Name: Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a obter gravações de células inteiras em fatias organotípicas de neocórtex de ratos. Este método utiliza transfecção e técnicas de patch-clamp para estudar propriedades de neurônios piramidais após manipulações genéticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Mayumi Sakuraba e Rebecca Foehring de assistência técnica excepcional. Além disso, gostaríamos de agradecer as Dras. Rodrigo Andrade de assistência na implementação da cultura fatia organotípicas e protocolos de transfecção biobalística e Dr. Jeanne Nerbonne para fornecer-nos com construções cDNA para transfecção. Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenção: NS044163 de NINDS (para RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos (4, 9-11). Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, usamos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal (1,14,15,17-19). Nós utilizamos uma preparação organotípicas cultura (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Modificado a partir da abordagem de Stoppini et al (16), a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do có...

Cirurgia transfecção / / cultura: <ol><li> Cérebro Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA </li><li> Gene Sistema Gun: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Inclui: arma Gene, conjunto de mangueira com regulador de hélio, tubos prep estação (# 165-2418), kit seringa, tubos Tefzel, cortador de tubos, kit de otimização (# 165-2424), cortador de tubulação </li><li> Bio-Rad Hélio Regulador (# 165-2413) </li><li> material descartável para Helios da Bio-Rad: <ul><li> 1,6 mM microcarregadores Gold: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubadora: Forma Scientific modelo # 3110 (Thermo-científico: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Soro de cavalo: Hyclone doador eqüinos # 30074 SH. (HyClone, 925 Oeste 1800 Sul, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media mais HBSS e HEPES, sem glutamina: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137F): GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1. </li><li> HBSS (Hanks GIBCO solução salina, # 24020-117): GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1. </li><li> MEM (GIBCO meio mínimo essencial, # 12360-038), GIBCO / INVITROGEN, (800) 955-6288, opção 1. </li><li> 250 mL Millipore 0,2 mm filter: # SC6PU02RE </li><li> Plástico pipetas de transferência: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 mL Millipore 0,22 mM steriflip filtro (# SCGP00525) </li></ol> Itens 6-8 obtido a partir de: Fisher Scientific, 1241 Embaixador Blvd, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. De gravação: <ol><li> Pipeta de vidro: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 outubro Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 extrator eletrodo horizontal: Empresa Instrumento Sutter, um Drive Digital, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp amplificador 700B: Dispositivos Molecular, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 software de aquisição de dados: Dispositivos Molecular, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> lectrode posição é controlada com Sutter ROE-200 manipuladores e PC-200 do controlador: Instrument Company Sutter, um Drive Digital, Novato, CA 94949. </li><li> Microscópio: Olympus BX-50WI microscópio vertical com IR-DIC óptica </li><li> IR-sensíveis câmera OLY-150 (Olympus) ou DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 do Norte Roeske Avenue, em Michigan City, IN 46360). </li></ol>

gravação de células inteiras a partir de uma preparação slice organotípicas de neocortex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Temos vindo a estudar os papéis expressão e funcional de voltagem dependentes canais de potássio em neurônios piramidais do neocórtex de ratos. Devido à falta de agentes farmacológicos específicos para estes canais, temos uma abordagem genética para manipular a expressão do canal. Nós usamos uma preparação cultura organotípicas (16) a fim de manter a morfologia das células eo padrão laminar do córtex. Normalmente, isolar aguda fatias neocortical menos 8-10 dias pós-parto e manter as fatias em cultura por 3-7 dias. Isto permite-nos estudar neurônios em uma idade semelhantes aos de nosso trabalho com fatias aguda e minimiza o desenvolvimento de exuberante conexões excitatórias nos fatia. Nós gravar a partir de visualmente identificados neurônios piramidais em camadas II / III ou V com uma iluminação de infravermelho (IR) e microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) com grampo toda célula patch em corrente ou tensão-clamp. Usamos transfecção (arma Gene) biobalística do tipo selvagem ou mutante DNA canal de potássio para manipular a expressão dos canais para estudar sua função. As células transfectadas são facilmente identificados por microscopia de epifluorescência, após a co-transfecção com cDNA para a proteína verde fluorescente (GFP). Nós comparamos as gravações de células transfectadas com adjacentes, os neurônios untransfected na mesma camada da mesma fatia.

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Temos estudado a expressão e as funções funcionais de canais de potássio dependentes de voltagem em neurônios piramidais do neocórtex de rato. Devido ao...

O objetivo geral deste procedimento é obter gravações elétricas de neurônios parametais em fatias organotípicas de neocórtex. Isso é realizado primeiramente cortando fatias agudas de ratos em idades pós-natais P8 a P10. O segundo passo do procedimento é realizar a transfeção de CD NA com Bic. O terceiro passo do procedimento é cultivar as fatias por três a sete dias.O passo final do procedimento é obter gravações elétricas de células transfectadas utilizando o clamp de corrente ou de voltagem. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram que as células parametais em fatias organotípicas possuem propriedades semelhantes às de fatias agudas da mesma idade. A transfeção de GFP não altera essas propriedades, permitindo o estudo de neurônios após manipulações genéticas de canais iônicos por meio de gravações de clamp de corrente ou voltagem em célula inteira.A principal vantagem desta técnica, em comparação com fatias agudas, é que as células podem ser mantidas em um ambiente normal por tempo suficiente para permitir a manipulação genética de canais iônicos. O método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos canais iônicos, como os papéis funcionais de tipos específicos de canais iônicos. Prepare a cabine de fluxo laminar, a cabine de fluxo a vácuo, os materiais cirúrgicos e as soluções conforme especificado no manuscrito complementar. Use luvas em todos os passos subsequentes após filtrar a alíquota de 250 mililitros da solução de corte, transferindo 40 mililitros dela para um béquer de 50 mililitros.Coloque a câmara de corte, a alíquota de 40 mililitros e os 210 mililitros restantes da solução de corte no congelador a menos 20 graus Celsius sob a capela de fluxo laminar. Adicione 1,1 mililitro de meio de cultura em três poços diagonais de uma placa de seis poços. Repita isso para uma segunda placa.Placa de seis poços. Coloque as placas de seis poços em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, use tesouras estéreis para encurtar quatro pipetas de transferência que serão usadas para transferir fatias.Outras três pipetas são mantidas intactas quando as soluções se tornam misturas pastosas. Retire a alíquota de 40 mililitros da solução de corte do congelador e coloque-a sob a câmara de vácuo. Borbulhe com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono.Em seguida, retire 210 mililitros da solução de corte do congelador e coloque-os sob a câmara de fluxo laminar com bolhas de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. A seguir, retire o meio de lavagem do refrigerador e borbulhe com 100% de oxigênio sob a câmara de fluxo laminar.Coloque dois mililitros de meio de cultura em uma placa de Petri. Guarde o meio de cultura restante na geladeira para a troca do meio durante a semana, a fim de se preparar para o corte do cérebro. Despeje cerca de 10 mililitros de solução de corte fria do béquer de 50 mililitros para um béquer de 25 mililitros sob a câmara de vácuo.Após a anestesia e decapitação, remova o cérebro de uma rata pós-natal com oito a 10 dias de idade. Lave o cérebro no béquer contendo 30 mililitros de solução de corte fria por cerca de 30 segundos. Em seguida, transfira cuidadosamente o cérebro para o béquer de 25 mililitros.Troque as luvas e sature as luvas com etanol. Em seguida, leve o cérebro na solução de corte fria para a cabine de fluxo laminar. O próximo passo é orientar e bloquear o cérebro removendo o cerebelo e o polo frontal e fazendo um corte sagital mediano parcial. Cole o cérebro bloqueado na platina com o córtex frontal voltado para cima.Realize cortes adicionais com bisturi conforme necessário para limitar o tamanho das fatias. Em seguida, coloque o estágio com o cérebro na câmara de corte metálica esterilizada. Fixe ao cortador de tecidos vibratório.Encha o banho com solução de corte gelada e borbulhante. Despeje 30 mililitros da solução de corte restante em um béquer de 50 mililitros e borbulhe com 95% oxigênio, 5% dióxido de carbono. Este béquer será usado para coletar as fatias.Corte fatias coronais de 250 mícrons do córtex frontal parietal. Coloque pelo menos seis fatias no béquer de 50 mililitros contendo a solução de corte. Em seguida, coloque cerca de dois mililitros de meio de lavagem em uma placa de Petri de 35 milímetros.Usando uma pipeta cortada, transfira as fatias da solução de corte para a placa de Petri contendo o meio de lavagem. Lave as fatias três vezes, utilizando pipetas novas para adicionar o meio e para aspirar as soluções residuais após a lavagem; em seguida, transfira as fatias para a placa de Petri de 35 milímetros contendo o meio de cultura. Em seguida, remova as tampas das embalagens dos insertos de malha, mas mantenha os insertos dentro das embalagens.Em seguida, use uma pinça para levantar um inserto de malha de sua embalagem utilizando uma pipeta de transferência cortada. Transfira uma fatia do meio de cultura para a malha. Insira e posicione a fatia no centro da membrana usando uma pipeta de transferência intacta.Remova todo o meio de cultura em excesso. Agora, coloque o insert de malha com seu fragmento em um dos poços com fluido da placa de seis poços. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar sob a malha após colocar um fragmento em cada um dos poços com fluido.Coloque novamente as duas placas de seis poços no incubador e incube a 37 graus Celsius por cerca de uma hora. Enquanto isso, limpe a área de trabalho sob a capela de fluxo laminar em preparação para a transfeção. O próximo passo é carregar a pistola de genes BioRad Helios, deixando a primeira posição livre.Carregue uma cartela contendo balas revestidas com ADN em cada posição alternada do suporte de cartelas do canhão de genes. Em seguida, coloque o suporte de cartelas no canhão de genes. Primeiro, limpe o canhão disparando um barril sem balas.Em seguida, avance o cano até um cartucho contendo CDNA.Bullets. Retire as placas de seis poços do incubador e coloque-as sob a capela de fluxo laminar, segurando a pistola verticalmente logo acima da superfície da placa de seis poços; dispare uma fatia a 100 PSI. Em seguida, avance o cano e limpe-o novamente disparando um cartucho vazio. Dispare as fatias restantes com um tiro por fatia.Após o disparo, devolva as placas de seis poços ao incubador e incube as fatias a 37 graus Celsius por dois a sete dias com 5% de dióxido de carbono durante o período de incubação. Substitua o meio a cada dois dias da seguinte forma: trabalhando sob a capela de fluxo laminar, adicione meio novo aos três poços não ocupados. Em seguida, coloque novamente a placa de seis poços no incubador por pelo menos uma hora; após uma hora, devolva a placa de seis poços à capela laminar e use pinças curvas limpas com etanol para mover cada inserto de malha e sua fatia para um novo poço, aspire o meio antigo e devolva a placa ao incubador.Após vários dias de incubação, as fatias estão agora prontas para gravações de célula inteira. Remova uma placa de seis poços da incubadora sob a capela de fluxo laminar. Use pinças curvas limpas com etanol para remover um inserto de malha e sua fatia.Em seguida, recoloque a placa de seis poços no incubador. Depois, transfira a placa de Petri com o inserto de malha e o corte para a área de registro, aplicando tensão com pinça ou uma peça flexível de metal. Use um bisturi número 11 para cortar a malha ao redor do corte, se necessário, e finalize os cortes com a tesoura.Em seguida, use pin&ccedil;as para transferir a fatia e a malha a ela aderida para a c&acirc;mara de registro. Sobre a platina de um microsc&oacute;pio ereto, banhe a fatia em fluido cerebroespinhal artificial aerado com carbog&ecirc;nio sob &oacute;tica IR DIC. Visualize os neur&ocirc;nios parametais nas camadas dois, tr&ecirc;s ou cinco com fluoresc&ecirc;ncia epiluminiscente e o filtro fitz.Localize as células verdes transfectadas sob microscopia IR DIC. Procure pelas balas de cDNA, que aparecem como pequenos pontos pretos dentro das células. Selecione uma célula transfectada para gravação de célula inteira.Em seguida, avance um microeletrodo até a célula selecionada e use sucção suave para obter um selo de giga ohm. Em seguida, aplique sucção adicional para romper a membrana celular e obter o modo de célula inteira para gravação. A célula agora está pronta para gravações em regime de clamp de corrente ou de tensão.Esta figura mostra uma imagem fluorescente de células transfectadas com cDNA para GFP. Os seguintes registros foram obtidos de células transfectadas com cDNA para GFP. É mostrado aqui um potencial de ação em uma célula parametal da camada três em resposta a uma injeção de corrente supra-limiar de 10 milissegundos.Esta figura mostra a disparos repetitivos de um neurônio parametal da camada cinco em resposta à injeção de corrente de 400 picoampères por dois segundos. Esta figura mostra um registro de clamp de voltagem de um neurônio parametal da camada cinco. A tetrodotoxina foi utilizada para bloquear a corrente de sódio dependente de voltagem.Os traços representam correntes de potássio para fora provocadas por uma família de degraus de voltagem de 500 milissegundos a partir de um potencial de retenção de menos 70 milivolts. Uma vez dominado, o preparo e a transfeção leves podem ser realizados em cerca de duas horas, incluindo o tempo de preparação. Ao tentar este procedimento.É importante manter condições estéreis e restringir a espessura e as dimensões do corte para evitar a secagem. Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.Obrigado.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Este vídeo demonstra o posicionamento de uma pipeta pontiaguda perto de fatias de cérebro, formando um selo com uma célula neuronal. A sucção quebra a membrana celular, criando assim um grampo de remendo de célula inteira que permite medições de corrente para experimentos de eletrofisiologia.

Estabelecendo uma configuração de grampo de voltagem de célula inteira para registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais

Este vídeo descreve um método para obter imagens e registrar simultaneamente a atividade elétrica de fatias cerebrais transgênicas que contêm proteínas fluorescentes específicas de neurônios. O procedimento envolve a manutenção da fatia do cérebro em uma câmara de perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial aerado, usando uma fonte de luz para excitar células marcadas com fluorescência e registrando os sinais elétricos com uma sonda multicanal e um grampo de remendo.

Monitoramento óptico e eletrofisiológico simultâneo de células neuronais em fatias cerebrais

As gravações de pares são gravações simultâneas de grampo de patch de células inteiras de dois neurônios sinapticamente conectados, permitindo a caracterização eletrofisiológica e farmacológica precisa das sinapses entre neurônios individuais. Aqui descrevemos a metodologia detalhada e os requisitos para estabelecer esta técnica em culturas de fatias organotípicas do hipocampo em qualquer laboratório equipado para eletrofisiologia.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Os protocolos de circuito fechado estão se tornando cada vez mais difundidos na eletrofisiologia moderna. Apresentamos uma maneira simples, versátil e barata de realizar protocolos eletrofisiológicos complexos em neurônios piramidais corticais in vitro, usando um computador desktop e uma placa de aquisição digital.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Aqui, é apresentado um procedimento para ativar seletivamente uma proteína neuronal com um pulso curto de luz codificando geneticamente um aminoácido não natural foto-reativo em uma proteína neuronal alvo expressa em neurônios em cultura ou in vivo.

Controlo óptico de uma proteína neuronal utilizando um ácido Unnatural Amino geneticamente codificados em neurónios

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Neste artigo, discutimos três cérebro as preparações para a gravação de grampo celular patch para estudar o circuito retinotectal de girinos de Xenopus laevis . Cada preparação, com suas próprias vantagens específicas, contribui para a rastreabilidade experimental da larva Xenopus como um modelo para estudar a função do circuito neural.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aprenda a obter gravações de células inteiras em fatias organotípicas de neocórtex de ratos. Este método utiliza transfecção e técnicas de patch-clamp para estudar propriedades de neurônios piramidais após manipulações genéticas.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Explorar mais vídeos