Name: Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprenda a coletar amostras de sangue por punção digital para analisar apoptose de linfócitos induzida por exercício. Este método minimamente invasivo utiliza citometria de fluxo para avaliar respostas imunológicas pós-exercício com rapidez e precisão.

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Esta pesquisa foi suportada por um Grant Faculdade Nova do Conselho de Bolsas da Faculdade de Western Kentucky University.

1. Dedo-Stick coleta de sangue <ol><li> Coleta de sangue total é normalmente tomadas em repouso por uma base de referência (normalmente após 10-15 min de repouso sentado), durante ou imediatamente após uma sessão de exercícios, e durante todo o período pós-exercício (geralmente de 1-3 horas após a interrupção do exercício). </li><li> Utilizando precauções universais, primeiro esterilizar a ponta do dedo com 70% de álcool isopropílico. </li><li> Punção, próximo do local usando uma lanceta automatizado ou dispositivo similar. Apesar de usarmos uma lanceta de calibre 30 para fornecer para o conforto assunto, uma agulha de maior calibre podem ser utilizados. </li><li> Limpe a primeira gota de sangue, e depois coletar sangue em tubos capilares ou microvettes tratados com heparina de lítio para prevenir a coagulação. </li></ol> 2. Fenotipagem de células e de coloração Apoptose <ol><li> Adicionar 10 mL de sangue heparinizado inteiro para painel de anticorpos titred em 250 mL de buffer de ligação (ver esquema tabela 1). Nós temos usado um fator de diluição de 1:20 com sucesso, mas cada laboratório deve titre seus reagentes para determinar a melhor solução de trabalho. Tabela painel de anticorpos 1. Para a determinação de exercício na apoptose induzida por subconjuntos de leucócitos. Apoptose precoce foi definido pela expressão de anexina V, enquanto apoptose tardia foi definida pela rotulagem positiva duplo com anexina V e 7-AAD. Células necróticas foram anexina V e 7-AAD + apenas células. <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo 1 </td><td> Tubo 2 </td><td> Tubo 3 </td><td> Tubo de 4 </td></tr><tr><td> Células do tubo só </td><td> Anexina V - FITC </td><td> Anexina V - FITC </td><td> Anexina V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> Anti CD4 humanos - PE </td><td> Anti Humanos CD8 - PE </td><td> Anti Humanos CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> Anti Humanos CD45RA - APC </td><td> Anti Humanos CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7-AAD = 7-Amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfócitos T helper, linfócitos CD8 = supressoras / citotóxicas T, CD19 = B linfócitos, CD45RA = subpopulações de células ingênuo, FITC = isotiocianato de fluoresceína, PE = Ficoeritrina. </li><li> Incubar a temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos. </li><li> Decantar, adicionar 300 mL de sangue Red Tampão de Lise Celular, e completamente vortex. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Adicionar 300 mL PBS para parar RBC reação de lise. </li><li> Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos. </li><li> Decantar, rack, e adicionar 50 mL de buffer de ligação. </li><li> Analisar por citometria de fluxo. </li></ol> Recomenda-se que, no mínimo, os seguintes controles ser utilizados: um tubo de células apenas para servir como controle negativo na detecção de autofluorescência de fundo, e os tubos contendo cada um fluorocromo para definir a compensação durante a configuração inicial do citômetro de fluxo. Além disso, temos utilizado com sucesso contas de compensação padrão para configurar nossos experimentos.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Um procedimento de coleta de amostra e minimamente invasiva posterior análise é demonstrado para a análise das fases precoce e tardia da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos. Também é possível excluir aqueles claramente células, que são necróticas, e não apoptóticas. Este procedimento supera os inconvenientes e desconforto associado a punção venosa invasoras da região antecubital em momentos múltiplos antes, durante e imediatamente após o exercício, ou conseguir um cateter para a duração da sessão de exercício...

<table><tbody><tr><td>Tampão de Ligação para Citometria de Fluxo</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Lisise de Hemácias</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo Lanceta</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Tubos capilares heparinizados</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V-FITC Conjugada</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE Conjugado</td><td>Anti-humano, clone RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE Conjugado</td><td>Anti-humano, clone OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE Conjugado</td><td>Anti-humano, clone HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Coloração com 7-AAD para Viabilidade</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC Conjugado</td><td>Anti-humano, clone HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ponta de dedo metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercício é um estímulo fisiológico capaz de induzir a apoptose em células do sistema imunológico. Até à data, várias limitações foram identificadas com a medição deste fenômeno, particularmente em relação à quantidade de tempo necessário para isolar e tratar uma amostra de sangue antes da avaliação da morte celular. Devido a isso, é difícil determinar se os aumentos relatados em apoptose de células imunes podem ser contribuíram para o efeito real do exercício sobre o sistema, ou são um reflexo do tempo e de processamento necessário para, eventualmente, obter esta medida. Neste artigo vamos demonstrar um procedimento rápido e minimamente invasivo para a análise da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos. Ao contrário de outras técnicas, o sangue total é adicionado a um painel de anticorpos imediatamente após a obtenção de uma amostra. Após o período de incubação, as hemácias são lisadas e as amostras estão prontas para serem analisados. O uso de um procedimento de amostragem ponta de dedo reduz o volume de sangue necessário, e minimiza o desconforto para o indivíduo.

O exercício é capaz de induzir a apoptose em células do sistema imunológico. Existem limitações de medição diversos, particularmente relacionadas com a quantidade de tempo necessário para isolar e tratar uma amostra de sangue antes da avaliação. Demonstrado é um procedimento rápido e minimamente invasivo para a análise do exercício apoptose induzida por linfócitos.

Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

O exercício é um estímulo fisiológico capaz de induzir a apoptose em células imunes. Até o momento, diversas limitações foram identificadas na medição...

Olá, sou James Volta, do Programa de Ciência do Exercício do Departamento de Ciências do Movimento, Recreação e Esporte da Universidade Western Kentucky. E o que vamos fazer é mostrar o procedimento que desenvolvemos e que utilizamos para medir o exercício induzido na apoptose de linfócitos. Então, vamos dar uma olhada.Uma amostra de sangue capilar é obtida utilizando a gota de sangue do dedo com precauções universais. A ponta do dedo é esterilizada e, em seguida, perfurada. A primeira gota de sangue é descartada, e então o sangue é coletado em tubos capilares ou microplacas.10 microlitros de sangue total foram pipetados em um painel de anticorpos contendo citometria de fluxo, tampão adequado com fluorocromos, incluindo anexina V, sete aminoactin D, CD4, CD8 ou CD19 e CD45ra, além de um tubo contendo apenas células; utilizamos microesferas de compensação como controle para auxiliar na configuração de nossos experimentos. A amostra é completamente misturada em vórtex e, em seguida, incubada à temperatura ambiente, no escuro, por 30 minutos. Após a incubação, as amostras são centrifugadas por 10 minutos e, então, o sobrenadante é removido com um único movimento suave.Adicionam-se 300

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Este vídeo demonstra o uso do ensaio ELISpot para avaliar a função das células B secretoras de anticorpos, ASCs. Os anticorpos secretados pelas ASCs interagem com os fragmentos de anticorpos policlonais ligados à membrana, que são detectados pelos anticorpos IgG ou IgM conjugados com enzimas. A mancha colorida produzida em cada poço indica a presença do isotipo do anticorpo específico, que se correlaciona com a atividade secretora das células B.

Avaliação funcional de células B secretoras de anticorpos usando o ensaio ELISpot

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estimular linfócitos via Haemophilus influenzae não tipável (NTHi) e avaliar a resposta imune. A incubação de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) com NTHi faz com que as células bacterianas estimulem os linfócitos T, levando à produção de citocinas. Ao inibir a secreção de citocinas, a coloração por imunofluorescência é realizada para detectar as citocinas intracelulares acumuladas em linfócitos T estimulados.

Uma técnica in vitro para estimular linfócitos via bactérias patogênicas

O objetivo deste vídeo é apresentar a técnica de biópsia do músculo esquelético de Bergström modificada em seres humanos.

Procedimentos de biópsia de músculo esquelético humano, utilizando a técnica Bergström Modificado

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método para medir a fagocitose de monócitos e granulócitos e a atividade de explosão oxidativa em amostras de sangue humano.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Este trabalho descreve um fluxo de trabalho avançado para a determinação precisa e rápida da contagem de células NK (Natural Killer) e citotoxicidade de células NK em amostras de sangue humano.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

O estudo do metabolismo está se tornando cada vez mais relevante para a pesquisa imunológica. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em esplenócitos de camundongos e linfócitos T e B.

Um protocolo otimizado para analisar glicólise e respiração mitocondrial nos linfócitos

Aqui nós apresentamos um protocolo para obter várias amostras de sangue da veia antecubital durante o treinamento intervalado de alta intensidade. Este protocolo pode ser útil para a medição dos metabólitos do sangue e marcadores endócrinas durante o exercem.

Avaliação do lactato sanguíneo e Plasma insulina durante o exercício de alta intensidade por cateterização da veia Antecubital

Para avaliar a influência da intensidade do exercício nas respostas fisiológicas e biológicas, foram utilizados dois protocolos de testes de exercício diferentes. Métodos de exercício em um cicloergômetro de teste como um teste de consumo máximo de oxigênio incremental e resistência de estrutura de tópicos, teste de resistência submáxima de estado estacionário são descritos.

Realização de exercícios de resistência máxima e submáxima testes para medir as respostas fisiológicas e biológicas ao exercício agudo em humanos

Aprenda a coletar amostras de sangue por punção digital para analisar apoptose de linfócitos induzida por exercício. Este método minimamente invasivo utiliza citometria de fluxo para avaliar respostas imunológicas pós-exercício com rapidez e precisão.

Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

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