Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

O objetivo geral deste procedimento é determinar a mobilidade da proteína de fluorescência verde aprimorada medindo o frap da proteína em uma região de interesse. Isso é feito pela primeira transecção, o vetor EGFP em neurônios do hipocampo de ratos cultivados. Em seguida, o registro de Fre é realizado em uma coluna de interesse usando um microscópio confocal Zeiss seven 10.

A taxa de fotobranqueamento pode então ser calculada usando o software Image J e GraphPad Prism. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a mobilidade do EGFP em uma coluna vertebral a partir de um neurônio do hipocampo cultivado por meio de microscopia confocal. Este protocolo foi desenvolvido por Chazen em colaboração comigo, Ronald Pet, bem como com Ya, Wang Bahar Kisha e o autor sênior do artigo original, Robert Ol, que morreu em outubro de 2009.

Dedicamos este vídeo à sua memória. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da dinâmica de proteínas, como a taxa de renovação de uma proteína de interesse em uma região de interesse. Comece este procedimento cultivando neurônios embrionários do hipocampo de ratos do dia 18 em placas de fundo de vidro de 35 milímetros revestidas com poli de lisina em neurônios transfectados in vitro de 16 a 18 dias usando o kit de transfecção de mamíferos Cal Foss da tecnologia de clone antes de iniciar a transfecção.

Guarde o meio de cultura original em um tubo estéril de 15 mililitros para uso posterior. Encha cada prato de 35 milímetros com 1,5 mililitros do meio de águia modificado do DOL eco 30 minutos antes da transfecção. Em seguida, combine 10 microgramas de P-E-G-F-P-N um DNA plasmático com 12,4 microlitros de solução de cálcio de dois molares e aumente o volume total para 100 microlitros com água estéril.

Adicione a mistura de DNA DROPWISE a 100 microlitros de solução salina tamponada com duas pilhas. Vórtice do buffer após cada gota ser adicionada. Depois de deixar a mistura final descansar em temperatura ambiente por 20 minutos, adicione a solução de DNA tampão aos neurônios incubados com DMEM.

Incube os neurônios a 37 graus Celsius por uma a uma hora e meia. Após a incubação, remova o meio contendo fosfato de cálcio das placas de cultura e lave as células com DMEM. Repetindo a lavagem DMEM um total de três vezes.

Troque o meio DMEM pelo meio de cultura original antes de devolvê-lo à incubadora. Os neurônios são usados para o experimento do fracking dois a quatro dias após a transfecção. Para começar, substitua imediatamente o meio de cultura no prato de fundo de vidro de 35 milímetros por uma solução de Tyro pré-quente.

Um microscópio confocal Zeiss LSM seven 10 é usado para o experimento do frack. O sistema de módulos de temperatura Zeiss mantém a temperatura, a umidade e a porcentagem de dióxido de carbono do sistema de trabalho. Certifique-se de que o tanque de dióxido de carbono esteja conectado e que a garrafa de água, que é usada para equilibrar a umidade, esteja cheia de água.

Uma vez que o microscópio esteja configurado, encontre um dendrito maduro e transfectado com a objetiva de 100 x. Se as células transfectadas no prato forem esparsas, procure uma célula desejada com a objetiva 40 x. Em seguida, mude para a objetiva de 100 x.

Para capturar imagens, use zoom óptico de cinco x e uma resolução de 2 56 por 2 56 pixels. Para obter imagens de um pequeno pedaço de dendrito com vários espinhos. Para capturar imagens, use a velocidade nominal nove, que leva 0,5 segundos.

Para concluir uma varredura, ajuste o orifício para dois micrômetros para obter uma fluorescência forte. Ao tirar fotos, tente usar baixa transmissão de laser, por exemplo, de um a 5% para evitar o fotobranqueamento de toda a imagem. Em seguida, selecione a lombada de interesse para este experimento.

Espinhos de cogumelos com diâmetros de cabeça de cerca de um micrômetro são escolhidos para realizar um experimento de envoltório. Tire cinco imagens de controle antes do branqueamento e, em seguida, branqueie a coluna de interesse 10 vezes a 100% nominalA transmissão a laser captura uma série de imagens imediatamente após o branqueamento. O intervalo de tempo deve ser ajustado de acordo com diferentes proteínas de destino e diferentes desenhos experimentais.

Para este experimento, as imagens são capturadas a cada segundo por 15 segundos após o branqueamento. Em seguida, salve as imagens para analisar os dados. Imagens abertas com o software Image J alinhe a pilha de imagens usando a ferramenta alinhada para que a lombada de interesse não flutue e permaneça na mesma posição.

Na imagem, meça a intensidade relativa da fluorescência da coluna de interesse, que é uma região transfectada, mas não branqueada. Meça a região de fundo em imagens de lapso de tempo com a ferramenta de monitoramento de intensidade versus tempo da imagem J.Use uma região não fluorescente como a curva da região de fundo ajuste a intensidade fluorescente com uma equação exponencial de uma fase no software GraphPad Prism ou outro software similar. Finalmente, calcule a porcentagem de fração móvel e imóvel de fluorescência. Mostrado.

Aqui estão as medições de fracking de fluorescência de EGFP em uma coluna vertebral de um neurônio do hipocampo cultivado. A região do controle da lombada e do fundo são marcadas, e a ponta da seta vermelha indica a hora do branqueamento da foto. Fotografias da mesma área foram tiradas antes e em 0 1, 5, 10 e 15 segundos após o branqueamento das fotos.

As curvas FRA de fluorescência EGFP são mostradas ao longo de um período de 15 segundos com os pontos nas curvas representando o FRA a cada segundo. As curvas foram ajustadas por equações exponenciais de uma fase. A fluorescência média antes do fotobranqueamento foi contada como 100%Neste experimento, a fração móvel é de 87%e a fração imóvel é de 13%A.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a mobilidade da proteína marcada com A GFP usando a técnica FRAPPE.