Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios
March 25th, 2011
Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.
O objetivo geral deste procedimento é introduzir uma maneira de estudar a integração funcional das células granulares dentadas nascidas adultas. Isso é realizado primeiro por injeção estereotáxica de retrovírus no giro dentado de camundongos adultos para rotular as células granulares dentadas recém-nascidas. A segunda etapa do procedimento é perfundir os camundongos em determinados estágios de tempo com solução de corte a frio e remover o cérebro.
A terceira etapa do procedimento é preparar fatias cerebrais agudas com um vibrato. A quarta etapa do procedimento é realizar gravações de grampos de remendo de células inteiras em células granulares dentadas recém-nascidas e estimular a camada molecular de fatias cerebrais agudas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a integração sináptica funcional dos neurônios recém-nascidos, registrando e analisando as correntes pós-sinápticas evocadas nos neurônios dos grânulos denteados recém-nascidos.
As principais vantagens desta técnica são o nivelamento retroviral de neurônios recém-nascidos no cérebro adulto e a preparação aguda do corte cerebral dos animais adultos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurogênese adulta, como a perda funcional de neurônios recém-nascidos no cérebro adulto. Prepare-se para a injeção do vírus removendo o retrovírus para o tomate de proteína fluorescente verde GFP ou proteína D fluorescente vermelha do freezer e descongelando-o no gelo Descongelado.
Dois microlitros de retrovírus por animal anestesiam um camundongo fêmea de quatro a seis semanas de idade. Teste a anestesia beliscando o poro, monte o mouse em uma moldura estereotáxica, raspe o cabelo da cabeça e limpe a pele com etanol 70%. Use um bisturi para cortar a pele e expor o crânio.
Ajuste a posição do nariz do mouse para que bgma e lambda ganhem o mesmo plano horizontal usando uma broca odontológica com uma broca de 0,6 milímetro. Faça quatro furos no crânio nas coordenadas mostradas aqui. Encha rapidamente uma seringa de ponta plana Hamilton de um microlitro com o retrovírus descongelado.
Posicione-o acima de um dos orifícios criados a menos dois milímetros bgma para injetar o retrovírus no giro denteado. Baixe a seringa a uma profundidade vertical de 2,5 milímetros. Injete 0,5 microlitros de retrovírus a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto para evitar o refluxo de fluido.
Aguarde dois minutos após cada injeção antes de retirar lentamente a seringa. Enxágue brevemente a superfície externa da ponta da seringa com PBS estéril e um aplicador para remover vestígios de sangue. Use o mesmo procedimento para injetar 0,5 microlitros de retrovírus nos outros três locais em profundidades ventrais de 2,5 ou 3,2 milímetros.
Feche a ferida com material de sutura cirúrgica estéril e retorne o animal ao seu alojamento até que os neurônios recém-nascidos atinjam a data de maturidade desejada. Após 21 dias, prepare-se para cortar o cérebro do camundongo fazendo as soluções necessárias. Resfrie a solução de corte no gelo a zero a quatro graus Celsius e borbulhe com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos.
Coloque o líquido cefalorraquidiano artificial ou LCR A em temperatura ambiente e borbulhe-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos. Após 30 minutos no gelo, configure o gelo chamado solução de corte saturada de oxigênio para perfusão cardíaca. Após anestesiar, o camundongo realiza a perfusão cardíaca.
Em seguida, remova rapidamente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução de corte e um pedaço de papel de filtro na placa de Petri. Corte o cerebelo e, em seguida, faça um corte coronal de um a dois milímetros antes dos locais de injeção para fazer uma superfície plana. Para montagem de super.
Cole o cérebro em uma plataforma vibram. Monte a plataforma na câmara de corte vibrams preenchida com solução de corte oxigenada. Abaixe a lâmina e ajuste a janela de corte no Vibram.
Comece a cortar o tecido. Corte cada fatia em duas metades ao longo da linha média. Use uma pipeta de grande diâmetro para transferir essas fatias para uma câmara de incubação contendo sala.
Temperatura Um LCR borbulhou com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Continue cortando até que a extremidade anterior do hipocampo esteja visível. Incube as fatias borbulhando continuamente no banho-maria a 32 graus Celsius por 30 a 60 minutos.
Retorne a câmara de incubação à temperatura da borda durante a gravação. As fatias agora estão prontas para gravação. Comece perfundindo a câmara de registro com 32 a 34 graus Celsius saturado de oxigênio A CSF a cerca de dois mililitros por minuto.
Use um grande perpet de javali para transferir uma fatia para a câmara de gravação. Coloque um fio de platina em forma de U com cordas de náilon em cima da fatia para segurá-la sob baixa ampliação. Identifique a camada molecular do giro denteado.
Em seguida, abaixe o eletrodo de estimulação na camada molecular do giro denteado. Sob alta. Identifique as células granulares dentadas recém-nascidas na zona subgranular ou camada granular pela expressão da marcação da proteína fluorescente verde ou vermelha.
Localize neurônios recém-nascidos que expressam tomate GFP ou D alternando entre filtros DIC e fluorescentes. Selecione uma célula com fluorescência relativamente brilhante e um corpo celular saudável para gravação de patch clamp de célula inteira. Insira uma micropipeta de vidro com uma resistência de ponta de três a seis mega ohms preenchida com a solução interna apropriada em um suporte de micropipeta no ampcabeça do amplificador stage sob a objetiva de alta ampliação do microscópio.
Abaixe a micropipeta por um micromanipulador até a célula granular dentada selecionada e forme um adesivo de célula inteira. Injete uma série de correntes no modo de pinça de corrente e registre as propriedades de disparo do neurônio recém-nascido. Aplique pulso único ou pulso elétrico emparelhado através do eletrodo de estimulação e registre as correntes pós-sinápticas evocadas.
Se não houver resposta pós-sináptica, mova o eletrodo de estimulação para outra posição na camada molecular e tente registrar as correntes pós-sinápticas evocadas a partir do novo local do estímulo. Após terminar o experimento, use clamp fit para medir a amplitude das respostas pós-sinápticas evocadas dos neurônios recém-nascidos. Esta figura mostra a expressão de GFP em neurônios recém-nascidos no giro dentado de um camundongo adulto 21 dias após a injeção de GFP Retrovirus.
Observe que os neurônios recém-nascidos são facilmente visualizados e que tanto os dendritos quanto os axônios são rotulados de forma robusta. Os dendritos são os processos que se estendem do soma até a camada molecular do giro denteado, e os axônios também são visíveis na área de hilos e ca três. Esta figura mostra gravações de pinça de corrente de célula inteira de uma célula granular dentada recém-nascida 21 dias após a injeção do retrovírus P-U-X-G-F-P em um camundongo adulto.
O traço superior mostra potenciais de ação provocados pela injeção de corrente. Esta figura mostra as correntes pós-sinápticas provocadas em uma célula granular dentada recém-nascida 21 dias após a injeção do vírus. Estimulando na camada molecular.
A existência da resposta pós-sináptica mostra que o neurônio recém-nascido já se integrou aos circuitos neurais existentes e está recebendo entradas sinápticas de otorrinolaringologistas de várias origens após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo da neurogênese adulta explorarem a integração funcional dos neurônios recém-nascidos no cérebro adulto.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para estudar a integração de células granuladas dentadas recém-nascidas em camundongos adultos usando um retrovírus engenheiro. A técnica envolve gravações eletrofisiológicas para avaliar a integração funcional dessas neurônios.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neurogênese
- Eletrofisiologia
Fundamentos
- As células granuladas dentadas recém-nascidas desempenham um papel crucial na neurogênese adulta.
- Entender sua integração é vital para obter insights sobre a função cerebral.
- Técnicas eletrofisiológicas podem revelar propriedades funcionais desses neurônios.
- A marcação retroviral permite o direcionamento específico de neurônios recém-nascidos.
Propósito do Estudo
- Apresentar um método para estudar a integração funcional de células granuladas dentadas nascidas na idade adulta.
- Investigar a integração sináptica de neurônios recém-nascidos no cérebro adulto.
- Abordar questões sobre a perda funcional de neurônios recém-nascidos.
Métodos Utilizados
- Injeção estereotáxica de retrovírus no giro dentado de camundongos adultos.
- Preparação de fatias cerebrais agudas para gravações eletrofisiológicas.
- Gravações de clamp de patch em célula inteira em células granuladas dentadas recém-nascidas marcadas.
- Análise de correntes postssinápticas evocada para avaliar a integração funcional.
Principais Resultados
- Marcação bem-sucedida de células granuladas dentadas recém-nascidas usando vetores retrovirais.
- Demonstração de integração sináptica funcional através de gravações eletrofisiológicas.
- Identificação de propriedades-chave de neurônios recém-nascidos no cérebro adulto.
- Insights sobre o papel da neurogênese adulta na função cerebral.
Conclusões
- O método descrito fornece uma abordagem robusta para estudar a neurogênese adulta.
- Técnicas eletrofisiológicas são eficazes para avaliar a integração de neurônios recém-nascidos.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão das implicações funcionais da neurogênese no cérebro adulto.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Functional integration of adult-born neurons in the hippocampus is a critical inflection point for understanding disease-relevant neurogenesis and circuit remodeling. High-resolution analysis of synaptic incorporation supports predictive confidence in target validation for CNS drug discovery. This workflow enables mechanistic de-risking of neuronal maturation and connectivity, informing translational strategies for neuropsychiatric and neurodegenerative portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal integration mechanisms relevant to disease etiology.
- Supports biological de-risking by clarifying synaptic maturation timelines in adult neurogenesis.
- Provides functional readouts for target validation in CNS-focused programs.
Screening & Assay Development
- Establishes validated fluorescent labeling and electrophysiological readouts for downstream screening.
- Facilitates reproducible quantification of synaptic integration in disease-relevant models.
- Prepares robust assay systems for compound evaluation targeting neurogenesis pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional integration endpoints with translational biomarker development in CNS disorders.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of neurogenic interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of neurogenesis-modulating candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, functional endpoints for adult-born neuron integration in the hippocampus.
- Discovery Biology: Delivers mechanistic insights into synaptic incorporation and circuit formation of adult-born neurons.
- Screening: Supplies standardized, reproducible electrophysiological and imaging outputs for assay development.
- Analytics: Enables quantitative measurement of postsynaptic currents and action potentials for condition comparison.
- Translational Research: Connects synaptic integration metrics to disease-relevant functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for evaluating neurogenesis across diverse CNS models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neurogenesis-targeted discovery and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes neuron labeling and functional assessment for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation in CNS therapeutic pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurogenesis-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic injection, retroviral vector handling, and patch-clamp electrophysiology.
- Demands access to fluorescence microscopy and electrophysiological recording infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of labeling and recording protocols for reproducibility.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require protocol optimization.
- Practical limitations include the need for precise timing and technical skill in acute slice preparation.
