Name: Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Aprenda a visualizar o transporte mitocondrial em neurônios de hipocampo por longos períodos usando microscopia de fluorescência em células vivas. Este método utiliza proteína fluorescente direcionada a mitocôndrias e incubadora de estágio para observações estáveis.

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Gostaríamos de agradecer Donald Hutson para contribuir seus conhecimentos técnicos e muita habilidade durante o projeto e fabricação da incubadora em estágio superior. Estamos também gratos a Ayda Dashtaei por sua excelente assistência técnica. Todo o trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Neurociências.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Empregando lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente alvejado a mitocôndria em neurônios cultivados infectados e uma incubadora barata laboratório construído estágio-top que permite imagens de células vivas por longos períodos, temos sido capazes de investigar a ligação entre o movimento mitocondrial e os sinais de neuromoduladores , como a serotonina (5-HT), dopamina (DA) e acetilcolina (ACh). Nossos estudos têm ajudado a elucidar uma via de sinalização que, pela primeira vez, links tráfico mitocondrial para mudanças na atividade dos neurônios-modulado por neurotransmissores como a 5-HT e DA - que são o cerne da função neural. Nós achamos que o uso de proteínas fluorescentes alvo permite a observação de mitocôndrias rotulados na vida neurônios cultivados por longos períodos que podem ser mais fisiologicamente relevante do que a duração muito mais curta que são possíveis usando corantes vitais. Além disso, a intensidade do sinal de uma proteína fluorescente nos permite manter os tempos de exposição curtos durante a aquisição de imagem, minimizando a possibilidade de fotodegradação ou fototoxicidade. Finalmente, um estágio-top simples e barato incubadora que mantém a temperatura ambiente, umidade e níveis de CO 2, enquanto minimiza a evaporação da mídia, nos permite acompanhar o movimento mitocondrial em neurônios vivos por horas ou mesmo dias. Pesquisadores que desejam fabricar uma incubadora de estágio-top para as observações a longo prazo de mitocôndrias nos neurônios viver não precisa seguir os detalhes precisos do nosso projeto, desde que as propriedades dos materiais utilizados (por exemplo, o gás membrana permeável para evitar a evaporação da mídia ) e os princípios aplicados (por exemplo, controle de temperatura e umidade, o buffer de manutenção do pH, da osmolaridade) são geralmente consistentes com o que é descrito neste protocolo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Quantidade </th><th> Descrição (e localização na Figura 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Cultura de tecidos incubadora (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Resistente ao calor gabinete plástico (delrin ou comparáveis) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Armação de plástico para 35mm tampa GBM (para a aposição de membrana para placa de Petri) (M) </td></tr><tr><td> 02/01 </td><td> linear pé Limpar PFTE material da membrana (Teflon) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Polegar parafusos de latão </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Pequena 10kOhm resistores dissipador de calor (usados ​​como elementos de aquecimento no interior estágio-top gabinete incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformador (fonte de corrente 9V para resistores) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrário controlador de temperatura e sonda (regulação termostática de poder para resistores dissipador de calor através de transformador) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyer (silenciador para a supressão de vibração na mangueira antes da fase-top incubadora) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;folha Sorbothane (junta material para base de estágio-top incubadora) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hermético ABS (ou comparável) caixa de plástico (carcaça para a bomba de aquário) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aquário da bomba (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ventilador pequeno computador </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Invólucro de plástico para ventilador de arrefecimento (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V transformador para computador ventoinha de refrigeração </td></tr><tr><td> 20-30 pés </td><td> Nalgene ou silicone mangueira (conexões entre cultura de tecidos e-top estágio incubadoras; armadilhas umidade) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Torneiras de plástico (para abrir e fechar o fluxo de ar antes e depois do estágio-top incubadora) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Conectores de bronze farpado mangueira (mangueira para conexões de / para o estágio-top incubadora e gabinete de bomba de aquário) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Stage-top incubadora feita com partes: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5mg </td></tr><tr><td> laminina </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 milímetros com fundo de vidro pratos </td><td> Mattek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Rica em lipídios BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-Proline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> A vitamina B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100mg </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100mg </td></tr></tbody></table>

neuromodulação e transportes mitocondrial: imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Para entender a relação entre o transporte mitocondrial e função neuronal, é fundamental observar o comportamento mitocondrial em viver neurônios cultivados por longos períodos 1-3. Isto é agora possível através do uso de corantes vitais e proteínas fluorescentes com que os componentes do citoesqueleto, organelas, e outras estruturas em células vivas podem ser rotulados e então visualizados através de microscopia de fluorescência dinâmica. Por exemplo, nos neurônios de frango embrionárias Simpático, movimento mitocondrial foi caracterizada utilizando o corante vital rodamina 123 4. Em outro estudo, as mitocôndrias foram visualizados nos neurônios do prosencéfalo rato por transfecção de eYFP mitochondrially alvo 5. No entanto, imaging de neurônios primários ao longo de minutos, horas ou mesmo dias apresenta uma série de questões. Lugar entre estes estão: 1) manutenção das condições de cultivo, como temperatura, umidade e pH durante as sessões de imagem longa, 2) um forte sinal estável fluorescentes para garantir a qualidade das imagens adquiridas e medição precisa da intensidade do sinal durante a análise de imagem; e 3) limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagens para minimizar e evitar fotobranqueamento fototoxicidade. Aqui, nós descrevemos um protocolo que permite a observação, visualização e análise do movimento mitocondrial em culturas de neurônios do hipocampo com alta resolução temporal e sob condições de apoio ótima vida. Temos construído um preço acessível estágio-top incubadora que fornece boa regulação da temperatura e fluxo de gás na atmosfera, e também limita o grau de evaporação media, assegurando pH estável e osmolaridade. Esta incubadora é conectado, via de entrada e saída de mangueiras, com um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que oferece níveis de umidade constante e uma atmosfera de CO% 05-10 fevereiro de ar /. Este projeto oferece uma alternativa de baixo custo para incubadoras microscópio significativamente mais caros que não necessariamente garantem a viabilidade das células durante muitas horas ou mesmo dias. Para visualizar as mitocôndrias, que infectar as células com um lentivírus que codifica uma proteína fluorescente vermelha que é direcionado para a mitocôndria. Isso garante um sinal forte e persistente, que, em conjunto com o uso de uma fonte estável de luz xenon, que nos permite limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagem e tudo, mas impede fotobranqueamento e fototoxicidade. Duas portas de injeção na parte superior da incubadora estágio-top permitir que a administração aguda de neurotransmissores e outros reagentes destinados para modular o movimento mitocondrial. Na expressão de soma, mediada por lentivírus de uma organela-alvo a proteína fluorescente vermelha ea combinação de nosso palco-top incubadora, um microscópio invertido de fluorescência convencional, câmera CCD, e fonte de luz xenon nos permitem adquirir imagens de lapso de tempo de transporte mitocondrial em neurônios vivos mais durações mais longas do que as possíveis em estudos a implantação convencional corantes vitais e off-the-shelf sistemas de suporte de vida.

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

Para compreender a relação entre o transporte mitocondrial e a função neuronal, é fundamental observar o comportamento mitocondrial em culturas vivas de...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o transporte mitocondrial em neurônios cultivados ao longo de períodos prolongados, utilizando microscopia de fluorescência em células vivas. Isso é realizado primeiramente marcando as mitocôndrias em neurônios cultivados com uma proteína fluorescente direcionada a um organelo. O segundo passo do procedimento consiste em adquirir imagens do transporte mitocondrial em condições de controle.O terceiro passo do procedimento é obter séries de imagens em lapso de tempo do transporte mitocondrial após a administração aguda de neuromoduladores, como a serotonina. O passo final do procedimento é realizar uma análise das séries de imagens em lapso de tempo adquiridas. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram que os neurotransmissores modulam o transporte mitocondrial.Esses resultados são alcançados apenas por meio da obtenção de imagens de mitocôndrias marcadas fluorescentemente em neurônios durante longos períodos. A principal vantagem deste método em relação às técnicas existentes, como marcação com corantes vitais ou transfeção transitória de GFP, é que ele torna viável realizar observações de longo prazo do transporte mitocondrial em neurônios cultivados saudáveis. Demonstrará este procedimento Chen, um pesquisador associado do meu laboratório, a fim de fornecer um ambiente estavelmente aquecido e umidificado.O incubador de platina é conectado a um incubador padrão de cultura de tecidos por meio de um circuito fechado, com tampa de membrana A-P-F-T-E para placas de cultura de fundo de vidro de 35 milímetros, o que permite a troca de gases entre a cultura neuronal e o ambiente dentro do incubador. Juntos, esses e outros recursos permitem a observação de longo prazo de neurônios cultivados sob diversas condições experimentais. Transfira a placa de cultura contendo neurônios hipocampais cultivados, expressando a proteína mito turbo vermelha, para uma capela de cultura de tecidos.Substitua a tampa de plástico pela tampa com membrana de PFTE e transfira o recipiente de cultura para o microscópio. Prenda a base do incubador à platina do microscópio e, em seguida, posicione cuidadosamente o recipiente de cultura com a membrana. Na abertura reentrante, alinhe a carcaça do incubador com os pinos de aço na base do incubador e abaixe a carcaça sobre a base.Ajuste os parafusos de aperto até que um bom selamento seja alcançado entre o invólucro e a base. Ligue o controlador da roda de filtros do microscópio, a fonte de luz e a câmera CCD antes de abrir o software de aquisição de imagens. Neste protocolo, o slide book cinco é utilizado para a aquisição de imagens.Altere para uma objetiva de imersão em óleo de 63 x e abaixe a torreta de objetivas. Aplique cuidadosamente óleo de imersão sobre a superfície da objetiva. Clique no ícone da janela de foco na barra de ferramentas e ligue a lâmpada de campo claro movendo o controle deslizante da lâmpada.Para ajustar a intensidade da luz, obtenha foco em um campo de células utilizando as oculares e localize uma célula de interesse. Selecione o filtro XI três na guia do microscópio usando as oculares, encontre o plano de foco para as mitocôndrias nas células marcadas com a proteína mito turbo red e, em seguida, mude para a câmera CCD. Clique no ícone de captura de imagem na barra de ferramentas, começando com um tempo de exposição inicial de 100 milissegundos.Encontre a exposição ideal utilizando os botões de teste e encontrar melhor na janela de captura. Na caixa de tipo de captura, marque a opção de lapso de tempo e selecione o intervalo de imagens desejado e a duração da sessão de aquisição nas opções de captura em lapso de tempo.Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo clicando no botão de início localizado no canto inferior direito da janela de captura. Após capturar uma sessão de imagem controle, administre neurotransmissores ou outros reagentes através dos portos de injeção na parte superior do incubador acoplado à platina. Após a adição do agonista do receptor de serotonina 8-OH-DPAT, mitocôndrias previamente estacionárias, indicadas pela seta, movem-se ao longo do axônio do neurônio hipocampal.A velocidade média e a direcionalidade de mitocôndrias individuais são resumidas antes da adição de serotonina. A maioria das mitocôndrias está estacionária; no entanto, após a adição de serotonina, 42% das mitocôndrias passam a exibir movimento direcional e percorrem distâncias maiores do que aquelas que exibem movimento direcional na ausência de serotonina. Por outro lado, após a adição de dopamina, 92% das mitocôndrias estão estacionárias nos últimos 15 minutos de uma sessão de imageamento, seguindo este procedimento.Outros métodos para monitorar mais de um sinal podem ser realizados para responder perguntas adicionais. Por exemplo, como a atividade de cálcio e o transporte mitocondrial em neurônios estão relacionados.

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Neurociência

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