Name: Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a modelar hemorragia intracerebral espontânea em camundongos usando injeção estereotáxica de sangue autólogo. Este método minimiza o refluxo sanguíneo e permite estudar patologia cerebral e déficits neurológicos in vivo.

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O trabalho foi financiado por uma bolsa do Instituto de Medicina Translacional e Terapêutica, e uma bolsa de formação do Instituto de Medicina e Engenharia (T32HL007954) da Universidade da Pensilvânia e da Marlene L. Cohen e H. Jerome Fleisch Scholar Grant no University of Connecticut Health Center (LHS) e NIH NS-029331 (FAW).

1. Preparação de equipamentos <ol><li> Limpe o quadro estereotáxico e bomba com etanol 75% para minimizar a contaminação bacteriana. </li><li> Esterilizar Hamilton seringa e agulha de sílica fundida. Nota: Se esterilização química é usado, não se esqueça de lavar várias vezes em água estéril antes do uso. </li><li> Limpe a superfície do papel de cera de parafina com etanol 75% e deixar secar. </li></ol> 2. Preparação de mouse para injeção Nota: Tenha ratos entregues à sua facilidade de animais pelo menos 7 dias antes da cirurgia, que lhes permitam adaptar ao novo ambiente e reduzir o estresse. <ol><li> Pesar do mouse para linha de base pré-operatório. </li><li> Induzir a anestesia com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso e isoflurano até 4% que não respondem a pitada de cauda </li><li> Injetar mouse com buprenorfina por via intraperitoneal 0.1mg/Kg para analgesia pós-operatória </li><li> Raspar couro cabeludo </li><li> Olhos casaco com vaselina estéril </li><li> Prepare couro cabeludo com betadine x 3 wipes, em seguida, permitir couro cabeludo para secar </li><li> Faça um centímetro incisão mediana sagital do couro cabeludo com bisturi cirúrgico estéril Nota: A incisão generosa irá permitir a exposição completa de marcos crânio. </li><li> Shave um centímetro da superfície ventral da cauda com início em 1 cm da base e preparar com betadine x 3 wipes </li><li> Rato lugar no quadro estereotáxico Nota: É importante assegurar mouse está seguro no quadro com a superfície do crânio paralelo com a base do quadro, com excelente exposição do bregma e pelo menos 3 mm à direita do bregma. </li></ol> 3. Cirurgia hemorragia intracerebral Notas: Durante toda a cirurgia o mouse é anestesiado com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso, e 1-3% do isoflurano, foi mantido a 37 ± 0,5 ° C usando um termistor-almofada de aquecimento controlado e monitorado por termômetro retal. <ol><li> Anexar estéril 27 g em 1 agulha de seringa cc no frame. </li><li> Ajuste o braço estereotáxico até agulha é exatamente sobre bregma. </li><li> Ajuste o braço de modo que a agulha é 2,5 milímetros lateral ao bregma e inferiores para a superfície do crânio. </li><li> Manualmente girar seringa para fazer orifício de trepanação na superfície do crânio ao aplicar movimento descendente suave do quadro de tomada de cuidado para não perfurar o crânio completamente. </li><li> Remova a agulha e orifício de trepanação completa manualmente com seringa / agulha Nota: Completando o orifício de trepanação à mão permite o reconhecimento imediato quando tiver perfurado a tabela interna do crânio e minimiza o risco de, inadvertidamente, empurrando agulha no parênquima cerebral. </li><li> Fazer incisão transversal na superfície ventral da cauda utilizando lâmina cirúrgica estéril e permitir 2-3 gotas grandes de sangue arterial a cair sobre o papel de cera de parafina. Em seguida, rapidamente parar o sangramento com pressão usando gaze estéril. </li><li> Retirar 17 mL de sangue em seringa e seringa Hamilton lugar na bomba. </li><li> Ajuste o braço estereotáxico para apontar 5 ° medialmente em relação ao eixo vertical. </li><li> Ajustar cuidadosamente o braço estereotáxico de forma que a ponta da agulha está sobre o orifício de trepanação no crânio e abaixe agulha de 3,5 mm. </li><li> Aguarde 2 minutos, em seguida retire a agulha 0,5 mm (de modo que a ponta é de 3 mm de profundidade) </li><li> Espere 5 minutos para permitir que o cérebro re-expansão ao redor da agulha e minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de inserção da agulha durante a injeção. </li><li> Injetar mL de sangue 1 / minuto para 7,5 mL. </li><li> Espere 5 minutos para permitir que o sangue inicial de coagulação e de mudanças do tecido ocorrer para minimizar a elevação da pressão intracraniana. </li><li> Injetar a 7,5 mL restantes de 1 mL / minuto </li><li> Permitir agulha para permanecer no local por 25 minutos para permitir a coagulação do sangue Nota: Não esperar até que a coagulação do sangue irá resultar em refluxo de sangue até o local de inserção de agulha para retirar a agulha </li><li> Lentamente, retirar a agulha e lave imediatamente com água quente para evitar qualquer sangue residual na agulha de coagulação e garantir a reutilização da agulha. </li><li> Remova o mouse a partir do quadro e fechar o rabo e incisões no couro cabeludo com cola cirúrgica veterinária. </li><li> Desligue a anestesia. </li><li> Permitem mouse para despertar ao ser aquecido continuamente com acesso gratuito à umedecido alimentos. </li><li> Retorno do mouse para gaiola com littermates quando totalmente acordado. Lugar úmido alimentos pelota no fundo da gaiola para ajudar os animais no acesso aos alimentos. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Secção coronal do cérebro do rato 15 minutos após a cirurgia ICH. Imediatamente após o sacrifício do cérebro foi inspecionado por ICH sucesso com base na inspeção bruta de uma seção coronal no local de inserção da agulha. Hemorragias que rastreou até a base do cérebro, a pista agulha após o corpo caloso, ou para os ventrículos foram consideradas mal sucedidas e que o mouse foi eliminado de todas as análises. Geral ICH succetaxas ss foram 75-85%, em 50 ratos com mortalidade de 0%. <img src="/files/ftp_upload/2618/2618fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Testar Cilindro demonstra hemiparesia esquerda após ICH gânglios basais direito. (A) traseira do mouse Amostra após a cirurgia ICH. Observe a colocação de apenas forelimb o direito sobre a parede do cilindro após ICH gânglios basais esquerdo. (B) Gráfico de testes cilindro 1 resultados da coorte de camundongos após ICH cirurgia (n = 5) em comparação com placebo (n = 4). Ratos Sham tiveram todos os procedimentos, exceto a injeção de sangue (agulha foi inserida no cérebro). Cada rato foi colocado em uma de 12 cm de diâmetro do cilindro de vidro claro e observado por 20 partes traseiras. A colocação inicial dos membros anteriores na parede do cilindro foi marcado por de trás. Movimentos posteriores (como a exploração lateral) não foram marcados até o rato voltou para o solo ea parte traseira próxima marcado. O índice foi calculado como a lateralidade (direita # colocações forelimb no lado do cilindro - # deixou colocações forelimb) / (# # direito + esquerdo + # ambos), onde 0 indica nenhuma preferência forelimb e 1 indicado apenas forelimb o direito foi usado .

<ol><li>Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Tests+After+Intracerebral+Hemorrhage+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat.</a> Stroke. 33, 2478-2484 (2002).</li>
<li>James, M., Warner, D., Laskowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+of+Intracerebral+Hemorrhage%3A+A+Translational+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocritical+Care%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective.</a> Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).</li>
<li>Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Model+of+Warfarin-Associated+Intracerebral+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage.</a> Stroke. 39, 3397-3404 (2008).</li>
<li>Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+hemorrhage+in+mice%3A+model+characterization+and+application+for+genetically+modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).</li>
<li>Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+autologous+blood+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion.</a> Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).</li>
<li>Wang, J., Fields, J., Doré, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+improved+preclinical+mouse+model+of+intracerebral+hemorrhage+using+double+infusion+of+autologous+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood.</a> Brain Research. 1222, 214-221 (2008).</li>
<li>Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoma+resolution+as+a+target+for+intracerebral+hemorrhage+treatment%3A+Role+for+peroxisome+proliferator-activated+receptor+%CE%B3+in+microglia%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages.</a> Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este modelo cirúrgico da hemorragia intracerebral em camundongos, utilizando a cauda resultados autólogo de sangue arterial em um modelo reprodutível de hemorragia espontânea gânglios basais. Um modelo em camundongos ICH oferece a vantagem da disponibilidade de animais transgênicos para investigar fisiopatologia, no entanto, seu pequeno tamanho faz com que procedimentos neurocirúrgicos mais tecnicamente difícil do que em animais maiores. O modelo de colagenase e o modelo de injeção de sangue...

Estereotáxica para neurocirurgia mouse (Stoelting, 51.925) Bomba Microinfusion e processador (UMP-3 e MICRO4, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL) Rato mais quente (Stoelting, 50300) Anestesia inalatória do mouse (Braintree Científico, EZ-AF9000) 25 mL estanques borosilicato seringa Hamilton com êmbolo revestido e sem agulha (Hamilton empresa, Reno, NV, seringa 1702RN: 765401, ponteira: 30949, espaçador: 30946) agulha de sílica fundida corte a 2 cm de comprimento (Hamilton, 17.739) * Nota Hamilton seringa e agulha de sílica fundida pode ser reutilizada para múltiplas cirurgias se esterilizados antes de cada cirurgia. Estes materiais são cruciais para evitar a coagulação do sangue. Luvas cirúrgicas estéreis Bata cirúrgica, gorro e máscara Betadine Etanol 75% estéril 27 g de agulhas (uso individual) estéril seringa cc 1 (uso individual) lâmina cirúrgica estéril Cidex água estéril buprenorfina e isoflurano gaze esterilizada parafina quadrados de papel de cera Cola cirúrgica veterinária (Vetbond, 3M, St. Paul, MN)

injeção de sangue autólogo de modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

A investigação da fisiopatologia da lesão após hemorragia intracerebral (HIC) exige um modelo animal reprodutível. Embora a HIC represente 10-15% de todos os acidentes vasculares cerebrais, ainda não existe uma terapia específica eficaz. O modelo de injeção autóloga de sangue em camundongos envolve a injeção estereotáxica de sangue arterial na região dos gânglios basais, simulando uma hemorragia hipertensiva espontânea no ser humano. A resposta à hemorragia pode então ser estudada in vivo e os déficits neurocomportamentais podem ser quantificados, permitindo a descrição da patologia resultante e a avaliação de agentes terapêuticos potenciais. O procedimento descrito neste protocolo utiliza a técnica de dupla injeção para minimizar o risco de refluxo sanguíneo ao longo do trajeto da agulha, não utiliza anticoagulantes no sistema de bombeamento e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.

O modelo de injeção de sangue autólogo de hemorragia intracerebral em camundongos descritos neste protocolo usa a técnica de injecção dupla para minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de agulha, não anticoagulantes no sistema de bombeamento, e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

A investigação da fisiopatologia da lesão após hemorragia intracerebral (HIC) requer um modelo animal reprodutível. Embora a HIC represente 10-15% ...

O objetivo geral deste procedimento é modelar hemorragia intracerebral espontânea no camundongo para estudar in vivo a patologia duradoura e os resultados neurocomportamentais. Isso é realizado primeiramente preparando o camundongo para cirurgia. A cauda ventral e o couro cabeludo são raspados e limpos.Em seguida, utilizando os pontos de referência do crânio, é feito um furo de trepanação precisamente posicionado através do crânio. Em terceiro lugar, o sangue é retirado da artéria da cauda e injetado estereotaxicamente nos gânglios basais. A agulha de injeção é então cuidadosamente removida e a incisão é fechada.No final, podem ser obtidos resultados que demonstram inflamação localizada, morte celular e déficit neurológico por meio de imunohistoquímica, citometria de fluxo e testes funcionais, entre outros métodos. Em geral, pesquisadores novos no procedimento terão dificuldades com a coagulação sanguínea, pois a pequena quantidade de sangue injetada coagulará no sistema durante o tempo necessário para realizar a injeção. Após induzir anestesia com isoflurano, raspe o couro cabeludo e limpe a pele com Betadine três vezes.Em seguida, cubra os olhos do animal com vaselina estéril. Ap

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Modelos animais clinicamente relevantes de hemorragia intracerebral (ICH) são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre AVC hemorrágico e para analisar novas estratégias terapêuticas. Neste estudo, descrever e avaliar dois modelos ICH que implementam injeções unilaterais de tanto sangue autólogo todo ou colagenase bacteriana no gânglio basal (corpo estriado) de camundongos.

Hemorragia modelagem intracerebral em camundongos: Injeção de sangue autólogo ou colagenase bacteriana

Este vídeo demonstra o procedimento para estabelecer um modelo de rato com hemorragia subaracnoide. Um rato anestesiado é implantado com sondas para medir a pressão intracraniana e o fluxo sanguíneo cerebral. O local alvo é identificado e a agulha é inserida em uma posição pré-quiasmática. O sangue autólogo é então injetado no espaço subaracnóideo, aumentando a pressão intracraniana e diminuindo o fluxo sanguíneo cerebral, estabelecendo o modelo.

Estabelecendo um modelo de rato com hemorragia subaracnóidea induzida por injeção autóloga de sangue

Fonte: Tang, X. et. al., Hemorragia Pontina Maciça por Injeção Dupla de Sangue Autólogo. J. Vis. Exp. (2021)Este protocolo descreve a infusão controlada de sangue autólogo na região pontina do cérebro de um rato para modelar hemorragia pontina maciça. O objetivo é simular um sangramento cerebral localizado aumentando a pressão localizada.

Induzindo hemorragia pontina maciça em um modelo de rato por injeção de sangue autólogo

Um modelo de rato padronizado de hemorragia subaracnóide por Círculo intraluminal de Willis perfuração é descrito. Perfuração de vasos e hemorragia subaracnóide são monitorados pela monitorização da pressão intracraniana. Além disso os vários parâmetros vitais são registadas e controlada para manter as condições fisiológicas.

Um modelo murino de hemorragia subaracnóide

Modelos pré-clínicos de hemorragia intracerebral são utilizados para imitar certos aspectos da doença clínica. Assim, mecanismos de lesão e potenciais estratégias terapêuticas podem ser explorados. Neste protocolo, dois modelos de hemorragia intracerebral são descritos, injeções intraestriatais (gânglios da base) de sangue autólogo ou colagenase.

Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

Descrevemos neste protocolo um modelo de rato de hemorragia subaracnóide padronizada (SAH) por uma dupla injeção de sangue total autólogo na cisterna magna. O alto grau de padronização do procedimento de dupla injeção representa um modelo médio-agudo de HAS com relativa segurança em relação à mortalidade.

Dupla injeção direta de sangue na Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnóide

Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato através de dupla injeção de sangue autólogo.

Hemorragia pontina maciça por dupla injeção de sangue autólogo

A hemorragia subaracnóidea continua a carregar uma alta carga de mortalidade e morbidade no homem. Para facilitar novas pesquisas sobre a condição e sua fisiopatologia, um modelo pré-quiasmático de injeção única é apresentado.

Pré-quiasmática, injeção única de sangue autólogo para induzir hemorragia subaracnóidea experimental em modelo de rato

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona.

Métodos para caracterizar espontânea e surpreender-induzida Locomotion em um modelo de doença de Parkinson induzida por Rotenone de<em&gt; Drosophila</em

Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.

Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

Aprenda a modelar hemorragia intracerebral espontânea em camundongos usando injeção estereotáxica de sangue autólogo. Este método minimiza o refluxo sanguíneo e permite estudar patologia cerebral e déficits neurológicos in vivo.

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

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