Name: Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a purificar células meióticas de testículo de camundongo com alta pureza usando FACS. Este método combina dissociação enzimática com citometria de fluxo para análise de dinâmica celular e perfis de expressão gênica.

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Este projecto foi apoiado em parte por verbas do Estado da Flórida para Scripps e os números de prêmio R01GM085079 R21HD061304 e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, respectivamente. Este é o número 20917 manuscrito de The Scripps Research Institute.

Este protocolo pode ser separado em duas etapas principais: (1) a dissociação e Hoechst 33342 coloração de células de camundongo testículos seguido, se necessário, (2) FACS triagem das frações relevantes meiótica, incluindo todas as fases da meiose, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas. Depois de coletados, essas populações altamente enriquecido meiótica pode ser usado para uma ampla gama de análise. Este protocolo descreve a dissociação de um testículo adulto; volumes pode ser adaptado para os jovens ou para testes adicionais. 1. Testículo dissociação <ol><li> Coloque um testículo decapsulated em um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 3 ml de Salt Gey do Balance Solução (GBSS) contendo 120 U / ml de colagenase tipo I. </li><li> Adicionar 10 ml de DNAse I (1mg/ml solução estoque em glicerol 50%) e agite-a vigorosamente com a mão até que você veja testicular túbulos começando a dissociar. </li><li> Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C. </li><li> Decantar por 1 min verticalmente em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. </li><li> Repita os passos de 1,2-1,5. </li><li> Adicionar 2,5 ml de colagenase GBSS contendo o tipo I, 50 ul de uma solução de 50mg/ml de ações Tripsina ressuspenso em solução de HCl 1mM, e 10 ml de DNAse I (1mg/ml), e inverter o tubo várias vezes. </li><li> Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C. </li><li> Usando plástico descartáveis ​​pipeta Pasteur com orifício de largura, pipeta suavemente para cima e para baixo por três aglomerados min.No deve ser visível neste momento. </li><li> Adicionar 30 mL de tripsina, 10 ml de DNAse I, 40 mL de Hoechst 33342 ressuspenso em DMSO (10 mg / ml), e inverter o tubo várias vezes. </li><li> Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C. </li><li> Adicionar 400 mL de soro fetal bovino (FCS) e misturar por inversão para inativar a tripsina. </li><li> Coloração final é realizada pela adição de 50 ul de Hoechst 33342 ressuspenso em DMSO (10 mg / ml) e 10 ml de DNAse I (1 mg / ml). </li><li> Agitar horizontalmente em um máximo de 120 rpm por 15 min a 33 ° C. </li><li> A amostra é então dissociado testículo passou por duas GBSS 40 mícrons de pré-filtros descartáveis ​​molhada ao longo de um tubo cônico de 50 ml, então mL 5 de iodeto de propídio (PI) é adicionado e solução amostra é misturada delicadamente por pipetagem várias vezes com Pasteur descartáveis pipeta. </li><li> Amostra é transferida para uma seringa de plástico de 5 ml por meio de uma agulha de calibre 18. O último é substituído por uma agulha de calibre 22 para a entrega da amostra. A seringa é armazenado em gelo e protegido da luz até que esteja pronto para o processamento FACS. </li></ol> 2. FACS Setup e Purificação <ol><li> Classificação foi realizada em um Becton-Dickinson classificador célula Aria IIU. As condições descritas deve ser utilizada como ponto de partida, especialmente quando se usa equipamentos diferentes. Usamos condições anteriormente descritas 7,8. </li><li> Desde o IIU Aria não tem um laser UV, adaptamos o protocolo para a detecção de coloração Hoescht usando um laser violeta 405nm além usamos um laser de 488nm azul para a detecção de dispersão para a frente e lateral. Além disso, alguns filtros foram modificadas, a fim de limitar algumas leakiness laser vermelho, resultando em nitidez enredo melhorou dispersos. </li><li> O laser violeta foi configurado com um passa-banda 450/40nm para a detecção de Hoescht Azul de emissão e um passa-banda 585/42nm para Hoescht emissão Vermelho. Um passe longo 502nm foi utilizado para separar o azul do fluorescência vermelha. </li><li> Um bico M 100 foi usada com uma freqüência disco gota de 28.000 gotas / segundo. A taxa de limiar de amostra foi de aproximadamente 4000 eventos / segundo. A opção de controle de temperatura foi usado para manter a amostra e tubos de coleta a 4 ° C todo o período de classificação. Além disso, o recurso de agitação da amostra foi utilizado em 200 rpm para evitar que a amostra de sedimentação em todo o tipo. </li><li> Normalmente, 02:58 testículos foram processados ​​por seis horas espécie permitindo a coleta de 0,5-2.0x10 6 células de cada população (ver secção representativa). </li><li> A amostra foi classificada em alíquotas de aproximadamente 750μl dispensado da seringa. Enquanto isso, durante estas pausas a tubos de coleta foram mantidas a 4 ° C, protegido da luz, e gentilmente misturado antes da espécie de reinício. </li><li> As amostras classificadas foram coletadas em um tubo de coleta de vidro 12x75mm borosilicato contendo 250μl DMEM suplementado com 10% SFB. </li></ol> 3. Resultados representativos: Um perfil FACS típico é mostrado na Figura 1. Todos os passos principais da meiose são identificados e são indicadas na legenda. Se a Hoechst 33342 mancha não é ideal, o perfil global vai aparecer muito mais compacto e menos definida. Um problema comum que diz respeito não a adição de DNAse suficiente, o que irá induzir aglutinação celular rápida. Adição de DNAse extras em todas as etapas indiciado geralmente resolve este problema. ª congelarawing do estoque de DNAse (armazenadas a -20 ° C) deve ser reduzido ao mínimo, pois isso resulta em rápida perda de atividade enzimática. Spo11 é a endonuclease meiótica que direciona dupla vertente quebra em locais de hotspots de recombinação meiótica 12. A Figura 2 mostra perfis típicos de um testículo Spo11 nulo onde fita dupla ruptura não são formadas, resultando em uma meiose abortiva 12, bem como um pré-puberous perfil de um rato de 13 dias de idade, o que revela a natureza assíncrona da primeira onda de meiose. Análises citogenéticas padrão usando a combinação de proteínas complexas sinaptonêmico 3 (SCP3) e fosforilado anticorpos H2AX histona estágio marcadores específicos de meiose devem ser inicialmente utilizada para confirmar a pureza ea natureza das células classificadas meiótica, como descrito elswhere 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FACS tipo selvagem perfis meiose. A) gráfico de dispersão Representante é mostrado. As células gated são mostrados. Observe a grande quantidade de detritos presentes no testículo adulto contendo principalmente membranas vazio e caudas espermátides. B) A trama mostra o PI representante quantidade muito limitada de células PI positivos presentes em uma amostra. O portão típico é mostrado. C) Um representante do tipo selvagem Hoechst 33342 perfil FACS é mostrado. As várias populações de células meióticas que pode ser purificado usando este método para um estudo mais aprofundado são indicadas: espermatogônias (Sp), pré-leptóteno (PL), leptóteno-Zigóteno (L / Z), early-Paquíteno (PE), de meia-Paquíteno ( MP), late-Paquíteno (LP), diplóteno (D), e volta espermátides (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Spo11 nulo e do tipo selvagem dia 13 perfis meiótica FACS. A) Um perfil Spo11 nulo típico é mostrado com uma clara falha meiótica, onde nenhum momento após o leptóteno / Zigóteno início de paquíteno pode ser detectado. B) O perfil de um de 13 dias de idade do rato do tipo selvagem macho mostra a alta concentração de células leptóteno / Zigóteno. Esta primeira onda da meiose é bastante assíncronas, como claramente visualizado utilizando esta metodologia.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentado permite, simultaneamente, purificar a partir de camundongos machos adultos toda a gama de células estágio meiótico com pureza muito elevado, permitindo que os pesquisadores para estudar a dinâmica deste processo fundamental. Células purificadas podem ser usados ​​para inúmeras aplicações que vão desde extração de RNA 9,10, mapeamento nucleosome 11, detecção molécula recombinante, análises de proteínas, e muitos mais. No entanto, métodos de detecção devem ser adaptadas à...

<table><tbody><tr><td>Colagenase Tipo-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>Dissolver em GBSS até 12.000 U/ml, armazenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>Dissolver em HCl 1 mM até 50 mg/ml, armazenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Solução saturada (10 mg/ml em DMSO), armazenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Dissolver em água/glicerol 50% até 1 mg/ml, armazenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Solução Salina Balanceada de Gey&amp;rsquo;s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Transferência de 6&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação de citometria de fluxo de células de camundongo meiótica

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

A natureza heterogênea de tipos de células nos testículos e na ausência de modelos de cultura de células meióticas foram obstáculos significativos para o estudo dos programas de diferenciação únicos que se manifestam durante a meiose. Dois principais métodos foram desenvolvidos para purificar, em diferentes graus, várias frações meiótica de ambos os adultos e animais jovens: elutriação ou Staput (sedimentação), utilizando BSA e / ou gradientes de Percoll. Ambos os métodos dependem do tamanho das células e densidade para separar células meióticas 1-5. No geral, exceto para populações de células poucos 6, estes protocolos não ceder pureza suficiente das inúmeras populações de células meióticas que são necessários para análises detalhadas molecular. Além disso, com tais métodos geralmente um tipo de células meióticas podem ser purificada em um determinado momento, o que adiciona um nível extra de complexidade quanto à reprodutibilidade e homogeneidade quando se comparam amostras de células meióticas. Aqui, nós descrevemos um método refinado que permite facilmente visualizar, identificar e purificar as células meióticas, a partir de células germinativas de espermátides arredondadas, usando FACS combinado com coloração Hoechst 33342 7,8. Este método oferece um instantâneo global de todo o processo meiótico e permite altamente purificar as células viáveis ​​da maioria fase da meiose. Estas células purificadas podem ser analisados ​​em detalhe para mudanças moleculares que acompanham a progressão através da meiose, por exemplo, mudanças na expressão gênica 9,10 ea dinâmica de ocupação nucleosome em hotspots de recombinação meiótica 11.

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

A natureza heterogênea dos tipos celulares no testículo e a ausência de modelos de cultura de células meióticas têm sido obstáculos significativos para o estudo do...

O objetivo geral do experimento a seguir é purificar de uma só vez e com alta pureza uma ampla variedade de células mitóticas dos testículos de camundongos adultos, a fim de estudar os processos dinâmicos que ocorrem durante este ciclo celular único. Isso é conseguido mediante a dissociação eficiente das células testiculares com uma série de digestões enzimáticas com colagenase e tripsina na presença de DNA, a fim de obter, em um segundo passo, uma suspensão de células testiculares individuais.A suspensão testada é corada com o corante fluorescente vital de DNA Hulk's 3 33 42, o qual permite distinguir vários tipos de células mitóticas com base no conteúdo e na densidade de seu DNA. Em seguida, as células mitóticas são analisadas por meio de classificação de células ativadas por fluorescência, a fim de identificar e purificar todas as frações necessárias para análises posteriores, como análises citogenéticas ou de expressão gênica. São obtidos resultados que demonstram a purificação eficiente de populações de células mitóticas difíceis de obter, com alta pureza, com base em estudos abrangentes de arranjos citogenéticos e de expressão. A principal vantagem deste protocolo baseado em

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Este método descreve a purificação por citometria de fluxo de MEP e MKp de fêmures, tíbias e ossos pélvicos.

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Para obter perícitos corticais cerebrais de camundongo que atendam às demandas do scRNA-seq, apresentamos um protocolo FACS criticamente otimizado baseado na seleção CD13⁺/CD31⁻. Nossos principais aprimoramentos melhoram significativamente a viabilidade celular e a integridade do RNA, permitindo um perfil transcriptômico confiável.

Isolamento de Perícitos de Tecido Cortical de Camundongos Usando FACS para Sequenciamento de Células Únicas

Aprenda a purificar células meióticas de testículo de camundongo com alta pureza usando FACS. Este método combina dissociação enzimática com citometria de fluxo para análise de dinâmica celular e perfis de expressão gênica.

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