Name: Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprenda a técnica FRAP para medir a mobilidade da proteína EGFP em espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de rato cultivados. Este método quantifica frações móveis e imóveis, revelando dinâmica proteica sináptica.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação (NIDCD) Programa intramuros.

1. Transfecção neurônio <ol><li> Cultura embrionária neurônios dia 18 (E18) de ratos do hipocampo em poli-d-lisina revestido Mattek de 35 mm com fundo de vidro pratos 1. Em 16-18 dias in vitro (DIV), os neurônios transfecção usando o Clontech CalPhos Kit Transfection mamíferos. Primeiro, substituir o meio de cultura com 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Modified Dulbecco Eagle Medium</a> (DMEM) por 35 mm prato 0,5 horas antes da transfecção. Salvar o meio de cultura original em um tubo estéril 15 ml para uso posterior (passo 1.6). </li><li> Misturar 10 mg DNA pEGFP-N1 do plasmídeo com estéril H 2 O (Clontech) e 12,4 mL solução de cálcio 2 M (Clontech) para um volume total de 100 l. </li><li> Adicione a mistura a partir do passo 1.2) para 100 l 2 × HBS gota a gota enquanto vórtex 2 × HBS em velocidade média. </li><li> Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20 minutos e depois adicione a mistura final a partir do passo 1.3) em DMEM-incubadas neurônios. </li><li> Coloque os neurônios de volta para a 37 ° C incubadora de 1-1,5 horas. </li><li> Remover o fosfato de cálcio contendo meio, em seguida, lavar as células com DMEM três vezes. Antes de devolver o prato de cultura para a incubadora, troca o meio DMEM com o meio de cultura original. </li></ol> 2. FRAP experimento em uma coluna <ol><li> Neurônios são usados ​​para o experimento FRAP 2-4 dias após transfecção. </li><li> Substituir o meio de cultura a partir do 35-mm prato fundo de vidro, por acrescentando imediatamente pré-aquecido solução Tyrode, que contém (em mM) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Glucose 10, Glycine 0,005, CaCl 2 2,6, e MgCl 2 1.3 (pH ajustado para 7,4 com NaOH). </li><li> A Zeiss LSM 710 microscópio confocal é usado para o experimento FRAP. O sistema TempModule Zeiss é usado para controlar a temperatura (37 ° C), a umidade e as emissões de CO 2 (5%) do sistema de trabalho. Certifique-se que o CO 2 tanque está conectado ea garrafa de água, que é usado para balanceamento de umidade, é preenchido com água. </li><li> Encontrar uma dendrite transfectadas maduros com o objetivo × 100 (αplan Apochromat-100 × / 1,46 óleo). Se as células transfectadas no prato são pesquisa, escasso para uma célula desejada com o 40 × objetivo (plano-Neofluar 40 × / 1.3 de petróleo), e depois mudar para o 100 × objetivo de capturar imagens. </li><li> Use 5 × zoom óptico e uma resolução de 256 × 256 pixels para a imagem de um pequeno pedaço de dendrite com espinhas várias. Para capturar as imagens, use a velocidade nominal 9 (pixel tempo de permanência 3,15 ms), que leva 0,5 segundo para terminar um scan. O pinhole é definida como 2μm para a obtenção de fluorescência forte. Ao tirar as imagens, tente usar laser de baixa transmissão, por exemplo 1-5%, para evitar a fotodegradação toda a imagem. </li><li> Selecione a coluna de interesse. Em nosso experimento, escolhemos espinhas cogumelo com seus diâmetros coluna cabeça de ~ 1 mícron. </li><li> Para fazer um experimento FRAP, tomar 5 imagens de controle antes de branqueamento, em seguida, água sanitária a espinha de juros de 10 vezes na transmissão do laser nominal de 100% [A potência do laser de argônio é de 30 mW, com 50% (15 mW) na linha de laser de 488, e mW aproximadamente 3-4 chega ao microscópio através da linha de laser de 488], e então capturar uma série de imagens imediatamente após o clareamento. Para este experimento, as imagens são capturadas a cada 1 segundo durante 15 segundos após o clareamento. O intervalo de tempo deve ser ajustado de acordo com diferentes proteínas alvo e diferentes desenhos experimentais (Fig. 1). </li><li> Guardar as imagens. </li></ol> 3. Análise de dados <ol><li> Abrir imagens com ImageJ software. </li><li> Alinhe a pilha de imagens utilizando a ferramenta align ("pilhas - embaralhando 'plugins' → →" align fatias na pilha de 'corpo rígido "" tradução "e / ou →) no ImageJ, de modo que a coluna de interesse não flutua , em outras palavras - ele permanece na mesma posição na imagem. </li><li> Medir a intensidade de fluorescência relativa da coluna de interesse (F s), uma região transfectadas mas crus (controle), e uma região de fundo (F b) em imagens de lapso de tempo, usando a ferramenta 'Intensidade v Time Monitor "do ImageJ (" plugins '→' stacks - embaralhando '→' Intensidade Tempo v Monitor '). A região de controle poderia ser um pedaço de bem focada dendrite distal. A região de fundo é uma região não-fluorescente. </li><li> Calcular a taxa de fotodegradação (r), comparando a fluorescência da região controle antes (F c0) e depois (F c) fotobranqueamento. r = F c / F c0. </li><li> Normalizar a intensidade de fluorescência da coluna de destino (F) como segue: F = (F s - F b) / r. </li><li> A curva é adequada a intensidade de fluorescência da coluna de destino com uma equação de uma fase exponencial de Graphpad software Prism (Fig. 2) ou outrr software similar. </li><li> Calcular a fração móvel (f m) e da fração de imóvel (f i) pelas seguintes equações: f m = ∞ F / F 0, onde F ∞ é a intensidade de fluorescência após a recuperação completa, e F 0 é a intensidade de fluorescência antes de fotodegradação. f i = 1 - f m. </li></ol> 4. Resultados representativos: Neste estudo, realizamos um experimento sobre FRAP madura neurônios do hipocampo. Em 18-22 DIV, espinhas de cogumelos já estão formados. Utilizando nosso método, as mudanças dinâmicas da intensidade de fluorescência em uma região pequena, como uma coluna, pode ser gravado. Para analisar o processo de recuperação de fluorescência de EGFP, tomamos 5 imagens como controles antes de branqueamento e, em seguida, uma imagem a cada 1 segundo imediatamente após o clareamento por 15 segundos. A resolução da imagem é suficiente para a análise quantitativa. Os perfis de recuperação de fluorescência de proteínas tag fluorescência são altamente reprodutíveis. Também mostrarei brevemente como para definir as frações móvel e imóvel de uma proteína de fluorescência, usando ImageJ e Graphpad software Prism. O método FRAP e análise mostramos aqui pode ser amplamente utilizado em neurociência, biologia celular e outros estudos. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Medições FRAP de EGFP fluorescência em uma coluna de um neurônio culta do hipocampo. Das setas vermelhas indicam o tempo de fotodegradação. Fotografias representam a mesma área antes (Pré) e em 0, 1, 5, 10, 15 segundos após a fotodegradação. A região da coluna, controle e de fundo são marcadas com as letras S, C e B, respectivamente. Neurônios foram mantidos a 37 ° C durante o experimento. Escala de bar, 1 mícron. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curvas FRAP de EGFP de fluorescência ao longo de um período de 15 segundos. A linha verde mostra a curva original; a linha vermelha mostra a curva normalizada. Os pontos em curvas mostram a FRAP a cada 1 segundo. As curvas foram ajustadas por uma fase equações exponenciais. A fluorescência média antes fotobranqueamento foi contado como 100%. Neste experimento, a fração móvel (MF) é de 94% e da fração de imóvel (IF) é de 6%.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

FRAP análise tem sido amplamente utilizada in vivo e in vitro estudos 1-2. Esta técnica utiliza comumente GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Proteína de fusão">proteínas de fusão</a> , embora possa também usar as proteínas de fusão alga vermelha 3. Esta análise é sensível e pode ser usado para caracterizar a mobilidade das proteínas GFP. Para produzir análises FRAP significativa, é importante para evitar a fotodegradação desnecessários antes e durante o experimento FRAP. Há duas maneiras de conseguir isso. Primeiro, o processo para pesquisar e observar o neurônio experimental deve ser rápido. Especialmente, a observação de neurônios com um objetivo 100X por um longo tempo significativamente alvejantes a fluorescência. Segundo, potência do laser e digitalização de alta freqüência, muitas vezes aumentar a possibilidade de fotodegradação. Assim, será necessário calcular a taxa de fotodegradação em uma região de controle e depois normalizar a curva FRAP na região experimental. O método de normalização tem sido descrita no protocolo (veja o passo 3,3-3,5 para detalhes). O passo fotobranqueamento também é crítico para assegurar resultados FRAP bom. Neste experimento, lixívia que a espinha de juros de 10 a 100 vezes a transmissão a laser%. Esta condição é suficiente para branquear a fluorescência de uma coluna para o nível de fundo em uma preparação fixo. Assim, vamos definir a intensidade de fluorescência para o mesmo número como pano de fundo em 0 segundos após a fotodegradação. Dependendo da velocidade da primeira varredura, uma quantidade significativa de recuperação de fluorescência já podem ser detectados quando a proteína de interesse é altamente móvel. Muitas sondas proteína fluorescente têm sido desenvolvidos para estudar a dinâmica de proteínas com FRAP. Uma abordagem complementar é, por exemplo, para usar photoactivatable GFP (PA-GFP), ou variantes photoconvertible. Juntamente com a técnica FRAP, essas ferramentas estão se tornando indispensável para estudo de células vivas de imagem 4-6.

<table><tbody><tr><td>Placas de fundo de vidro de 35 mm </td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfeção mamífero CalPhos</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo pEGFP-N1</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal Zeiss</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Zeiss TempModule</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Software Graphpad Prism</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

recuperação de fluorescência após fotodegradação (frap) de fluorescência proteínas tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo cultivadas

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade das proteínas GFP. Usando um laser de excitação forte, a fluorescência de uma proteína GFP-tagged é branqueada na região de interesse. A fluorescência da região se recupera quando a proteína GFP-tagged crus de fora da região difunde para a região de interesse. A mobilidade da proteína é então analisada através da medição da taxa de recuperação de fluorescência. Esta técnica poderia ser usada para caracterizar a mobilidade de proteína e taxa de rotatividade. Neste estudo, nós expressamos o (proteína verde fluorescente melhorada) vector EGFP em culturas de neurônios do hipocampo. Usando o microscópio confocal Zeiss 710, nós photobleach o sinal de fluorescência da proteína GFP em uma coluna única, e depois tirar fotos lapso de tempo para registrar a recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Finalmente, estimamos a porcentagem de frações móvel e imóvel da GFP em espinhas, analisando os dados de imagem usando ImageJ e softwares Graphpad. Este protocolo FRAP mostra como executar um experimento FRAP básica, bem como a forma de analisar os dados.

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteína de fluorescência verde (GFP) marcadas proteínas em células em cultura. Examinamos as frações móveis / imóveis da GFP, analisando o percentual de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Neste estudo, foi realizada na FRAP espinhas de neurônios do hipocampo.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

A FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteínas marcadas com GFP. Utilizando um laser de excitação forte, a fluorescência de uma proteína marcada com GFP é desbotada...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a mobilidade da proteína verde fluorescente melhorada mediante a medição da recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP) da proteína em uma região de interesse. Isso é realizado primeiramente transfectando o vetor EGFP em neurônios hipocampais de rato cultivados. Em seguida, é realizada a gravação FRAP em um espinho de interesse utilizando um microscópio confocal Zeiss Seven 10.A taxa de fotobranqueamento pode então ser calculada utilizando os softwares Image J e GraphPad Prism. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram a mobilidade de EGFP em um espinho dendrítico de um neurônio hipocampal em cultura por meio de microscopia confocal. Este protocolo foi desenvolvido por Chazen em colaboração comigo, Ronald Pet, bem como Ya, Wang Bahar Kisha, e o autor sênior do artigo original, Robert Ol, que faleceu em outubro de 2009.Dedicamos este vídeo à sua memória. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da dinâmica proteica, como a taxa de renovação de uma proteína de interesse em uma região de interesse. Inicie este procedimento cultivando neurônios hipocampais de ratos do dia embrionário 18 em placas de vidro de fundo de 35 milímetros revestidas com polilisina MatTek por 16 a 18 dias in vitro, transfectando os neurônios utilizando o kit de transfeção mamífera CloneTech CalFectin antes de iniciar a transfeção.Guarde o meio de cultura original em um tubo estéril de 15 mililitros para uso posterior. Preencha cada placa de 35 milímetros com 1,5 mililitro de meio de Eagle modificado DOL eco 30 minutos antes da transfeção. Em seguida, combine 10 microgramas de DNA plasmidial P-E-G-F-P-N com 12,4 microlitros de solução de cálcio 2 molar e complete o volume até 100 microlitros com água estéril.Adicione a mistura de DNA GOTA A GOTA a 100 microlitros de solução salina tamponada duas vezes. Vortexe o tampão após a adição de cada gota. Após deixar a mistura final em repouso à temperatura ambiente por 20 minutos, adicione a solução de DNA em tampão aos neurônios incubados em DMEM.Incube os neurônios a 37 graus Celsius por uma a uma hora e meia. Após a incubação, remova o meio contendo fosfato de cálcio das placas de cultura e lave as células com DMEM. Repita a lavagem com DMEM por um total de três vezes.Substitua o meio DMEM pelo meio de cultura original antes de devolvê-los ao incubador. Os neurônios são utilizados para o experimento de frack dois a quatro dias após a transfeção. Para iniciar, substitua imediatamente o meio de cultura no recipiente de fundo de vidro de 35 milímetros pela solução Tyro pré-aquecida.Um microscópio confocal Zeiss LSM seven 10 é utilizado para o experimento de frack. O sistema de módulo térmico Zeiss mantém a temperatura, a umidade e a porcentagem de dióxido de carbono do sistema em funcionamento. Certifique-se de que o tanque de dióxido de carbono esteja conectado e de que a garrafa d'água, utilizada para equilibrar a umidade, esteja cheia de água.Uma vez que o microscópio esteja configurado, localize uma dendrite madura transfectada com a objetiva de 100 x. Se as células transfectadas na placa forem esparsas, procure uma célula desejada com a objetiva de 40 x. Em seguida, mude para a objetiva de 100 x.Para capturar imagens, utilize zoom óptico de cinco vezes e uma resolução de 256 por 256 pixels. Para imagens de um pequeno segmento de dendrito com várias espinhas. Para capturar imagens, utilize a velocidade nominal nove, o que leva 0,5 segundos.Para finalizar uma varredura, ajuste o pinhole para dois micrômetros para obter uma fluorescência intensa. Ao capturar imagens, tente usar baixa transmissão do laser, por exemplo, de 1 a 5%, para evitar o desbotamento fotônico de toda a imagem. Em seguida, selecione a espinha de interesse para este experimento.Escolha espinhos dendríticos de cogumelo com diâmetros da cabeça do espinho de cerca de um micrômetro para realizar um experimento de envolvimento. Adquira cinco imagens controle antes do branqueamento, em seguida, submeta o espinho de interesse a 10 ciclos de branqueamento com transmissão nominal do laser a 100% e capture uma série de imagens imediatamente após o branqueamento. O intervalo de tempo deve ser ajustado de acordo com as diferentes proteínas-alvo e diferentes delineamentos experimentais.Para este experimento, as imagens são capturadas a cada segundo durante 15 segundos após o branqueamento. Em seguida, salve as imagens para analisar os dados. Abra as imagens com o software ImageJ e alinhe a pilha de imagens usando a ferramenta de alinhamento, de modo que o espinho de interesse não se mova e permaneça na mesma posição.Na imagem, meça a intensidade de fluorescência relativa do espinho de interesse, que é uma região transfectada, mas não branqueada. Meça a região de fundo em imagens de lapso de tempo com a ferramenta de monitoramento de intensidade versus tempo do ImageJ. Utilize uma região não fluorescente como região de fundo e ajuste a intensidade fluorescente com uma equação exponencial de uma fase no software GraphPad Prism ou em outro software semelhante. Por fim, calcule a fração móvel e imóvel percentual da fluorescência, conforme mostrado.Aqui estão as medidas de FRAP da fluorescência de EGFP em um espinho dendrítico de um neurônio hipocampal em cultura. A região do espinho e a região de controle de fundo são indicadas, e a seta vermelha aponta o momento do branqueamento fotônico. Fotografias da mesma área foram obtidas antes e aos 0, 1, 5, 10 e 15 segundos após o branqueamento fotônico.As curvas de FRA da fluorescência de EGFP são mostradas ao longo de um período de 15 segundos, com os pontos nas curvas representando a FRA a cada segundo. As curvas foram ajustadas por equações exponenciais de uma fase. A fluorescência média antes do fotobranqueamento foi considerada como 100%. Neste experimento, a fração móvel é de 87% e a fração imóvel é de 13%A.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a mobilidade de uma proteína marcada com GFP utilizando a técnica FRAPPE.

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