Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

O objetivo geral deste procedimento é obter registros elétricos de neurônios parametálicos em fatias organotípicas do neocórtex. Isso é feito cortando primeiro fatias agudas de ratos em idades pós-natais P oito a P 10. A segunda etapa do procedimento é afetar a transfecção Bic de CD NA. A terceira etapa do procedimento é cultivar as fatias por três a sete dias.

A etapa final do procedimento é obter registros elétricos de células transfectadas usando pinça de corrente ou tensão. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que as células parametálicas em fatias organotípicas têm propriedades semelhantes às de fatias agudas da mesma idade. A transfecção de GFP não altera essas propriedades, permitindo o estudo de neurônios após manipulações genéticas de canais iônicos por meio de registros de corrente de célula inteira ou grampo de voltagem.

A principal vantagem dessa técnica é, ao contrário de fatias agudas, é que as células podem ser mantidas em um ambiente normal por tempo suficiente para serem capazes de manipular geneticamente os canais iônicos. O método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do canal iônico, como as funções funcionais de tipos específicos de canais iônicos, preparar a capela de fluxo laminar, a capela de fluxo a vácuo, suprimentos cirúrgicos e soluções, conforme especificado no manuscrito que o acompanha. Use luvas para todas as etapas subsequentes após filtrar a alíquota preparada da solução de corte de 250 mililitros em um béquer de 50 mililitros.

Coloque a câmara de corte, alíquota de 40 mililitros, e os 210 mililitros restantes da solução de corte no freezer a menos 20 graus Celsius sob a capela de fluxo laminar. Coloque 1,1 mililitros de meios de cultura em três poços diagonais de uma placa de seis poços. Repita isso por um segundo.

Placa de seis poços. Coloque as placas de seis poços em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, use uma tesoura estéril para encurtar quatro pipetas de transferência a serem usadas para transferir fatias.

Outras três pipetas são mantidas intactas quando as soluções se tornam misturas lamacentas. Retire a alíquota de 40 mililitros da solução de corte do congelador e coloque-a sob a coifa a vácuo. Borbulhe com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, retire os 210 mililitros de solução de corte do freezer e coloque-os sob a bolha da coifa de fluxo laminar. Também com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono. Em seguida, remova o meio de lavagem da geladeira e borbulhe-o com 100% de oxigênio sob a coifa de fluxo laminar.

Coloque dois mililitros de meios de cultura em uma placa de Petri. Coloque os meios de cultura restantes na geladeira para trocar os meios durante a semana para se preparar para o corte do cérebro. Despeje cerca de 10 mililitros de solução de corte a frio do copo de 50 mililitros em um copo de 25 mililitros sob a coifa a vácuo.

Após anestesia e decapitação, remova o cérebro de um dia pós-natal, oito a 10 ratos. Lave o cérebro no béquer contendo 30 mililitros de solução de corte a frio por cerca de 30 segundos. Em seguida, transfira cuidadosamente o cérebro para o copo de 25 mililitros.

Troque as luvas e sature-as com etanol. Em seguida, carregue o cérebro na solução de corte a frio para a capela de fluxo laminar. O próximo passo é orientar e bloquear o cérebro removendo o cerebelo e o pólo frontal e fazendo um corte sagital médio parcial, cole o cérebro bloqueado no palco com o córtex frontal para cima.

Faça cortes adicionais de bisturi conforme necessário para restringir o tamanho das fatias. Em seguida, coloque o palco com o cérebro na câmara de corte de metal esterilizado. Prenda ao cortador de tecido vibratório.

Encha o banho com solução de corte borbulhante gelada. Despeje 30 mililitros da solução de corte restante em um copo de 50 mililitros e borbulhe com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Este copo será usado para coletar as fatias.

Corte fatias coronais de 250 mícrons do córtex parietal frontal. Colocar pelo menos seis fatias no pico de 50 mililitros que contém a solução de corte. Em seguida, coloque cerca de dois mililitros de mídia de lavagem em uma placa de Petri de 35 milímetros.

Usando uma pipeta cortada, transfira as fatias da solução de corte para a placa de Petri contendo o meio de lavagem. Lave as fatias três vezes com pipetas novas para adicionar o meio e aspirar as soluções residuais após a lavagem, transfira as fatias para a placa de Petri de 35 milímetros contendo o meio de cultura. Em seguida, remova as tampas da embalagem para as inserções de malha, mas deixe as inserções nas embalagens.

Em seguida, use uma pinça para levantar uma inserção de malha de sua embalagem usando uma pipeta de transferência cortada. Transfira uma fatia do meio de cultura para a malha. Insira e posicione a fatia no meio da membrana usando uma pipeta de transferência intacta.

Remova qualquer excesso de meio de cultura. Agora. Coloque a inserção de malha com sua fatia em um dos poços cheios de fluido da placa de seis poços. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar sob a malha depois de colocar uma fatia em cada um dos poços cheios de fluido.

Coloque as placas de seis poços de volta na incubadora e incube a 37 graus Celsius por cerca de uma hora. Enquanto isso, limpe a área de trabalho sob a capela de fluxo laminar em preparação para a transfecção. O próximo passo é carregar a pistola genética BioRad Helios, deixando a primeira posição livre.

Carregue um cartucho contendo balas revestidas com CD NA em todas as outras posições do suporte do cartucho da arma genética. Em seguida, coloque o suporte do cartucho na pistola genética. Primeiro, limpe a arma disparando um cano sem balas.

Em seguida, avance o cano para um cartucho contendo CDNA. Balas. Pegue as placas de seis poços da incubadora e coloque-as sob a capa de fluxo laminar, segurando a pistola verticalmente logo acima do topo da placa de seis poços, atire uma fatia a 100 PSI, em seguida, avance o cano e limpe-o novamente disparando um espaço em branco. Atire nas fatias restantes com um tiro por fatia.

Após a filmagem, retorne as seis placas de poço para a incubadora e incube as fatias a 37 graus Celsius por dois a sete dias com 5% de dióxido de carbono durante o período de incubação. Substitua a mídia a cada dois dias da seguinte maneira, trabalhando sob a capela de fluxo laminar, adicione uma nova mídia aos três poços desocupados. Em seguida, recoloque a placa de seis poços na incubadora por pelo menos uma hora após uma hora, devolva a placa de seis poços à coifa laminar e use uma pinça curva limpa com etanol para mover cada inserção de malha e sua fatia para um novo poço, aspire a mídia antiga e devolva a placa à incubadora.

Após vários dias de incubação, as fatias estão prontas para gravações de células inteiras. Remova uma placa de seis poços da incubadora sob a capela de fluxo laminar. Use uma pinça curva limpa com etanol para remover uma inserção de malha e sua fatia.

Em seguida, substitua a placa de seis poços na incubadora. Em seguida, transfira a placa de Petri com uma inserção de malha e corte para a área de gravação, aplicando tensão com uma pinça ou um pedaço de metal flexível. Use um bisturi número 11 para cortar a malha ao redor da fatia, se necessário, finalize os cortes finais com a tesoura.

Em seguida, use uma pinça para transferir a fatia e a malha anexada para a câmara de gravação. No palco de um microscópio vertical, banhe a fatia no líquido cefalorraquidiano artificial relacionado ao carbogênio sob óptica IR DIC. Visualize os neurônios parametálicos nas camadas dois, três ou cinco sob epifluorescência e o filtro Fitz.

Localize as células transfectadas verdes sob microscopia IR DIC. Procure as balas CDNA, que aparecem como pequenos pontos pretos dentro das células. Selecione uma célula transfectada para gravação de células inteiras.

Em seguida, avance um microeletrodo para a célula selecionada e use uma sucção suave para obter uma vedação de giga ohm. Em seguida, aplique sucção adicional para invadir a célula inteira. Gravação. A célula agora está pronta para gravações de pinça de corrente ou tensão.

Esta figura mostra uma imagem fluorescente de células transfectadas com CDNA para GFP. As gravações a seguir são tiradas de células transfectadas com CDNA para GFP. Aqui é mostrado um potencial de ação em uma célula parametálica de camada três em resposta a uma injeção de corrente de 10 milissegundos supra limiar.

Esta figura mostra disparos repetitivos de um neurônio parametálico da camada cinco em resposta a uma injeção de corrente de 400 pico amp de dois segundos. Esta figura mostra um registro de grampo de voltagem de um neurônio parametálico da camada cinco. A tetrodatoxina foi usada para bloquear a corrente de sódio dependente de voltagem.

Os traços representam correntes de potássio para fora provocadas por uma família de passos de tensão de 500 milissegundos de um potencial de retenção de menos 70 milivolts. Uma vez dominado, a ligeira preparação e transfecção pode ser feita em cerca de duas horas, incluindo o tempo de preparação. Ao tentar este procedimento.

É importante manter condições estéreis e restringir a espessura e as dimensões da fatia para evitar o ressecamento. Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

Obrigado.