Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o transporte mitocondrial em neurônios cultivados ao longo de períodos prolongados, utilizando microscopia de fluorescência em células vivas. Isso é realizado primeiramente marcando as mitocôndrias em neurônios cultivados com uma proteína fluorescente direcionada a um organelo. O segundo passo do procedimento consiste em adquirir imagens do transporte mitocondrial em condições de controle.

O terceiro passo do procedimento é obter séries de imagens em lapso de tempo do transporte mitocondrial após a administração aguda de neuromoduladores, como a serotonina. O passo final do procedimento é realizar uma análise das séries de imagens em lapso de tempo adquiridas. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram que os neurotransmissores modulam o transporte mitocondrial.

Esses resultados são alcançados apenas por meio da obtenção de imagens de mitocôndrias marcadas fluorescentemente em neurônios durante longos períodos. A principal vantagem deste método em relação às técnicas existentes, como marcação com corantes vitais ou transfeção transitória de GFP, é que ele torna viável realizar observações de longo prazo do transporte mitocondrial em neurônios cultivados saudáveis. Demonstrará este procedimento Chen, um pesquisador associado do meu laboratório, a fim de fornecer um ambiente estavelmente aquecido e umidificado.

O incubador de platina é conectado a um incubador padrão de cultura de tecidos por meio de um circuito fechado, com tampa de membrana A-P-F-T-E para placas de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros, o que permite a troca de gases entre a cultura neuronal e o ambiente dentro do incubador. Juntos, esses e outros recursos permitem a observação de longo prazo de neurônios cultivados sob diversas condições experimentais. Transfira a placa de cultura contendo neurônios hipocampais cultivados, expressando a proteína mito turbo vermelha, para uma capela de cultura de tecidos.

Substitua a tampa de plástico pela tampa com membrana de PFTE e transfira o recipiente de cultura para o microscópio. Prenda a base do incubador à platina do microscópio e, em seguida, posicione cuidadosamente o recipiente de cultura com a membrana. Na abertura reentrante, alinhe a carcaça do incubador com os pinos de aço na base do incubador e abaixe a carcaça sobre a base.

Ajuste os parafusos de aperto até que um bom selamento seja alcançado entre o invólucro e a base. Ligue o controlador da roda de filtros do microscópio, a fonte de luz e a câmera CCD antes de abrir o software de aquisição de imagens. Neste protocolo, o slide book cinco é utilizado para a aquisição de imagens.

Altere para uma objetiva de imersão em óleo de 63 x e abaixe a torreta de objetivas. Aplique cuidadosamente óleo de imersão sobre a superfície da objetiva. Clique no ícone da janela de foco na barra de ferramentas e ligue a lâmpada de campo claro movendo o controle deslizante da lâmpada.

Para ajustar a intensidade da luz, obtenha foco em um campo de células utilizando as oculares e localize uma célula de interesse. Selecione o filtro XI três na guia do microscópio usando as oculares, encontre o plano de foco para as mitocôndrias nas células marcadas com a proteína mito turbo red e, em seguida, mude para a câmera CCD. Clique no ícone de captura de imagem na barra de ferramentas, começando com um tempo de exposição inicial de 100 milissegundos.

Encontre a exposição ideal utilizando os botões de teste e encontrar melhor na janela de captura. Na caixa de tipo de captura, marque a opção de lapso de tempo e selecione o intervalo de imagens desejado e a duração da sessão de aquisição nas opções de captura em lapso de tempo.

Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo clicando no botão de início localizado no canto inferior direito da janela de captura. Após capturar uma sessão de imagem controle, administre neurotransmissores ou outros reagentes através dos portos de injeção na parte superior do incubador acoplado à platina. Após a adição do agonista do receptor de serotonina 8-OH-DPAT, mitocôndrias previamente estacionárias, indicadas pela seta, movem-se ao longo do axônio do neurônio hipocampal.

A velocidade média e a direcionalidade de mitocôndrias individuais são resumidas antes da adição de serotonina. A maioria das mitocôndrias está estacionária; no entanto, após a adição de serotonina, 42% das mitocôndrias passam a exibir movimento direcional e percorrem distâncias maiores do que aquelas que exibem movimento direcional na ausência de serotonina. Por outro lado, após a adição de dopamina, 92% das mitocôndrias estão estacionárias nos últimos 15 minutos de uma sessão de imageamento, seguindo este procedimento.

Outros métodos para monitorar mais de um sinal podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, como a atividade de cálcio e o transporte mitocondrial em neurônios estão relacionados.