Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

O objetivo geral do experimento a seguir é purificar de uma só vez e em alta pureza uma ampla gama de células míticas de testículos adultos de camundongos, a fim de estudar os processos dinâmicos que ocorrem durante esse ciclo celular único. Isso é conseguido dissociando eficientemente as células testiculares com uma série de digestões enzimáticas com colagenase e tripsina na presença de DNA. Um para obter uma suspensão testy de célula única como um segundo passo.

A suspensão irritada é corada com o corante de DNA vivo fluorescente 3 33 42 do Hulk, que permite que vários tipos de células mióticas sejam distinguidos com base em seu conteúdo e densidade de DNA. Em seguida, as células mióticas são analisadas por classificação celular ativada por fluorescência, a fim de identificar e purificar todas as frações necessárias para análises posteriores, como análise citogenética ou de expressão gênica. São obtidos resultados que mostram a purificação eficiente de populações de células mióticas difíceis de obter em alta pureza com base em estudos abrangentes de citogenética e matriz de expressão.

A principal vantagem deste protocolo baseado em fatos sobre os métodos existentes, como centrífuga, literação ou sedimentação por gravidade, é que ele permite coletar no máximo frações mióticas com pureza muito alta. Indivíduos novos neste método terão que combinar conjuntos de habilidades muito diferentes para realizar testes eficientes de dissociação e posição, seguidos de classificação ideal de células, boas interações entre a pessoa que prepara as células e o operador de citometria de fluxo, bem como uma boa compreensão dos fundamentos deste protocolo essencial para o sucesso. Demonstrando o protocolo de dissociação celular estará o Dr.I Gatun, um pós-doutorado sênior em nosso laboratório que melhorou consideravelmente esse protocolo.

BVN Tores. Nosso operador de citometria de fluxo irá guiá-lo através de uma configuração ideal para uma classificação eficiente de células. Neste protocolo, será demonstrada uma dissociação de dois testículos de camundongos adultos, no entanto, os volumes podem ser adaptados de acordo para juvenis ou para testículos adicionais.

Para começar com três mililitros de solução salina balanceada contendo 120 unidades por mililitro de colagenase tipo um no tubo A desassociação eficiente e saborosa é crucial para a coloração correta e o recurso problemático das células. A adição de G nase um suficiente, bem como a colocação do tubo na posição horizontal durante a agitação, é muito importante para a dissociação eficiente do teste. Coloque um testículo encapsulado em um tubo de 15 mililitros.

Adicione 10 microlitros de DNAs um ao testículo e agite o tubo vigorosamente com a mão até ver o túbulo testicular começando a se dissociar Em seguida, coloque e prenda o tubo horizontalmente em um agitador rotativo e agite o tubo a um máximo de 120 RPM por 15 minutos a 33 graus Celsius após 15 minutos, Transvase durante um minuto na vertical à temperatura ambiente. Em seguida, use uma pipeta descartável para descartar o sobrenadante. Adicione três mililitros de solução salina balanceada contendo colagenase tipo um, bem como 10 microlitros de D nase um à amostra.

Novamente, agite o tubo algumas vezes com a mão. Agitar o tubo horizontalmente a um máximo de 120 rpm durante 15 minutos a 33 graus Celsius, como antes, decantar durante um minuto verticalmente à temperatura ambiente e, em seguida, rejeitar o sobrenadante. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de GBSS contendo colagenase.

Tipo um 50 microlitros de tripsina e 10 microlitros de dase. Inverte-se o tubo várias vezes, agite horizontalmente a um máximo de 120 RPM por 15 minutos a 33 graus Celsius. Após a agitação de 15 minutos, use uma pipeta de plástico descartável com um orifício largo para pipetar suavemente a amostra para cima e para baixo por três minutos.

Nenhum aglomerado deve ser visível neste momento. Em seguida, adicione 30 microlitros de tripsina, 10 microlitros de DNAs um e 40 microlitros de Hulks 3 33 42 ressuspensos em DMSO. Inverta o tubo várias vezes.

Agite horizontalmente a um máximo de 120 RPM por 15 minutos a 33 graus Celsius. Quando a agitação da amostra estiver completa, adicione 400 microlitros de soro fetal de bezerro e misture invertendo o tubo para inativar a tripsina. Para realizar a coloração final, adicione 50 microlitros de hoax 3 33 42 e 10 microlitros de DNAs.

Mais uma vez, agite o tubo horizontalmente a um máximo de 120 RPM por 15 minutos a 33 graus Celsius. A amostra de testículo dissociada é então passada por dois filtros descartáveis de 40 mícrons pré-casados com GBSS em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione cinco microlitros de solução de iodeto de propídio à amostra e misture delicadamente pipetando várias vezes com uma pipeta de pasta descartável.

Em seguida, transfira a amostra para uma seringa de plástico de cinco mililitros através de uma agulha de calibre 18. Em seguida, substitua a agulha de calibre 18 por uma agulha de calibre 22 para entrega da amostra. Por fim, guarde a seringa no gelo e proteja-a da luz até que a amostra esteja pronta para o processamento por fax.

Para este experimento, a classificação de células é realizada em uma área de Backin Dixon. Dois, as condições do classificador de células de uso foram adaptadas daquelas usadas anteriormente para um citômetro de fluxo equipado com um laser de argônio ultravioleta de 360 nanômetros e um laser de argônio de 488 nanômetros. Em última análise, a configuração do citômetro de fluxo terá que ser otimizada pelo operador do classificador de células.

Como o Becton Dixon Aria two U não possui um laser UV, o protocolo para detectar a coloração de falcão é adaptado usando um laser violeta de 405 nanômetros. Hooks é animado pelo laser violeta de 405 nanômetros e um laser azul de 488 nanômetros é usado para excitação de PI e detecção de dispersão frontal e lateral. Além disso, os filtros para detecção de hos são modificados para limitar alguns vazamentos de laser vermelho, o que resulta em maior nitidez do gráfico de dispersão.

O laser violeta é configurado com uma passagem de banda de 4 50 40 nanômetros para detecção de emissão azul falsa e uma passagem de banda de 5 85 42 nanômetros para emissão vermelha falsa. Uma passagem longa de 5 0 2 nanômetros é usada para separar a fluorescência azul da vermelha. A diferença de usar dois conjuntos de filtros diferentes é mostrada aqui.

O filtro de 5 85 42 nanômetros fornece populações de células mais compactas do que o filtro de 6 30 30 nanômetros. Portanto, o operador deve estar pronto para tentar diferentes combinações em seu próprio instrumento para obter o melhor compromisso. Um bico de 100 mícrons é usado com uma frequência de acionamento de queda de 28.000 gotas por segundo.

A taxa limite de amostragem é de aproximadamente 4.000 eventos por segundo com uma taxa de fluxo entre um a três para manter maior resolução. Classificar a amostra em alíquotas de cerca de 750 microlitros dispensadas da seringa Durante estas pausas, manter a amostra restante na seringa congelada e protegida da luz. Colete as amostras classificadas em tubos de coleta localizados em borisy de vidro de 12 por 75 milímetros contendo 250 microlitros de DMEM suplementados com 10% FCS.

Para manter a amostra em tubos de coleta a quatro graus Celsius, use a opção de controle de temperatura durante toda a duração da classificação. Além disso, use o recurso de agitação da amostra a 200 RPM para evitar que a amostra sedimente em toda a classificação. Cada vez que uma alíquota da amostra principal é adicionada, é importante também sacudir os tubos de coleta para manter a integridade das células coletadas.

Perfis de fatos representativos são mostrados aqui, onde todas as principais etapas da meiose do tipo selvagem são identificadas neste gráfico de dispersão onde as células fechadas são indicadas, há uma grande quantidade de detritos contendo principalmente membranas vazias e caudas de espermatozóides presentes nos testículos adultos. Um gráfico representativo de iodeto de propídio mostra uma quantidade muito limitada de células positivas para iodeto de propídio presentes na amostra. A marcha típica é indicada neste perfil de fax representativo do tipo selvagem 3 33 42.

As várias populações de células mióticas que podem ser purificadas usando este método para estudos posteriores são indicadas espermatogônias, pré-leptina, leptina, zigotos, pacu, diploteno e round sperate. Esses dois últimos perfis de fatos são de um testículo SPO 11 N e um testículo do tipo selvagem de camundongos de 13 dias de idade. SPO 11 é a endonuclease miótica que direciona a fita dupla quebra seus locais de hotspots de recombinação miótica e, como observado aqui, a ausência de SPO O 11 resulta em uma clara falha miótica porque nenhum estágio após a SRPA inicial do zigoto de leptina pode ser detectado.

Em contraste, o perfil de um camundongo macho do tipo selvagem de 13 dias mostra uma alta concentração de células zigotosas de leptina. Esta primeira onda de miose é bastante assíncrona, como claramente visualizada. Usando esta metodologia Ao realizar este experimento, é importante usar uma quantidade suficiente de DNAs.

A cidade é central para uma classificação sem problemas. Embora os investigadores inicialmente relutem em usá-lo, a adição de DNA reduzirá a viscosidade da amostra e aumentará a separação e coloração celular, além de células intactas não serem danificadas. O método FOX para ação de células máticas pode ser usado em uma ampla gama de aplicações a jusante, como, por exemplo, extração D-N-A-R-N-A para estudar a dinâmica da expressão gênica ou para a técnica de imunoprecipitação da cromatina para estabelecer vários perfis epigenéticos.