Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

O objetivo geral deste procedimento é analisar de forma eficiente, econômica e com quantidade mínima de material inicial a expressão de micro-RNAs, combinando a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa multiplex e uma plataforma microfluídica. O processo começa com a concentração do RNA extraído, seguido pela transcrição reversa multiplex e pré-amplificação multiplex. O próximo passo é purificar e remover os primers em excesso.

Por fim, a expressão de microRNA em modo singleplex é analisada utilizando uma plataforma microfluídica. O resultado são níveis precisos e altamente reprodutíveis de expressão de microRNA entre as amostras de interesse. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a etapa adicional de purificação após a amplificação pré-EMP melhora a precisão e reprodutibilidade do método multiplex de Q-R-T-P-C-R.

Inicie com RNA extraído de soro. Utilizando um kit de purificação de RNA ou um método de RNA baseado em fenol-clorofórmio a partir de tecido homogeneizado, como triol, todas as extrações devem ser seguidas por uma etapa de lavagem, e todo o armazenamento deve ser feito a menos 80 graus Celsius. Concentre a solução de RNA.

Se iniciar com uma quantidade limitada de amostra, como a partir de soro em primeiro lugar, insira um reservatório de amostra MicroCon em um vial e, em seguida, pipete a solução de RNA para dentro do reservatório, tomando muito cuidado para não tocar a membrana com a ponteira da pipeta. Agora, posicione o vial e o filtro na centrífuga com a faixa de retenção voltada para o rotor e realize a centrifugação por cerca de três horas. Após três horas, o RNA estará completamente concentrado na membrana para a eluição do RNA.

Adicione uma quantidade desejada de água livre de RNAses à membrana, inverta o reservatório e coloque-o em um novo tubo. Em seguida, centrifugue por três minutos a quatro graus Celsius com velocidade máxima de 3000 ×g. Armazene o RNA concentrado a menos 80 graus Celsius até o uso. Após realizar uma reação de RT no RNA utilizando iniciadores reversos em alça xpl, seguida de 12 a 18 ciclos de PCR, os microRNAs são representados por cadeias de CD NA.

Isso é chamado de produto pré-PCR. Referindo-se ao QPCR seguinte. O produto pré-PCR precisa ser purificado em um gel de poliacrilamida a 10%, ao lado de uma escada de DNA de 10 pares de bases; carregue cada poço com 5,5 microlitros de corante laranja G a seis vezes, combinado com 27,5 microlitros do produto pré-PCR.

Execute o gel a 150 volts por 55 a 60 minutos. O azul de romofenol corre nesse gel na região de 20 pares de bases. Após a eletroforese, manche o gel com ouro ciber por 25 minutos, sem exposição à luz e em agitador a partir do gel manchado.

Recorte a faixa do produto pré-PCR de 60 a 80 pares de bases e transfira o bloco de gel para tubos etiquetados. Se a concentração do produto for baixa, ela pode não ser visível, mas ainda estará no gel. Agora, triture a faixa de gel utilizando centrifugação com tubo dentro de tubo e adicione 300 microlitros de tampão TEN.

Incube a mistura de gel tampão por quatro horas a 37 graus Celsius com agitação. Após quatro horas, transfira o fluido para um novo tubo e adicione mais 300 microlitros de tampão TEN. Incube esta mistura durante a noite a quatro graus Celsius com agitação.

No dia seguinte, transfira novamente o conteúdo do tubo e prossiga com uma precipitação com etanol do produto pré-PCR. Quando um chip é aberto a partir de sua embalagem, ele deve ser preparado em até 24 horas e, em seguida, carregado em até 60 minutos após o preparo. Inicie o preparo do arranjo injetando 150 microlitros de fluido de linha de controle em cada um dos acumuladores do chip.

Tenha cuidado para não derramar nenhum fluido sobre o chip ou as entradas, pois o chip se tornará inutilizável. Em seguida, coloque o chip no circuito fluidico integrado ou no controlador IFC e execute o script de escorva do controlador. Assim que o programa iniciar, comece a preparar as amostras.

Inicie preparando a mistura da amostra de pres. Combine tack man, master mix universal e reagentes de carregamento. Em seguida, utilizando o formato de carregamento de 96 poços, misture 2,25 microlitros de cada amostra com 2,75 microlitros da mistura de pres para coletar o fluido carregado. Vortex brevemente e centrifugue rapidamente a placa a quatro graus Celsius.

A placa de amostra está agora preparada. Agora, utilize uma nova placa de 96 poços para preparar concentrações 13 x da mistura de ensaio. Isso é feito misturando um iniciador universal, um iniciador direto e uma sonda específica do gene tac man por poço.

As concentrações de X são de um micromolar para o iniciador universal e direto e de 0,2 micromolar para a sonda TaqMan. Em seguida, adicione quantidade suficiente de Tween para obter uma concentração final de 0,25% de Tween em um volume final por poço de cinco microlitros. Misture bem, evitando bolhas, e centrifugue brevemente a placa para recolher o fluido.

Esta é a placa do ensaio. Inicie a Q-R-T-P-C-R 96.96 carregando o chip. Primeiro carregue as amostras e depois os ensaios, com volume final de cinco microlitros por entrada na IFC.

Em segundo lugar, execute o script de mistura de carga para carregar as amostras e ensaios no chip. Quando o script for concluído, retire cuidadosamente o filme protetor do chip carregado e remova quaisquer partículas de poeira ou detritos da superfície do chip utilizando fita adesiva. Agora, configure o programa de amplificação do sistema bio.

Carregue o chip no sistema e execute o programa. Os resultados podem ser analisados com o software fluid dime para gerar curvas de amplificação, mapas térmicos completos do chip e valores de CT para cada poço, utilizando produtos pré-PCR purificados por separação por tamanho em géis nativos de poliacrilamida, DGCR8 selvagem e mutante nulo de ER.

O RNA foi preparado em comparação com protocolos anteriores. Mais microRNAs e uma redução de sinais falsos positivos ocorrem em ambos os backgrounds nulos para DGCR oito e nulos para ER, graças à etapa de purificação. Além disso, a abordagem modificada de QR TPCR R permite a categorização adequada de pequenos RNAs independentes de D gcr oito e dependentes de dicer, raros.

Aqui, 48 amostras de cera de pacientes e controles foram analisadas quanto à alteração na expressão de 384 microRNAs diferentes. Os dados foram normalizados para cada amostra subtraindo-se a mediana correspondente, sem o uso de controle de adição. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a Q-R-T-P-C-R multiplex em uma plataforma flu line pode ser usada para perfilar simultaneamente centenas de micronase em diversas amostras, mesmo com quantidade inicial muito limitada de RNA.