Name: Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a realizar perfilamento de microRNA de alto rendimento usando qRT-PCR multiplex otimizado em plataforma microfluídica. Este método melhora a precisão e reprodutibilidade com amostras limitadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gostaríamos de agradecer ao laboratório Blelloch para comentar sobre o texto. Este trabalho foi financiado por fundos para RB de NIH (K08 NS48118 e R01 NS057221), Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, Faculdade Prêmio New RN2-00906) ea Fundação Pew Charitable e FM a partir do Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol><li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li>
<li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGertsenstein%2C+M+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 644-645 (2003).</li>
<li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li>
<li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs%2C+siRNAs%2C+and+other+Microprocessor-independent%2C+Dicer-dependent+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li>
<li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNAs%3A+their+biogenesis%2C+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22StemBook%22%5BJournal%5D)">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li>
<li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li>
<li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li>
<li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li>
<li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li>
</ol>

Alan Mir é um funcionário da Corporação Fluidigm. Caso contrário, não temos interesses financeiros de divulgar.

miRNAs são curtos (18-24 nucleotídeos), miRNA RNAs não-codificante, que regulam a expressão do gene pós-transcricionalmente por ambos os RNAs mensageiros de desestabilização (mRNA) e tradução inibindo a sua 6. O fato de que, pelo menos, um terço dos genes humanos contêm conservada vinculativo-sites em seus 3&#39;UTR e as interações evidente de miRNAs com genes para a proliferação, apoptose pluripotência e sugere uma contribuição crítica nas decisões célula destino, a homeostase do tecido e doenças como o câncer 6,7. perfis de expressão Portanto precisa microRNA são de ampla interesse. Para testar o multiplex publicado qRT-PCR miRNA protocolo de dois perfis de expressão que usamos MESC RNA pequeno deficiente como controles negativos. DGCR8 - / - as células são deficientes de todos os microRNAs canônica, enquanto Dicer - / -. Células falta micoRNAs tanto canônicos e não-canoncial 8,9 Comparar os níveis no tipo selvagem MES-to DGCR8 - / - células, nós descobrimos uma falta de precisão como vários expressa microRNAs 10 não foram detectados nas células do tipo selvagem 11. Alguns até mostraram níveis mais baixos de expressão em relação às células knockout (Figura 3a). Trabalhamos com a hipótese de que a falta de precisão pode ser causado pela cartilha maciça reporte de duas etapas consecutivas multiplex (RT e Pré-PCR) antes singleplex RT quantificação. No entanto, multiplex de amplificação pré-é necessário para aumentar a força do sinal, especialmente quando a concentração inicial de RNA é limitado. Purificando distância pré-PCR produtos de primers por seleção de tamanho em géis de poliacrilamida nativo (Figura 2), conseguimos demonstrar uma melhoria substancial na precisão através da detecção de microRNAs mais e uma perda de falso-positivos em ambos os Dgcr8 - / - e Dicer - / - fundos (Figuras 3a e 3b) Além disso, a abordagem modificada qRT-PCR permitiu a própria categorização de rara Dgcr8 independente / Dicer dependentes de pequenos RNAs (Figura 3b) 11. Portanto, um passo adicional para purificar primers excessiva longe de pré-PCR produto é claramente vantajosa, especialmente quando se utiliza primers multiplex grandes conjuntos por amostra. O número ideal de ciclos de pré-amplificação é determinado pelas concentrações de entrada de RNA. O equilíbrio para não sub ou overamplify deve ser orientada por indicações do experimento específico. Com mais de um milhar de microRNAs conhecida, o uso de padrão de 384 poços placas pode não ser ideal para o perfil de microRNA extensa, especialmente quando se comparam amostras múltiplas. A IFC Matriz Fluidigm dinâmico permite, com uma diminuição significativa das etapas de pipetagem e química necessário, testes de até 96 amostras individuais contra 96 ​​microRNAs diferentes em um único experimento (9216 reações) em nanolitros escala (6,7 nL). Para cada execução do software de análise fornece curvas de amplificação, mapas com códigos de cores e valores de calor de ciclo threshold (Ct). O perfil de grande escala simultânea reduz as variações experimentais e permite a normalização significa expressão de valor, que fora executa estratégias de normalização outros que fazem uso de controles de pequeno RNA. 12 Em comparação com 384 plataformas disponíveis comercialmente bem com sondas TaqMan pré-atribuído, a combinação de uma plataforma de perfil alto rendimento com conjuntos feitos por cartilha oferece flexibilidade experimental de alta. O otimizado multiplex abordagem qRT-PCR em combinação com a plataforma de matriz dinâmica com sucesso nos permitiu, simultaneamente, tela de 48 soros de pacientes com câncer de próstata por alterações nos níveis de miRNA 384 (Figura 4) e para normalizar os dados, sem aumento nos controles (ie sintéticos microRNAs). 11 Apesar do aumento de passos desde a preparação de amostras para resultados de perfil, a abordagem descrita é um tempo e custo-eficaz método de alto rendimento para o perfil grandes conjuntos de amostras de níveis de expressão de miRNA, mesmo com material de partida limitada.

profiling microrna de alto rendimento: multiplex optimized qrt-pcr em escala nanolitros no ifcs fluidigm dinâmico arraytm

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

A ampla participação dos miRNAs em processos críticos subjacentes ao desenvolvimento homeostase do tecido, ea doença tem levado a um interesse crescente entre as comunidades científica e farmacêutica. Para estudar miRNAs, é essencial que a quantificação dos níveis de microRNA é precisa e robusta. Através da comparação do tipo selvagem de pequeno RNA deficiente do rato células-tronco embrionárias (MESC), que revelou uma falta de precisão e robustez em anteriores publicadas multiplex qRT-PCR técnicas. Aqui, descrevemos um método otimizado, incluindo purificação longe primers excessiva dos passos anteriores antes de multiplex singleplex detecção em tempo real, o que aumenta dramaticamente a precisão e robustez da técnica. Além disso, explicamos como executar a técnica em um chip microfluídico em volumes nanolitros reduz significativamente os custos de reagentes e tempo permitir eficaz alta taxa de transferência de perfil de expressão de miRNA.

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

O amplo envolvimento de miRNAs em processos críticos que fundamentam o desenvolvimento, a homeostase tecidual e a doença levou a um crescente interesse entre os...

O objetivo geral deste procedimento é analisar de forma eficiente, econômica e com quantidade mínima de material inicial a expressão de micro-RNAs, combinando a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa multiplex e uma plataforma microfluídica. O processo começa com a concentração do RNA extraído, seguido pela transcrição reversa multiplex e pré-amplificação multiplex. O próximo passo é purificar e remover os primers em excesso.Por fim, a expressão de microRNA em modo singleplex é analisada utilizando uma plataforma microfluídica. O resultado são níveis precisos e altamente reprodutíveis de expressão de microRNA entre as amostras de interesse. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a etapa adicional de purificação após a amplificação pré-EMP melhora a precisão e reprodutibilidade do método multiplex de Q-R-T-P-C-R.Inicie com RNA extraído de soro. Utilizando um kit de purificação de RNA ou um método de RNA baseado em fenol-clorofórmio a partir de tecido homogeneizado, como triol, todas as extrações devem ser seguidas por uma etapa de lavagem, e todo o armazenamento deve ser feito a menos 80 graus Celsius. Concentre a solução de RNA.Se iniciar com uma quantidade limitada de amostra, como a partir de soro em primeiro lugar, insira um reservatório de amostra MicroCon em um vial e, em seguida, pipete a solução de RNA para dentro do reservatório, tomando muito cuidado para não tocar a membrana com a ponteira da pipeta. Agora, posicione o vial e o filtro na centrífuga com a faixa de retenção voltada para o rotor e realize a centrifugação por cerca de três horas. Após três horas, o RNA estará completamente concentrado na membrana para a eluição do RNA.Adicione uma quantidade desejada de água livre de RNAses à membrana, inverta o reservatório e coloque-o em um novo tubo. Em seguida, centrifugue por três minutos a quatro graus Celsius com velocidade máxima de 3000 ×g. Armazene o RNA concentrado a menos 80 graus Celsius até o uso. Após realizar uma reação de RT no RNA utilizando iniciadores reversos em alça xpl, seguida de 12 a 18 ciclos de PCR, os microRNAs são representados por cadeias de CD NA.Isso é chamado de produto pré-PCR. Referindo-se ao QPCR seguinte. O produto pré-PCR precisa ser purificado em um gel de poliacrilamida a 10%, ao lado de uma escada de DNA de 10 pares de bases; carregue cada poço com 5,5 microlitros de corante laranja G a seis vezes, combinado com 27,5 microlitros do produto pré-PCR.Execute o gel a 150 volts por 55 a 60 minutos. O azul de romofenol corre nesse gel na região de 20 pares de bases. Após a eletroforese, manche o gel com ouro ciber por 25 minutos, sem exposição à luz e em agitador a partir do gel manchado.Recorte a faixa do produto pré-PCR de 60 a 80 pares de bases e transfira o bloco de gel para tubos etiquetados. Se a concentração do produto for baixa, ela pode não ser visível, mas ainda estará no gel. Agora, triture a faixa de gel utilizando centrifugação com tubo dentro de tubo e adicione 300 microlitros de tampão TEN.Incube a mistura de gel tampão por quatro horas a 37 graus Celsius com agitação. Após quatro horas, transfira o fluido para um novo tubo e adicione mais 300 microlitros de tampão TEN. Incube esta mistura durante a noite a quatro graus Celsius com agitação.No dia seguinte, transfira novamente o conteúdo do tubo e prossiga com uma precipitação com etanol do produto pré-PCR. Quando um chip é aberto a partir de sua embalagem, ele deve ser preparado em até 24 horas e, em seguida, carregado em até 60 minutos após o preparo. Inicie o preparo do arranjo injetando 150 microlitros de fluido de linha de controle em cada um dos acumuladores do chip.Tenha cuidado para não derramar nenhum fluido sobre o chip ou as entradas, pois o chip se tornará inutilizável. Em seguida, coloque o chip no circuito fluidico integrado ou no controlador IFC e execute o script de escorva do controlador. Assim que o programa iniciar, comece a preparar as amostras.Inicie preparando a mistura da amostra de pres. Combine tack man, master mix universal e reagentes de carregamento. Em seguida, utilizando o formato de carregamento de 96 poços, misture 2,25 microlitros de cada amostra com 2,75 microlitros da mistura de pres para coletar o fluido carregado. Vortex brevemente e centrifugue rapidamente a placa a quatro graus Celsius.A placa de amostra está agora preparada. Agora, utilize uma nova placa de 96 poços para preparar concentrações 13 x da mistura de ensaio. Isso é feito misturando um iniciador universal, um iniciador direto e uma sonda específica do gene tac man por poço.As concentrações de X são de um micromolar para o iniciador universal e direto e de 0,2 micromolar para a sonda TaqMan. Em seguida, adicione quantidade suficiente de Tween para obter uma concentração final de 0,25% de Tween em um volume final por poço de cinco microlitros. Misture bem, evitando bolhas, e centrifugue brevemente a placa para recolher o fluido.Esta é a placa do ensaio. Inicie a Q-R-T-P-C-R 96.96 carregando o chip. Primeiro carregue as amostras e depois os ensaios, com volume final de cinco microlitros por entrada na IFC.Em segundo lugar, execute o script de mistura de carga para carregar as amostras e ensaios no chip. Quando o script for concluído, retire cuidadosamente o filme protetor do chip carregado e remova quaisquer partículas de poeira ou detritos da superfície do chip utilizando fita adesiva. Agora, configure o programa de amplificação do sistema bio.Carregue o chip no sistema e execute o programa. Os resultados podem ser analisados com o software fluid dime para gerar curvas de amplificação, mapas térmicos completos do chip e valores de CT para cada poço, utilizando produtos pré-PCR purificados por separação por tamanho em géis nativos de poliacrilamida, DGCR8 selvagem e mutante nulo de ER.O RNA foi preparado em comparação com protocolos anteriores. Mais microRNAs e uma redução de sinais falsos positivos ocorrem em ambos os backgrounds nulos para DGCR oito e nulos para ER, graças à etapa de purificação. Além disso, a abordagem modificada de QR TPCR R permite a categorização adequada de pequenos RNAs independentes de D gcr oito e dependentes de dicer, raros.Aqui, 48 amostras de cera de pacientes e controles foram analisadas quanto à alteração na expressão de 384 microRNAs diferentes. Os dados foram normalizados para cada amostra subtraindo-se a mediana correspondente, sem o uso de controle de adição. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a Q-R-T-P-C-R multiplex em uma plataforma flu line pode ser usada para perfilar simultaneamente centenas de micronase em diversas amostras, mesmo com quantidade inicial muito limitada de RNA.

high-throughput-microrna-profiling-optimized-multiplex-qrt-pcr-at

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Vamos demonstrar a configuração e análise de microRNA pré-96 também matrizes para QPCR usando um robô, bem como à mão com uma pipeta multicanal Thermo Scientific Matrix.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

MicroRNAs circulam surgiram recentemente como biomarcadores promissoras e inovadoras para vários tipos de câncer e outras doenças. O objetivo deste artigo é discutir três diferentes plataformas baseadas em sonda de PCR em tempo real e métodos que estão disponíveis para quantificar e determinar a abundância de microRNAs em circulação.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Descrevemos o uso de uma plataforma de expressão gênica multiplexada de alto rendimento que quantifica a expressão gênica por código de barras e contagem de moléculas em substratos biológicos sem a necessidade de amplificação. Usamos a plataforma para quantificar a expressão de microRNA (miRNA) no sangue total em indivíduos com e sem síndrome do intestino irritável.

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

testes de alto rendimento de DNA e RNA patógenos base por nanoescala PCR é descrito usando um canino sindrômica e painel de PCR respiratória equina.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Descrevemos um método para classificar células individuais de mamíferos e quantificar a expressão de até 96 genes-alvo de interesse em cada célula. Este método inclui o uso de padrões internos de qPCR para permitir a estimativa de contagens absolutas de transcritos.

Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Neste artigo é descrito um protocolo de alto rendimento para determinação rápida e confiável dos níveis de expressão genética em amostras de C. elegans única ou a granel. Este protocolo não requer isolamento de RNA e produz cDNA diretamente a partir de amostras. Ele pode ser usado em conjunto com plataformas qPCR nanofluidas nanofluidas de alto rendimento.

RT-PCR quantitativo de alta produtividade em amostras de elegans C. single e bulk usando tecnologia nanofluidica

Aprenda a realizar perfilamento de microRNA de alto rendimento usando qRT-PCR multiplex otimizado em plataforma microfluídica. Este método melhora a precisão e reprodutibilidade com amostras limitadas.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Explorar mais vídeos