Name: Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a integração funcional de neurônios recém-nascidos no hipocampo de camundongos adultos usando marcação retroviral e eletrofisiologia de patch-clamp. Este método permite analisar a maturação sináptica in vivo.

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Este trabalho foi financiado pelo NINDS e American Heart Association para S.Ge. Esta abordagem foi originalmente criado e desenvolvido pelo autor no laboratório do Dr. Hongjun Song na Johns Hopkins University. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Canção Hongjun por sua orientação e apoio.

1. Injeção de vírus Alto título de retrovírus engenharia (1 × 10 9 unidade / ml) é produzida por co-transfecção de vetores retrovirais em células e VSVG HEK293T, seguido por ultracentrifugação do sobrenadante viral. Para as fontes e métodos de produção, ver a demonstração JOVE excelente (3). Nota: adultos jovens (4-6 semanas de idade) do sexo feminino camundongos C57BL / 6 (Charles River) estão alojados em condições normais. Todos os procedimentos seguem o Manual do Conselho Nacional de Pesquisa para o cuidado e uso de animais de laboratório sob um protocolo aprovado pelo Stony Brook University IACUC. <ol><li> 2ul degelo dos retrovírus congeladas por animal no gelo. </li><li> Anestesiar (100 mg + 10 quetamina xilazina mcg por grama de peso corporal) e montar o animal em uma estrutura estereotáxica (Steolting). Remover o cabelo na cabeça e limpe a pele com álcool 70%. </li><li> Expor o crânio e faça quatro furos rasos usando uma broca de dentista (0,6 mm broca) na seguintes coordenadas: <ul><li> anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = mm -2 de bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = mm -3 de bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Montar um Hamilton 1μl, flat ponta da seringa e injetar 0,5 mL por local de retrovírus em uma taxa de 0,25 mL / min no giro denteado. (Veja as coordenadas acima de profundidade ventral.) Pause 2 minutos após cada injecção antes de retirar a seringa lentamente para evitar o refluxo do fluido. Entre as injeções, brevemente lavar a superfície externa da ponta da seringa com PBS estéril e um aplicador para remover vestígios de sangue. </li><li> Fechar a ferida com material de sutura cirúrgica estéril (tipo P-1; Tamanho 6-0) eo retorno do animal às condições de alojamento padrão até os estágios de tempo desejado após a injeção. </li></ol> 2. Preparação fatia Para obter alta qualidade fatias aguda de camundongos adultos, usamos uma solução de corte modificada para a preparação fatia (veja abaixo). <ol><li> Pré-chill solução de corte de 0-4 ° C no gelo e bolhas com 95% de O 2 -5% CO 2 por pelo menos 30 minutos. </li><li> Anestesiar e transcardially perfundir um animal com gelado solução saturada de oxigênio de corte. </li><li> Remover rapidamente o cérebro em uma placa de Petri com papel-filtro pré-umedecido com frio, solução oxigenada de corte. Cortar o cerebelo e uma fatia superfície de montagem, pelo menos, um milímetro anterior para as coordenadas de injeção (visível). Cola do cérebro em um estágio vibrotome e montá-la na câmara de corte cheio de frio e oxigenado solução de corte. </li><li> Prepare as fatias coronal ou horizontal (300-350μm) e transferi-las com uma pipeta de grande calibre a uma câmara de incubação contendo temperatura ambiente ACSF aeradas com 95% O 2 / 5% CO 2. </li><li> Incubar as fatias, borbulhando de forma contínua, a 32 ° C por 30-60 minutos. Retorno da câmara à temperatura ambiente para a duração da gravação. </li></ol> 3. Experimentos eletrofisiológicas <ol><li> Fatias são transferidos para a câmara de gravação que é continuamente perfundidos com oxigênio saturado ACSF em 32 ° C - 34 ° C. </li><li> Um eletrodo de estimulação bipolar de tungstênio é colocado na camada molecular do giro denteado utilizando uma objetiva de microscópio de baixa ampliação (10X). </li><li> PED recém-nascido na zona sub-granular / camada de células granulares são identificados pela expressão de GFP ou dTomato. De célula inteira de gravação patchclamp é realizada em neurônios recém-nascidos sob alta ampliação (40X). </li><li> Propriedades de queima das células gravadas são obtidas por injeção de uma série de correntes sob clamp de corrente de modo. </li><li> Estímulos elétricos são entregues pelo eletrodo de estimulação através de um isolador de estimulação controlado pelo software de gravação, e evocou as correntes pós-sinápticos no PED recém-nascidos são registrados. </li></ol> 4. Análise de Dados Amplitudes de respostas evocadas pós-sinápticos são analisados ​​em diferentes estágios de desenvolvimento do adulto-nascido neurônios. 5. Resultados representante Usando o protocolo acima, GFP expressão em recém-nascidos neurônios do giro denteado semelhante à Figura 1 é comum. Note-se que os neurônios recém-nascidos são facilmente visualizadas e ambos dendritos e axônios são fortemente marcadas. Expressão em thin axônios DGC e pequenas espinhas depende da qualidade e de título do vírus, o promotor utilizado ea duração da expressão em vivo. Em nossas mãos, as células recém-nascido e sub-celular organelas são normalmente visíveis dentro de poucos dias após a injeção, e expressão da coluna pode ser rastreada desde os primeiros estágios de desenvolvimento. Wburaco células gravações dos neurônios recém-nascidos em estágios diferentes de tempo permitem o estudo das propriedades únicas células recém-nascido, por exemplo, potenciais de ação (Figura 2a), bem como o processo de integração sináptica em circuitos neurais existentes durante a maturação (Figura 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 imagem 2-fótons confocal de neurônios recém-nascido em uma seção de giro horizontal denteado de um rato adulto. Células verdes são 21dpi (dias pós-injeção) expressando GFP-PED recém-nascido rotulados com PUX-GFP retrovírus. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 a, b) Ação potencial de disparo propriedades de um recém-nascido DGC aos 21 dpi.) Representante evocado correntes excitatórias pós-sináptico (EPSCs) gravado em um recém-nascido DGC aos 21 dpi.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neurogênese contínua no hipocampo do cérebro de mamíferos adultos oferece um sistema único modelo experimental para estudar o desenvolvimento e integração neuronal no cérebro maduro. O protocolo aqui apresentado combina rotulagem retroviral e métodos eletrofisiológicos para estudar a integração de recém-nascidos neurônios granulares denteado no cérebro de ratos adultos. Para garantir que seus experimentos forem bem sucedidos, recomendamos o seguinte durante etapas críticas do processo: Para evitar a infecção e inflamação indesejável, todas as ferramentas devem ser esterilizados (em autoclave, qualquer tipo de esterilizador, ou etanol 70%) antes da cirurgia. Use PBS estéril para lavar a ponta da agulha da seringa antes da injeção. Para injecção de vírus, os animais devem ser bem montado no dispositivo estereotáxico e fontes de movimentos desnecessários devem ser minimizados durante a injeção. Certifique-se a cabeça está bem fixo e firme, e ajustar a posição do nariz do mouse para nível bregma e lambda antes de coordenadas de injeção de cálculo. Extrato de vírus para dentro da seringa rapidamente para minimizar a exposição a temperaturas quarto - retrovírus são particularmente sensíveis à temperatura. Injetar o vírus lentamente na dose recomendada para minimizar os danos de pressão. Usando o recomendado seringa de ponta chata (vs. ponta chanfrada comum) irá garantir uma uniformemente distribuído área infecção giro denteado. Antes de preparar fatias, o corte de solução e incubar ACSF devem ser aeradas com 95% O CO 2 -5 2% para pelo menos 30 minutos para permitir que o oxigênio para saturar as soluções. Os animais devem ser perfundidos com rapidez e tecidos mantidos em frio, solução saturada de oxigênio para a melhor qualidade fatia. Para a gravação, aumente a intensidade do estímulo progressivamente até que haja uma resposta pós-sináptica. Mudar o local do eletrodo de estimulação dentro da camada molecular do giro denteado, se necessário. Em resumo, a abordagem recomendada oferece uma maneira de explorar as propriedades distintas e possíveis papéis funcionais do adulto-nascido neurônios durante a fase inicial de integração em circuitos, ativo maduro.

<ul><li> Corte de solução (em mM): 110 cloreto de colina, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 dextrose, 1,3 de ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, ácido 5,0 cinurênico. </li><li> Fluido cérebro-espinhal artificial (ACSF, em mM): NaCl 125,0, 25,0 NaHCO 3, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 ascorbato de sódio, 0,6 piruvato de sódio, 10 dextrose. </li><li> Solução interna para toda célula patchclamp (em mM): 120 gluconato de potássio, KCl 15, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA HEPES, 10.0, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 de fosfato (pH 7,4, 300 mOsm). </li></ul>

estudar a integração da adult-nascido neurônios

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogênese ocorre em cérebros de mamíferos adultos na zona sub-ventricular (SVZ) do ventrículo lateral e na zona sub-granular (SGZ) do giro denteado do hipocampo durante toda a vida. Relatórios anteriores têm mostrado que a neurogênese do hipocampo adulto está associada a diversas doenças cerebrais, incluindo a epilepsia, esquizofrenia, depressão e ansiedade (1). Decifrando o processo de integração neurônio normal e aberrante adulto-nascido pode lançar luz sobre a etiologia destas doenças e informar o desenvolvimento de novas terapias. SGZ neurogênese adulta espelhos embrionário e pós-natal o desenvolvimento neuronal, incluindo as etapas de especificação de destino, migração, integração sináptica, e maturação. No entanto, a integração ocorre ao longo de um prolongado, período de 6 semanas. Entrada sináptica inicial para adultos-nascido SGZ células granulares denteado (PED) é GABAérgica, seguido da entrada glutamatérgica menos 14 dias (2). Os fatores específicos que regulam a formação de circuito de adulto-nascido neurônios no giro dentado são actualmente desconhecidas. Nosso laboratório utiliza uma réplica deficiente do vetor retroviral com base no vírus da leucemia murina Moloney para entregar proteínas fluorescentes e hipótese de genes reguladores a essas células a proliferar. Esta técnica fornece viral elevada especificidade e resolução para a análise da data de nascimento de células, a linhagem, morfologia e sinaptogênese. A experiência típica muitas vezes emprega dois ou três vírus contendo rótulo único, transgene, e elementos de promotor para uma única célula de análise de um processo de desenvolvimento desejado in vivo. O protocolo a seguir descreve um método para analisar a integração funcional dos neurônios recém-nascido através de um único verde (GFP) ou vermelho (dTomato) retrovírus proteína fluorescente e patch-clamp eletrofisiologia.

Uma maneira de estudar a integração de recém-nascidos células granulares denteado em animais adultos é descrito. Esta técnica utiliza um retrovírus engenharia para rotular neurônios recém-nascidos, seguido de gravações eletrofisiológicas para determinar a integração funcional vivo.

Estudar a Integração da Adult-nascido Neurônios

A neurogênese ocorre em cérebros de mamíferos adultos na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral e na zona subgranular (SGZ) do ...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma maneira de estudar a integração funcional das células granulares do giro denteado recém-nascidas em adultos. Isso é realizado primeiramente pela injeção estereotáxica de retrovírus no giro denteado de camundongos adultos, a fim de marcar as células granulares do giro denteado recém-nascidas. O segundo passo do procedimento consiste em perfundir os camundongos em determinados estágios temporais com solução de corte fria e remover o cérebro.O terceiro passo do procedimento é preparar fatias cerebrais agudas com um vibrátomo. O quarto passo do procedimento é realizar gravações de patch clamp em células inteiras em novas células granulares do giro denteado e estimular a camada molecular de fatias cerebrais agudas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a integração sináptica funcional de novos neurônios por meio da gravação e análise de correntes pós-sinápticas evocadas em novos neurônios granulares do giro denteado.As principais vantagens desta técnica são a marcação retroviral de neurônios recém-formados no cérebro adulto e o preparo agudo de cortes cerebrais a partir de animais adultos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurogênese adulta, como a perda funcional de neurônios recém-formados no cérebro adulto. Prepare-se para a injeção viral removendo o retrovírus para a proteína verde fluorescente GFP ou para a proteína vermelha fluorescente DsRed do congelador e descongele-o no gelo Descongele.Duas microlitros de retrovírus por animal anestesiam um camundongo fêmea de quatro a seis semanas de idade. Teste a anestesia pinçando o dedo, posicione o camundongo em um estereotáxico, rape os pelos da cabeça e limpe a pele com etanol 70%. Use um bisturi para cortar a pele e expor o crânio.Ajuste a posição do nariz do camundongo para que bregma e lambda fiquem no mesmo plano horizontal, utilizando uma broca dentária com ponteira de 0,6 milímetro. Faça quatro furos no crânio nas coordenadas mostradas aqui. Encha rapidamente uma seringa Hamilton de ponta plana de um microlitro com o retrovírus descongelado.Posicione-o acima de um dos orifícios criados a dois milímetros negativos bgma para injetar o retrovírus no giro denteado. Abaixe a seringa até uma profundidade vertical de 2,5 milímetros. Injete 0,5 microlitros de retrovírus a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto para evitar refluxo de fluido.Aguarde dois minutos após cada injeção antes de retirar lentamente a seringa. Enxágue brevemente a superfície externa da ponta da seringa com PBS estéril e um aplicador para remover vestígios de sangue. Utilize o mesmo procedimento para injetar 0,5 microlitros de retrovírus nos outros três locais, em profundidades ventrais de 2,5 ou 3,2 milímetros.Fecher o ferimento com material cirúrgico estéril e devolver o animal ao seu alojamento até que os neurônios recém-formados atinjam a data desejada de maturidade. Após decorridos 21 dias, preparar-se para fatiar o cérebro do camundongo preparando as soluções necessárias. Resfriar a solução de corte em gelo a zero a quatro graus Celsius e borbulhá-la com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos.Coloque o fluido cerebral espinhal artificial ou A CSF em temperatura ambiente e borbulhe com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos. Após 30 minutos em gelo, prepare a solução de corte chamada de gelo com oxigênio saturado para perfusão cardíaca. Após anestesiar o camundongo, realize a perfusão cardíaca.Em seguida, remova rapidamente o cérebro e coloque-o em uma placa de Petri contendo solução de corte e um pedaço de papel de filtro dentro da placa. Remova o cerebelo e, então, faça um corte coronal um a dois milímetros anterior aos locais de injeção para obter uma superfície plana. Para montagem superior.Cole o cérebro em uma plataforma de vibram. Monte a plataforma na câmara de corte do vibram, preenchida com solução de corte oxigenada. Abaixe a lâmina e defina a janela de corte no Vibram.Inicie o corte do tecido. Corte cada fatia ao meio ao longo da linha média. Use uma pipeta de grande diâmetro para transferir essas fatias para uma câmara de incubação contendo ambiente ambiente.Temperatura A LCR borbulhado com 95% oxigênio e 5% dióxido de carbono. Continue cortando até que a extremidade anterior do hipocampo fique visível. Incube os cortes borbulhando continuamente no banho de água a 32 graus Celsius por 30 a 60 minutos.Retorne a câmara de incubação à temperatura da borda pelo tempo da gravação. Os cortes estão agora prontos para gravação. Comece perfundindo a câmara de gravação com A CSF saturada com oxigênio a 32 a 34 graus Celsius a cerca de dois mililitros por minuto.Use um bast&atilde;o grande para transferir uma fatia para a c&acirc;mara de registro. Coloque um fio de platina em forma de U com cord&otilde;es de n&aacute;ilon sobre a fatia para mant&ecirc;-la fixa sob baixa amplia&ccedil;&atilde;o. Identifique a camada molecular do giro denteado.Em seguida, abaixe o eletrodo de estimulação até a camada molecular do giro denteado. Em alta. Identifique as células granulares dentadas recém-formadas na zona subgranular ou na camada granular pela expressão da proteína fluorescente verde ou vermelha marcadora.Localize neurônios recém-formados que expressam GFP ou D tomato alternando entre os filtros DIC e de fluorescência. Selecione uma célula com fluorescência relativamente intensa e um corpo celular saudável para gravação por patch clamp de célula inteira. Insira uma micropipeta de vidro com resistência de ponta entre três e seis mega ohms, preenchida com a solução interna apropriada, em um suporte de micropipeta no estágio da cabeça do amplificador, sob o objetivo de alta magnificação do microscópio.Abaixe a micropipeta por meio de um micromanipulador até a célula granular dentata selecionada e forme um selo de célula inteira. Injete uma série de correntes no modo de fixação de corrente e registre as propriedades de disparo do neurônio recém-nascido. Aplique um pulso único ou pulsos emparelhados de estímulo elétrico por meio do eletrodo de estimulação e registre as correntes pós-sinápticas evocadas.Se não houver resposta pós-sináptica, mova o eletrodo de estimulação para outra posição na camada molecular e tente registrar as correntes pós-sinápticas evocadas a partir do novo local de estímulo. Após concluir o experimento, utilize o ajuste por clamp para medir a amplitude das respostas pós-sinápticas evocadas nos neurônios recém-formados. Esta figura mostra a expressão de GFP em neurônios recém-formados no giro denteado de um camundongo adulto 21 dias após a injeção do Retrovírus GFP.Observe que os neurônios recém-formados são facilmente visualizados e que tanto os dendritos quanto os axônios são rotulados de forma robusta. Os dendritos são os prolongamentos que se estendem do soma para a camada molecular do giro denteado, e os axônios também são visíveis nos hilotos e na região CA3. Esta figura mostra gravações de fixação de corrente em célula inteira de um novo neurônio granular do giro denteado, 21 dias após a injeção do retrovírus P-U-X-G-F-P em um camundongo adulto.O traço superior mostra potenciais de ação provocados pela injeção de corrente. Esta figura mostra correntes pós-sinápticas provocadas em uma célula granular do giro denteado de recém-nascido 21 dias após a injeção do vírus. Por meio da estimulação na camada molecular.A existência da resposta pós-sináptica mostra que o neurônio recém-nascido já se integrou aos circuitos neurais existentes e está recebendo entradas sinápticas do ENT de diversas origens após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que os pesquisadores na área da neurogênese adulta explorassem a integração funcional de neurônios recém-nascidos no cérebro adulto.

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Research

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Neuroscience

Neurociência

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagens ao vivo seguidas de rastreamento de célula única para monitorar a biologia celular e a progressão da linhagem de várias populações neurais. J. Vis. exp. (2017) O O vídeo demonstra o processo de preparação, imagem e rastreamento de células-tronco neurais adultas em tempo real para estudar comportamentos celulares, incluindo divisão e diferenciação.

 Imagens ao vivo e rastreamento de célula única para monitorar a linhagem neural em células-tronco neurais adultas

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Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

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Desafio jovens neurônios em novas regiões do cérebro pode revelar importantes insights sobre como o ambiente esculpe, maturação e destino neuronal. Este protocolo descreve um procedimento para colheita precursores interneurônio de regiões específicas do cérebro e transplantá-las de qualquer homotopically ou heterotopically para o cérebro dos filhotes pós-natal.

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O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

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Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

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Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

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