Name: Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a realizar lapso de tempo de imagens ao vivo de células progenitoras neurais individuais no encéfalo anterior de Danio rerio usando eletroporação e microscopia confocal. Este método permite analisar o desenvolvimento neural in vivo em nível clonal.

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Este trabalho foi financiado pela theNIH grantNS042626. Agradecemos a Kurt Thorn e UCSF Nikon Imaging centro de assistência com a imagem.

1. Preparação de Embriões Zebrafish <ol><li> Dois dias antes da eletroporação, criada gaiolas de acasalamento de peixes do tipo selvagem usando divisores para os machos separados das fêmeas. </li><li> Um dia antes da eletroporação, puxe os divisores em gaiolas de acasalamento do dia anterior. </li><li> Coletar embriões e incubar 50 embriões fertilizados em 30 ml de meio embrionárias contendo phenylthiourea 0,003% (PTU) a 28,5 ° C. </li><li> No dia da eletroporação, dechorionate os embriões manualmente com uma pinça fina (Inox 5, Dumont Eletrônico, Suíça), quando os embriões atingem o estágio de desenvolvimento de 22hpf. Em seguida, transferir os embriões para 3 eletroporação 10ml de Ringer (180 mM NaCl, KCl 5mM, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) contendo 0,003% PTU. </li><li> Adicionar 420 mL tricaina ações (4mg/ml) para o eletroporação 10ml de Ringer para anestesiar os embriões. </li></ol> 2. Preparação para Eletroporação <ol><li> Agulhas de injeção de vidro foram arrancados de capilares (1,2 mm de diâmetro externo, 0,9 mm de diâmetro, com filamento) em um Flaming-Brown P897 extrator (Sutter Instruments, Novato, CA, EUA). A ponta da agulha foi interrompido com uma pinça para obter uma ponta afiada, como mostrado na figura 1D. O diâmetro da ponta deve ser em torno de 10 mm e do ângulo do cone deve ser em torno de 30 graus. </li><li> Prepare 0,8% e 1% de baixo ponto de fusão de agarose (Shelton Scientific, Inc. catalogo IB70050) em solução de Ringer eletroporação. Alíquota da solução de agarose em 2 tubos de microcentrífuga ml. Manter as alíquotas em um bloco de calor em ~ 37 ° C. </li><li> O sistema Gal4/UAS é usada para acionar a expressão do gene em células progenitoras neurais de embriões electroporated. Dois plasmídeos são usados: plasmídeo EF1α-GFF-PT2KXIG, em que Gal4FF é impulsionado pela EF1α promotor onipresente, e plasmídeo UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li> Prepare-EF1α GFF-PT2KXIG e UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG DNA plasmídeo usando GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma). </li><li> Os plasmídeos são então concentrada por precipitação de acetato de sódio / etanol para a concentração final de 1-2 mcg / mL em 10 mM Tris · Cl (pH 8,5). </li><li> Misturar os dois plasmídeos e diluir com nuclease-free H2O para uma concentração final de 500 ng / mL para cada plasmídeo. Além do vermelho de fenol (diluído 1 / 10 do volume total) para a solução é a preferida para a visualização de entrega. Manter a solução de DNA em gelo. </li><li> Direito antes de agulha eletroporação, protelar a injeção com 2 mL de solução de DNA e ajustar o volume de injecção a 2 nl. </li></ol> 3. Eletroporação <ol><li> Um microscópio de dissecção stero (Zeiss Stemi 2000, com uma ampliação máxima de 50x), um injector de pressão de ar (300 microinjetor Narishige IM), duas micromanipuladores (WPI M3301R, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA), e um estimulador elétrico (SD9 quadrados de pulso estimulador, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, EUA) são configurados como mostrado na Figura 1A. </li><li> Para montar os embriões, mergulhe dois embriões em 1% de baixo ponto de fusão de agarose. Em seguida, retire imediatamente a embriões a partir da agarose com uma pipeta de vidro. </li><li> Coloque os embriões em uma tampa de plástico prato Petri invertida em gotas individuais de agarose. Orientar os embriões delicadamente com uma sonda de fibra para uma posição dorsal-up antes da agarose, para que se solidifica no prosencéfalo é acessível para ambos os eletrodos ea agulha microinjeção (Figura 1B). Embriões devem ser montados em cada agarose gotas. </li><li> Manipular os eletrodos com o micromanipulador esquerda. Os eléctrodos no agarose como mostrado na Figura 1B. Personalizado platina iridium eletrodo bipolar paralelo 125 m de diâmetro e 500 mm espaçados separados são usados ​​para eletroporação (FHC, catalogo PBSA0575). </li><li> Inserir a agulha microinjeção no ventrículo prosencéfalo e injetar DNA mix 4NL, como fluxo de fluido vermelho eo inchaço do ventrículo podem ser observados. </li><li> Imediatamente, um pulso de 28,5 V com duração de 1 milissegundo foi aplicado manualmente. Em seguida, inverter a polaridade e aplicar mais um pulso de 28,5 V com duração de 1 milisegundo. Isso resultará em mosaic rotulagem bilateral do cérebro anterior células progenitoras neurais. </li><li> Após a eletroporação de 10 embriões, adicione meio embrionárias 5ml para cobrir os embriões e descascar a agarose com uma faca de microcirurgia para liberar os embriões. </li><li> Transferir os embriões electroporated a um prato fresco de 30 ml de meio embrionárias contendo 0,003% PTU e incubar a 28,5 ° C. </li></ol> 4. Montagem e Time-lapse de imagens ao vivo <ol><li> Em torno de 4 horas após a eletroporação, o sinal de EGFP é observável se visto sob um microscópio de epifluorescência dissecação. </li><li> Cinco horas após eletroporação, selecione os embriões com mosaico altamente mas a expressão EGFP forte na região do prosencéfalo. </li><li> Transferir os embriões selecionados para 10ml médio embrionárias contendo PTU 0,003%. </li><li> Adicionar 420 mL tricaina ações (4mg/ml) ao embrionárias 10ml médio to anestesiar os embriões. </li><li> Para montar os embriões, mergulhe um embrião em 0,8% baixo ponto de fusão de agarose. Em seguida, retire imediatamente o embrião da agarose com uma pipeta de vidro e colocar o embrião no centro de um prato de cultura 35 milímetros de vidro de fundo (Mattek corporação, Part # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass bottom-dishes.com</a> ) . </li><li> Orientar os embriões delicadamente com uma sonda de fibra para uma posição dorsal-up antes da agarose solidifica. </li><li> Coloque o prato de forma adequada no palco temperatura controlada de um microscópio confocal, como mostrado na figura 1C (Nós usamos um microscópio Nikon C1 espectral confocal com up-direita objetivos). Ajustar a temperatura para 28,5 ° C. </li><li> Adicionar 3ml 28,5 ° C médio pré-aquecido embrionárias contendo 0,003% PTU para cobrir o embrião. O embrião está pronto para geração de imagens. </li><li> Executar lapso de tempo imagens ao vivo com um intervalo fixo utilizando objetiva de imersão de água. </li></ol> 5. Resultados representante Mostrado na Figura 2 são selecionados quadros de um lapso de tempo de imagem confocal ao vivo do embrião electroporated de EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP aos 22 hpf. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Aparelho set-up. (A) O conjunto de equipamentos de eletroporação: the Grass SD9 quadrados de pulso estimulador (i), o micromanipulador esquerda (ii), os eletrodos (iii), o microscópio Zeiss dissecar (iv), a agulha de injeção (v), micromanipulador o direito (vi) eo Narishige IM 300 microinjetor (vii). (B) A posição relativa dos eletrodos (i), o ventrículo prosencéfalo (ii) ea agulha de injeção (iii). Observe a solução DNA de cor vermelha foi injetado no ventrículo prosencéfalo. (C) A montagem de imagens ao vivo em microscópio Nikon C1 confocal: o controlador de temperatura (i), a água molhando objetivo len (ii) eo embrião electroporated embutido no baixo ponto de fusão de agarose em um prato fundo de vidro cultura (iii) (D ) Imagem de uma agulha puxado e corte para microinjeção de DNA. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Quadros selecionados de um de 18 horas de lapso de tempo de imagem confocal ao vivo do embrião electroporated com EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP aos 22 hpf. Superfície do ventrículo está no lado inferior de cada quadro de imagem. Barra de escala representa 10 mM.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste vídeo, demonstramos um método para time-lapse imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um nível clonal no prosencéfalo zebrafish em desenvolvimento. Nós testamos e modificou o eletroporação protocolos existentes para 4-6 geneticamente e fluorescente etiqueta individual células progenitoras neurais. Uma árvore de linhagem clonal composto de células descendentes relacionados pode ser estabelecida uma vez que apenas algumas células eram escassamente rotulados com uma tensão relativamente baixa de...

lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento zebrafish encéfalo anterior

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Padrões precisos de migração, divisão e diferenciação das células progenitoras neurais são cruciais para o desenvolvimento adequado do cérebro e 1,2 função. Para entender o comportamento das células progenitoras neurais no complexo no ambiente vivo, lapso de tempo imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um cérebro intacto é extremamente necessário. Neste vídeo, nós explorar as características únicas de embriões zebrafish para visualizar o desenvolvimento de células progenitoras neurais prosencéfalo in vivo. Usamos a eletroporação geneticamente e pouco etiqueta individual células progenitoras neurais. Resumidamente, o DNA construções de codificação para marcadores fluorescentes foram injetados no ventrículo do cérebro anterior de 22 horas após a fertilização (hpf) embriões zebrafish e pulsos elétricos foram entregues imediatamente. Seis horas depois, os embriões do zebrafish electroporated foram montadas com baixo ponto de fusão de agarose em placas de cultura de vidro de fundo. Fluorescente etiquetado células progenitoras neurais foram então fotografada por 36 horas com intervalos fixos sob um microscópio confocal utilizando água lente objetiva de imersão. O presente método fornece uma maneira de obter insights sobre o desenvolvimento in vivo de células progenitoras neurais do cérebro anterior e pode ser aplicado a outras partes do sistema nervoso central do embrião zebrafish.

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.<em&gt; In vivo</em&gt; Análise do desenvolvimento de células progenitoras do prosencéfalo neural em um nível clonal pode ser alcançada dessa forma.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Padrões precisos de divisão, migração e diferenciação de células progenitoras neurais são cruciais para o desenvolvimento e a função cerebral adequados1,2. Para...

O objetivo do seguinte experimento é observar o desenvolvimento in vivo de células individuais progenitoras neurais do prosencéfalo ao longo do tempo por meio de imagens vivas com lapso de tempo em embriões de peixe-zebra. Isso é conseguido por eletroporação de construtos de DNA codificando marcadores fluorescentes que rotulam esparsamente quatro células progenitoras neurais cerebrais. Embriões eletroporados são anestesiados, montados em agarose de baixo ponto de fusão e submetidos a microscopia confocal com lapso de tempo.Os resultados mostram o desenvolvimento in vivo de um tipo específico de célula progenitora neural do prosencéfalo. Este método pode fornecer informações sobre o desenvolvimento in vivo de células neuroprogenitoras do prosencéfalo. Também pode ser aplicado a outras regiões do sistema nervoso central, como a membrana, o encéfalo e a medula espinhal.A principal vantagem deste método em relação a métodos existentes, como a injeção de DNA ou RNA em estágio de célula única, é que ele direciona com precisão o interesse próprio em qualquer ponto temporal do desenvolvimento. Este protocolo inicia-se no dia anterior à eletroporação planejada. Na manhã seguinte, colete 50 embriões fertilizados de peixes-zebra acasalados, bata os embriões em meio embrionário contendo fenil-tiourea ou PTU e incube os embriões submersos por 22 horas a 28,5 graus Celsius no dia seguinte.Após 22 horas da fertilização, os embriões estão prontos para serem eletroporados. Comece revestindo manualmente os embriões com pinças finas. Transfira os embriões revestidos para 10 mililitros de solução fisiológica para eletroporação contendo PTU, para então anestesiar os embriões.Adicione 420 microlitros do estoque de Trica com concentração de quatro miligramas por mililitro à solução. Os embriões estão agora prontos para eletroporação. Prepare as agulhas de injeção necessárias para eletroporação. Capilares de vidro são puxados e suas pontas são quebradas com pinça para obter uma ponta fina de 0,2 ponto de fusão baixo.São também necessárias soluções de agrobactérias, que incluem uma solução a 1% suspensa em solução fisiológica para eletroporação e uma solução a 0,8% em meio embrionário para montagem. Aliquote as duas soluções de agrobactérias diferentes em tubos microcentrífugos de dois mililitros e mantenha-os prontos em um bloco térmico a cerca de 37 graus Celsius. Este protocolo utiliza o sistema GAL4-UAS para induzir a expressão gênica em células progenitoras neurais.Dois plasmídeos são utilizados: um expressa ubiquitamente GAL four ff e o outro expressa GFP em resposta ao GAL four ff. Ambos os plasmídeos são preparados por meio de kits, concentrando-os entre um e dois microgramas por microlitro usando precipitação com acetato de sódio e etanol em uma solução de 10 milimolares de Tri cl. Após determinar a concentração dos plasmídeos, dilua ambos os plasmídeos em uma única solução com água livre de nucleases para 500 nanogramas por microlitro.Nesta concentração, eles serão injetados em conjunto para visualizar a administração da solução, corada com vermelho de fenol a 10% do volume total da solução. A solução está agora pronta para eletroporação e deve ser mantida em gelo. O equipamento de eletroporação consiste em um microscópio estereoscópico de dissecação com aumento máximo de 50 x.O equipamento é equipado com um injetor de pressão de ar, dois micromanipuladores e um estimulador elétrico. O eletrodo no micromanipulador esquerdo possui eletrodos bipolares paralelos personalizados de platina-irídio; logo antes da eletroporação, recarregue a agulha de injeção com dois microlitros de solução de DNA e ajuste o volume de injeção para quatro nanolitros. A partir deste ponto, o protocolo exige prática para aperfeiçoar o posicionamento: imergir e remover imediatamente dois embriões da solução de agarose a 1% com ponto de fusão baixo.Com uma pipeta de vidro, transfira cada embrião para sua própria gota de ágar na plataforma ou na placa, diretamente na gota. Use uma sonda de fibra para orientar suavemente os embriões em posição dorsal voltada para cima antes que o ágar solidifique. Isso tornará o prosencéfalo acessível tanto aos eletrodos quanto à agulha de microinjeção.Repita este processo até que todas as 10 gotas estejam carregadas com todos os embriões preparados. Insira os eletrodos no átrio e insira a agulha de microinjeção no ventrículo anterior. Agora, injete quatro nanolitros da mistura de DNA.Observe o fluxo e fique atento ao inchaço do ventrículo. Assim que o inchaço for observado, aplique dois dos quatro pulsos de 0,5 volt, com duração de um milissegundo cada. Esses quatro pulsos precisam ser entregues em polaridade oposta.O resultado é uma marcação em mosaico bilateral das quatro células progenitoras neurais do cérebro. Agora, remova a agulha de injeção do prosencéfalo e mova a platina para o próximo embrião. Repita o processo de injeção e eletroporação em cada embrião restante.Após todos os 10 embriões terem sido eletroporados, despeje cinco mililitros de meio embrionário sobre os embriões para transferi-los. Remova os aros com uma faca microcirúrgica e transfira-os para uma nova placa contendo 30 mililitros de meio embrionário. Antes da aquisição de imagens, incube os embriões a 28,5 graus Celsius por cerca de quatro horas, quatro horas após a eletroporação.O sinal de EGFP é observável. Se observado sob um microscópio estereoscópico epifluorescente em uma hora ou cinco horas após a eletroporação, selecione os embriões com expressão de EGFP fortemente mosaicada, mas intensa, na região do cérebro. Transfira os embriões selecionados para 10 mililitros de meio e anestesie-os com a adição de 420 microlitros de estoque de trica a uma concentração de quatro miligramas por mililitro.A imagem será realizada na platina controlada por temperatura de um microscópio confocal, equipado com objetivas verticais. Prepare o microscópio ajustando a temperatura da platina para 28,5 graus Celsius. Aqueça também o meio embrionário a 28,5 graus Celsius.Para montar um embrião, use uma pipeta de vidro para mergulhá-lo brevemente em aros e coloque-o no centro de uma placa de cultura de 35 milímetros com fundo de vidro. Usando uma sonda de fibra, oriente suavemente os embriões em posição dorsal para cima antes que o agro solidifique e cubra-os com três mililitros de meio pré-aquecido. O embrião está agora pronto para a aquisição de imagens vitais em intervalos fixos utilizando um objetivo de imersão em água; são apresentadas aqui imagens confocais em lapso de tempo de uma célula progenitora neural.Usando este método, podemos observar essa célula migrar e se dividir duas vezes entre 28,5 e 41,5 horas após a fertilização. Ao minimizar a potência do laser e repor o meio do embrião, as imagens podem continuar sendo obtidas por até 60 horas após a fertilização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma eletroporação em células neurogênicas geneticamente marcadas e em vídeo, bem como de como manipular os embriões com eletrodos.Para a imagem confocal em nível de lapso de tempo, uma vez dominada, essa eletroporação pode ser realizada em menos de uma hora se for feita corretamente.

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Aprenda a realizar lapso de tempo de imagens ao vivo de células progenitoras neurais individuais no encéfalo anterior de Danio rerio usando eletroporação e microscopia confocal. Este método permite analisar o desenvolvimento neural in vivo em nível clonal.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

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