Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

O objetivo geral deste procedimento é traçar o perfil da expressão de micro RNA de forma eficiente, barata e com material de partida mínimo, combinando RTPC quantitativo multiplex com uma plataforma microfluídica. Isso começa com a concentração do RNA extraído, seguido pela transcrição reversa multiplex e pré-amplificação multiplex. O próximo passo é purificar o excesso de primers.

Finalmente, a expressão de micro RNA singleplex é perfilada usando uma plataforma microfluídica. O resultado são níveis de expressão de micro RNA precisos e altamente reprodutíveis em amostras de interesse. A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes é que a etapa de purificação adicional após a amplificação pré-EMP melhora a precisão e a reprodutibilidade do método multiplex Q-R-T-P-C-R.

Comece com o RNA que foi extraído do soro. Usando um kit de purificação de RNA ou método de RNA baseado em clorofórmio de fenol de tecido homogeneizado como o triol, todas as extrações devem ser seguidas com uma etapa de lavagem e todo o armazenamento é feito a 80 graus Celsius negativos. Concentrar a solução de ARN.

Se começar com uma quantidade limitada de amostra, como do soro primeiro, insira um reservatório de amostra MicroCon em um frasco e, em seguida, pipete a solução de RNA no reservatório, tomando muito cuidado para não tocar na membrana com a ponta da pipeta. Agora posicione o frasco e o filtro na centrífuga com a faixa de rachadura voltada para o rotor e deixe a centrifugação funcionar por cerca de três horas. Após três horas, o RNA estará totalmente concentrado na membrana para eluir o RNA.

Adicione uma quantidade desejada de água livre de RNAs à membrana, inverta o reservatório e coloque em um novo frasco. Em seguida, gire por três minutos a quatro graus Celsius com no máximo 3000 vezes G.Store o RNA concentrado a menos 80 graus Celsius até que seja necessário Depois de realizar uma reação RT no RNA usando primers de alça de haste reversa xpl, seguida por 12 a 18 rodadas de ciclos de PCR. Os microRNAs são representados por fitas de CD NA.

Isso é chamado de produto pré-PCR. Referindo-se ao próximo QPCR. O produto pré-PCR precisa ser purificado em um gel de poliacrilamida a 10% ao lado de uma escada de DNA emparelhada de 10 bases carrega cada pista com 5,5 microlitros de seis x G laranja combinados com 27,5 microlitros de produto pré-PCR.

Execute o gel a 150 volts por 55 a 60 minutos. O azul de fenol Romo funciona neste gel na região de 20 pares de bases. Depois que o gel escorrer, manche-o com cyber gold por 25 minutos, sem exposição à luz e em um shaker do gel manchado.

Corte a banda do produto pré-PCR de 60 a 80 pares de bases e transfira o bloco de gel para os tubos rotulados. Se a concentração do produto for baixa, pode não ser visível, mas ainda estará no gel. Agora esmague a banda de gel usando tubo em centrifugação de tubo e adicione 300 microlitros de tampão TEN.

Incube a mistura de gel tampão por quatro horas a 37 graus Celsius com agitação. Após quatro horas, transfira o fluido para um novo tubo e adicione mais 300 microlitros de tampão RTE. Incube esta mistura durante a noite a quatro graus Celsius com agitação.

No dia seguinte, transfira novamente o conteúdo do tubo e prossiga com uma precipitação de etanol do produto pré-PCR. Quando um chip é aberto de sua embalagem, ele deve ser preparado dentro de 24 horas e, em seguida, carregado dentro de 60 minutos após o primer. Comece a preparar a matriz injetando 150 microlitros de fluido da linha de controle em cada um dos acumuladores do chip.

Tenha cuidado para não derramar nenhum fluido no chip ou nas entradas, ou o chip ficará inutilizável. Em seguida, coloque o chip no circuito fluídico integrado ou no controlador IFC e execute o script de escorva do controlador. Assim que o programa começar, comece a preparar as amostras.

Comece preparando a amostra de pré-produção Misture uma combinação de tack man, master mix universal e reagentes de carregamento. Em seguida, usando o formato de carregamento de 96 poços, combine 2,25 microlitros de cada amostra com 2,75 microlitros de mistura de pré-amostra para coletar o fluido carregado. Um breve vórtice e centrifugue rapidamente a placa a quatro graus Celsius.

A placa de amostra está agora preparada. Agora use uma nova placa de 96 poços para preparar 13 x concentrações da mistura de ensaio. Isso é feito misturando um primer universal, primer direto e sonda tac man específica do gene por poço.

As concentrações de um X são um micromolar para o primer universal e direto e 0,2 micromolar para a sonda tac man. Em seguida, adicione interpolação suficiente para uma concentração final de 0,25% de interpolação em um volume final de cinco microlitros. Misture bem evitando bolhas e gire brevemente o prato para coletar o fluido.

Esta é a placa de ensaio. Comece o 96.96 Q-R-T-P-C-R carregando o chip. Primeiro carregue as amostras e depois os ensaios com o volume final de cinco microlitros por entrada para o IFC.

Em segundo lugar, execute o script de combinação de carga para carregar as amostras e ensaios no chip. Quando o script terminar, retire a película protetora do chip carregado e remova quaisquer partículas de poeira ou detritos da superfície do chip usando fita adesiva. Agora configure o programa de amplificação do biossistema.

Carregue o chip no sistema e execute o programa. Os resultados podem ser analisados com o software de moeda de dez centavos para fornecer curvas de amplificação, mapas de calor de todo o chip e valores de TC para cada um. Bem usando produtos pré-PCR, purificados por separação de tamanho em géis de poliacrilamida nativos, DG CR oito do tipo selvagem e mutante nulo ER.

O RNA foi preparado em comparação com os protocolos anteriores. Mais microRNAs e uma perda de sinais falsos positivos ocorrem em fundos DGCR oito nulos e ER nulos, graças à etapa de purificação. Além disso, a abordagem QR TPCR R modificada permite a categorização adequada de pequenos RNAs dependentes de dicer independentes raros D gcr oito.

Aqui, 48 ceras de pacientes e controles foram rastreadas quanto à alteração da expressão de 384 microRNAs diferentes. Os dados foram normalizados para cada amostra subtraindo-se a mediana correspondente e sem o uso de pico nos controles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o multiplex Q-R-T-P-C-R em uma plataforma de linha de gripe pode ser usado para traçar simultaneamente o perfil de centenas de micronase em muitas amostras, mesmo quando se inicia com uma entrada muito limitada, RNA.