EPS na escala micro.

Use o programa duos stat para quantificar a quantidade de colocalização de componentes separados do biofilme, como as bactérias e os exopolissacarídeos. Primeiro, configure o caminho da estatística dupla recém-desenvolvida no MATLAB versão 5.1 e abra as pastas de imagens contendo as imagens da série Z dos dois componentes do biofilme. Em seguida, escolha dois canais que serão correlacionados e analisados.

As duas pilhas de imagens devem ter tamanhos de pixel idênticos em todas as dimensões e o mesmo número de imagens em cada pilha. Defina os limites para cada canal e siga as instruções na interface do software e insira os dados no arquivo de processamento de dados para análise. Esta figura mostra como a pilha dupla interpreta quantitativamente a relação espacial entre bactérias e DBS.

Dentro do biofilme, a pilha Duo calcula a distribuição vertical de bactérias e DPS da superfície do disco para a fase fluida, como visto aqui na linha verde para bactérias e na linha vermelha para EPS. Ele também calcula a colocalização de bactérias e DPS em toda a espessura do biofilme. Conforme mostrado na linha amarela, os dados mostram proporções mais altas de EPS do que bactérias em toda a profundidade do biofilme, e a maioria das células bacterianas está associada ao EPS, especialmente das camadas intermediárias e para cima O Duo stat com renderização 3D fornece uma compreensão aprimorada da organização estrutural e interação de bactérias e DPS em biofilmes.

Para garantir que o RNA de alta qualidade seja obtido a partir de biofilmes, recomendamos que a extração de RNA seja realizada de acordo com o protocolo específico de biofilme descrito no artigo de Curian KU publicado em 2007. Na revista, protocolos padrão de bioquímica analítica são usados para preparação de microarray de CD NA e ensaios quantitativos de PCR em tempo real. Para facilitar a análise dos grandes conjuntos de dados gerados por experimentos de microarray, projetamos um software de mineração e organização de dados, o visualizador de dados de microarray ou MDV, que está disponível online no www.oralgen.anl.gov.

Antes de enviar os dados ao MDV, realize análises estatísticas como um teste T pareado com modelo de variância aleatória usando o software de ferramenta de matriz BRB disponível online com um valor de corte P de 0,001 para comparação de classes. Neste exemplo de análise de carneiros, foram realizados biofilmes cultivados em três concentrações distintas de açúcar e quatro pontos de tempo. Comparações pareadas foram realizadas originando três arquivos BRB: condição 0,5% de sacarose mais 1% de amido versus 1% de sacarose, condição B 0,5% de sacarose mais 1% de amido versus 0,5% de sacarose e condição C 0,5% de sacarose versus 1% de sacarose.

Este painel representa o número de genes detectados como diferencialmente expressos em cada condição e ponto de tempo avaliado pela comparação de classe padrão usando a ferramenta de matriz BRB, o que resulta em um grande número de genes denominados dados brutos BRB. Para demonstração do MDV, vamos nos concentrar no ponto de tempo 30 horas usando o Excel. Converta os dados brutos BRB em arquivos de texto limitados por guias MDV.

Certifique-se de remover todas as letras que vêm com o número da guia do locus do gene, por exemplo, no nome SMU dot 1432 C.Exclua a letra C, abra MDV. Abra o menu de arquivo e escolha selecionar origem da anotação. Selecione a opção de arquivo simples quando uma caixa de diálogo aparecer.

Use os botões de navegação para escolher os arquivos que contêm anotações para ontologia de genes, número, caminho, dados de classificação funcional e nome do gene. Vá para o arquivo e importe cada um dos arquivos convertidos para o formato MDV. Cada arquivo representa uma condição experimental.

Compare os genes expressos em cada condição experimental A versus B versus C.In este exemplo, usando o recurso de diagrama de Venn. Para esta demonstração, nos concentramos em genes diferencialmente expressos que estão exclusivamente relacionados às influências da sacarose e do amido em combinação. O recurso baseado no diagrama de Venn é usado para visualizar o número de genes únicos e compartilhados expressos nessas diferentes condições e nos ajuda a identificar aqueles a serem selecionados para análise posterior.

Aqui, selecionamos apenas os genes diferencialmente expressos que são únicos na condição A e / ou B, mas não aqueles detectados em C, conforme mostrado em cinza, como mostrado aqui. O MDV reduziu muito o número total de genes a serem analisados e, ao mesmo tempo, filtrou os genes não relevantes para o caso experimental. No menu de arquivo, escolha a opção de exportação para salvar os dados.

Como arquivos limitados por guias, os arquivos podem ser abertos no Excel, onde a saída de dados pode ser organizada e convertida nas exibições gráficas desejadas. A organização dos dados no Excel permite a exibição gráfica da saída MDV. Este gráfico mostra uma visão geral da expressão diferencial de subconjuntos funcionais únicos de genes que são afetados pela combinação de amido e sacarose em estágios distintos do desenvolvimento do biofilme.

As influências no transcriptoma dos mutantes S são mais pronunciadas em 30 horas de desenvolvimento do biofilme do que em outros momentos. A saída nos ajudou a identificar com precisão subconjuntos funcionais específicos de genes que são relevantes para nossa hipótese de trabalho, considerando os efeitos temporais que facilitaram a seleção de genes e o processo de validação adicional. Após este procedimento, métodos bioquímicos e proteômicos também podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são as respostas fisiológicas e metabólicas específicas dos organismos dentro dos biofilmes.

Uma análise tão abrangente e integrada certamente ajudaria a entender melhor como os biofilmes modulam a patogenicidade na cavidade interna, um ambiente altamente dinâmico e complexo. Para mais detalhes, consulte o arquivo PDF anexado a este artigo em vídeo.