Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

O objetivo geral deste procedimento é isolar células epiteliais das vias aéreas para estudar os efeitos tóxicos da exposição à fumaça de cigarro. Isso é realizado primeiramente dissecando as traqueias de camundongo e, em seguida, digerindo-as em solução de pronase. O segundo passo do procedimento consiste em coletar as células epiteliais e propagar a cultura em meio líquido.

O terceiro passo é diferenciar os cultivos em uma interface ar-líquido. O passo final do procedimento é expor as células epiteliais à fumaça de cigarro apical na interface ar-líquido. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram uma monocamada completamente diferenciada de células epiteliais por microscopia de imunofluorescência.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da doença pulmonar obstrutiva crônica, como os efeitos da exposição à fumaça de cigarro na morfologia da CLIA e nos marcadores bioquímicos induzidos pela fumaça de cigarro relacionados à lesão celular. Inicie os preparativos para este procedimento um dia antes da dissecação, preparando os hams. Meio F 12 contendo antibióticos, hams Meio F 12 contendo antibióticos e 20%F-B-S-M-T-E-C, meio básico contendo antibióticos.

Meio MTEC com 5% de FBS, solução única de ácido retinóico e meio de proliferação MTEC de acordo com as instruções no protocolo escrito. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas que serão usadas na dissecação no dia da dissecação. Certifique-se de que a área de dissecação esteja limpa e que todas as ferramentas de dissecação estejam à mão.

Esterilize a capela de cultura de tecidos. Em seguida, trabalhando dentro da capela de cultura de tecidos, prepare uma solução de 0,15% de pronase.

Adicione 15 miligramas de pronase a 10 mililitros de meio Hams F-12 contendo antibióticos em um tubo cônico de 50 mililitros. Mantenha em gelo até o uso.

As traqueias de camundongo são dissecadas de camundongos utilizando procedimentos cirúrgicos padrão; desinfete o tubo contendo as traqueias e coloque-o na cabine de cultura de tecidos. Transfira o tecido traqueal para uma placa de Petri de 100 milímetros com meio Ham's F12 contendo antibióticos. Utilize pinças cirúrgicas estéreis para remover o tecido conjuntivo das traqueias.

Em seguida, transfira as traqueias limpas para a segunda placa de Petri de 100 milímetros contendo meio hams F12 com antibióticos. Use tesoura de dissecação para cortar as traqueias ao longo do eixo vertical e expor o lúmen.

Transfira as traqueias para o tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 mililitros de solução de pronase e coloque na geladeira para incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Por fim, prepare placas transwell revestidas com colágeno tipo um para uso. No dia seguinte, adicione 50 miligramas de colágeno, um por mililitro de ácido acético 0,02 N, e pipete um mililitro dessa solução para cada poço de uma placa de 12.

Placa de poços bem trans. Enrole a placa com filme parafilm e deixe repousar durante a noite à temperatura ambiente na capela de cultura de tecidos. No dia seguinte.

Inverta suavemente o tubo contendo as traqueias de camundongo de 10 a 12 vezes. Em seguida, deixe o conteúdo do tubo incubando por mais 30 a 60 minutos a quatro graus Celsius. No capuz de cultura de tecidos, pipete 10 mililitros de meio Hams F12 contendo antibióticos em 20% de FBS para dentro do tubo cônico contendo o tecido traqueal digerido e inverta 12 vezes.

Em seguida, pipete 10 mililitros de meio hams F 12 contendo antibióticos em 20% de FBS para cada um dos três tubos cónicos de 15 mililitros. Utilize uma pipeta de pasta estéril para transferir o tecido traqueal da solução de pronase para o primeiro dos tubos contendo o meio hams F 12 suplementado.

Coloque a solução de pronase em gelo, tampe o tubo contendo o tecido traqueal e inverta suavemente 12 vezes para misturar. Em seguida, utilizando a pipeta de pasta, transfira o tecido traqueal para o segundo tubo cônico de 15 mililitros e inverta este tubo 12 vezes. Repita o procedimento de transferência e inversão usando o último tubo cônico de 15 mililitros.

Por fim, utilize a pipeta de pasta para remover e descartar o tecido traqueal. Em seguida, retire a solução de pronase do gelo e combine os três volumes de 15 mililitros de meio Hams F12 suplementado com a solução de pronase. Centrifugue a amostra na centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.400 rotações por minuto; após a centrifugação, descarte o sobrenadante, então pipete aproximadamente de 100 a 200 microlitros da solução de DNAse I, uma solução por traqueia, sobre o pellet e ressuspenda.

Suspenda com leves batidas. Incube as células no gelo por cinco minutos. Centrifugue o tubo a 1.400 rotações por minuto durante cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.

Em seguida, pipete oito mililitros de meio MTEC contendo 10% de FBS sobre o pellet e ressuspenda a placa. Incube a suspensão celular em uma placa paria a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 95% de ar e 5% de dióxido de carbono por cinco a seis horas. Este é um passo de seleção negativa para a remoção de fibroblastos.

Após a incubação, colete a suspensão celular da placa paria e pipeteie para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, enxágue a placa duas vezes com quatro mililitros de meio MTEC contendo 10% de FBS. Transfira as duas lavagens para o tubo cônico de 50 mililitros contendo a suspensão celular.

Pipete um mililitro da suspensão celular para um tubo cônico. Reserve esta alíquota para análise de citocentrifugação e contagem de células. O tubo cônico de 50 mililitros contendo os 15 mililitros restantes da suspensão celular é centrifugado a 1.400 rotações por minuto a quatro graus Celsius durante 10 minutos.

Durante a centrifugação, remova e descarte a solução de colágeno do placa de transwell previamente preparada. Deixe a placa secar sob a capela por cinco minutos, depois lave duas vezes com PBS após a lavagem final. Aspire todo o PBS e pipete 1,5 mililitros de meio de proliferação no compartimento basal do transwell após a centrifugação.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um volume apropriado de meio de proliferação para facilitar o plaqueamento de 7,5 vezes 10 à quarta até 1 vez 10 à quinta células em 500 microlitros de suspensão por poço. Pipete 500 microlitros da suspensão celular na superfície apical do inserto de membrana de policarbonato transwell. Incube as culturas de MTEC submersas a 37 graus Celsius em um incubador umidificado contendo 95% de ar e 5% de dióxido de carbono por sete a dez dias, com trocas de meio a cada dois dias.

Meça a resistência transepitelial utilizando um intervalômetro. Quando a resistência epitelial atingir 1000 ohms por centímetro quadrado e as culturas parecerem confluente, converta para uma cultura LI removendo o meio apical.

Também substitua o meio basal pelo meio básico MTEC contendo 2% de soro novo e ácido retinóico. Incube as culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 a 14 dias para permitir a diferenciação, com trocas de meio a cada dois dias. Primeiramente, prepare a máquina de fumar de acordo com as instruções do fabricante.

Registre o peso de um filtro de pole flex não utilizado. Em seguida, coloque o filtro no suporte inline de aço inoxidável no tubo de amostragem que conduz da porta de amostragem na câmara de fumo até a bomba de fluxo constante. Conecte a unidade de amostragem ao medidor de gás utilizando um tubo de saída com um sistema de exposição de célula CS.

Exponha a face apical das culturas transwell à fumaça de cigarros convencionais proveniente de três cigarros de referência com filtro R4F. Exponha as células à fumaça de um a dois cigarros. Exponha as culturas controle ao ar ambiente por um período equivalente de exposição após a coleta de gases e ganho de peso.

No filtro de flexão da piscina, a massa total de material depositado no filtro, em miligramas, é normalizada. Para o volume total de ar amostrado, a fumaça de um a dois cigarros normalmente produz de 100 a 200 miligramas por metro cúbico de MPT. Após a exposição ao cigarro, colete as células e o meio basal para análises adicionais.

Este é um exemplo de uma monocamada saudável de células epiteliais respiratórias de camundongo coradas para marcadores nucleares de células epiteliais e marcadores C. O isolamento, proliferação e diferenciação epiteliais bem-sucedidos utilizam uma monocamada intacta com morfologia em mosaico. Os cultivos são essencialmente livres de fibroblastos.

Essas imagens de microscopia eletrônica são representativas de culturas saudáveis de MTEC e mostram a ultraestrutura dos vários tipos celulares e da morfologia de CÉLIAS. Este vídeo de imagem de células vivas mostra a morfologia ciliar saudável de culturas de MTEC. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células epiteliais traqueais de camundongo, diferenciá-las em uma interface ar-líquido e expô-las à fumaça principal do cigarro.