Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar e quantificar a sinalização BMP em células de cultura tecidual. As BMPs ligam-se a receptores na superfície celular e FOSFORILAM três efetores Smad: Smad1, Smad5 e SMAD8. Esses formam complexos com o Smad4 e translocam para o núcleo, onde coordenam a transcrição.

Aqui utilizamos o PLA para visualizar complexos formados entre os efetores SMA endógenos e o smad quatro em células de cultura de tecidos com ou sem estimulação por BMP. O procedimento inicia com o uso paralelo de dois anticorpos primários, um dos quais reconhece os três efetores SMA fosforilados e o outro reconhece o smad quatro. Os anticorpos secundários, denominados sondas PLA, cada um com uma sequência curta de DNA ligada, ligam-se aos anticorpos primários quando as sondas PLA estão em proximidade. As sequências de DNA interagem mediante a adição subsequente de dois oligonucleotídeos de DNA formadores de círculo.

Esses são unidos por ligação enzimática e formam um círculo que é amplificado por meio da replicação em círculo rolante após a reação de amplificação. A hibridização de sondas oligonucleotídicas complementares marcadas destaca os pontos fluorescentes do produto associados à amplificação de cada molécula circularizada. Os produtos de DNA são facilmente visíveis.

Quando visualizados em um microscópio de fluorescência, os pontos correspondem a complexos entre efetor, seds e smad quatro, que indicam sinalização BMP ativa na célula. As principais vantagens do PLA em relação aos métodos existentes são sua facilidade de uso, alta sensibilidade, ausência de fundo e a possibilidade de quantificar a sinalização BMP ativa in situ. A via BMP é essencial para o desenvolvimento de diversos órgãos e tecidos e para processos como proliferação e diferenciação de células-tronco.

O PLA pode ser usado para responder perguntas fundamentais sobre a dinâmica, os níveis e a localização subcelular da sinalização BMP, mas também pode ser empregado para diagnóstico. Como essa via está envolvida em diversas doenças, o PLA pode ser utilizado para estudar outros componentes da transdução de sinais da via BMP ou de outras vias, e pode ser adaptado para funcionar em cortes de tecidos ou embriões inteiros. Para iniciar o ensaio de ligação por proximidade in situ, prepare culturas celulares: células Neuro2A são cultivadas em GMEM suplementado com 10% de FBS, ácidos aminoácidos não essenciais na concentração de 1×, piruvato na concentração de 1× e L-glutamina na concentração de 1×.

Divida as células usando tripsina e plaque de 15.000 a 20.000 células por poço. Em uma lâmina de câmara de 16 poços, incube as células a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas.

Substitua o meio de cultura por GMEM livre de soro suplementado e incube por mais duas a três horas para os controles. Mantenha três poços com células em cultura e condições normais após a segunda incubação. Iniba a via BMP tratando as células com dois micromolares de dorsa morfina ou induza a sinalização tratando as células com BMP4 por 10 a 60 minutos.

Após a estimulação celular, aspire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS para evitar a dessanexação celular. Não pipete o PBS diretamente sobre as células. Em seguida, aspire o PBS e remova as câmaras, mas mantenha o silicone ao redor dos poços.

Adicione 50 microlitros de paraformaldeído a 4%, recém-preparado e filtrado, aos poços e incube por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Após a fixação, lave as células com PBS por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação em um frasco Coplin. Repita a lavagem duas vezes, totalizando três lavagens.

Em seguida, permeabilize as células com Triton X-100 0,5% em PBS em um frasco de Coplin e incube-as por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, lave as células com tween 20 0,05% e TB S3 vezes por cinco minutos por lavagem com agitação em um frasco de acoplamento. Inicie o procedimento de bloqueio batendo levemente na lâmina para remover a solução final da lavagem.

Tendo cuidado para não deixar as células secarem. Adicione uma gota de DUO link à solução bloqueadora em cada poço. Incube as células na solução bloqueadora por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida, composta por uma caixa vazia de ponteiras com água destilada.

Para preparar as soluções de anticorpo primário, dilua o anticorpo anti-fosfo-SMAD 1 5 8 e o anticorpo anti-SMAD 4 um para 100 no diluente de anticorpos Duo Link 2. Utilize cada anticorpo separadamente e em combinação. Agora, bata levemente na lâmina para remover a solução bloqueadora e adicione 40 microlitros das soluções de anticorpo aos poços apropriados; um controle negativo com apenas o diluente pode ser incluído.

Realize este passo rapidamente para que as células não sequem. Incube agora as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por uma hora. Durante a incubação, dilua as duas sondas PLA no diluente.

Para cada reação, misture oito microlitros de cada sonda e 24 microlitros de diluente, de modo que as sondas sejam diluídas na proporção de um para cinco na solução. Após a incubação de uma hora, remova a solução do anticorpo primário batendo levemente e lave as lâminas duas vezes com o Duo link para o Tampão de Lavagem A, durante cinco minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação em um frasco de acoplamento. Quando as lavagens estiverem concluídas, remova o restante do tampão de lavagem A das lâminas batendo levemente e adicione 40 microlitros da solução de sonda PLA a cada uma.

Agora, incube as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida. Por uma hora, th o duo link para o estoque de ligação e prepare um volume para a mistura de ligação. Primeiro, vortexe o duo link para o estoque de ligação e dilua-o para uma vez em água de alta pureza.

Leve em consideração que a enzima Ligase é adicionada na diluição de um para 40 nesta solução e que são necessários 40 microlitros da mistura por poço. Após a incubação, remova delicadamente a solução do PLA probe das lâminas e lave-as duas vezes com Tampão de Lavagem A por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação em um frasco de acoplamento. Durante a última lavagem, retire o Duo link Ligase de um bloco congelado e adicione-o à solução de ligação até a diluição final de um para 40 e vortexie.

Agora, remova o volume final do Tampão de Lavagem A das lâminas e adicione 40 microlitros da ligação. Misture com a enzima em cada uma delas. Incube as lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecida por 30 minutos.

Descongele o estoque de amplificação DUO link a 37 graus Celsius e prepare para a etapa de amplificação durante a incubação, diluindo o estoque de amplificação DUO link em água de alta pureza até uma concentração de um vezes. Mantenha os reagentes protegidos da luz, pois são sensíveis à luz. Quando a etapa de ligação for concluída, remova a solução batendo levemente e lave as lâminas duas vezes com Tampão de Lavagem A por dois minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação em um frasco de acoplamento; durante a última lavagem, adicione a polimerase duo link à solução de amplificação até uma diluição final de 1:280 e vortexie. Após remover o tampão de lavagem batendo levemente, adicione 40 microlitros da mistura de amplificação a cada poço e incube as lâminas em uma câmara úmida pré-aquecida e escura por 100 minutos a 37 graus Celsius.

Após a conclusão da incubação de amplificação, remova a solução de polimerase das lâminas e lave-as duas vezes em tampão de lavagem B, durante 10 minutos por lavagem, com agitação em um frasco de acoplamento; mantenha as lâminas protegidas da luz nesta etapa, pois os reagentes são sensíveis à luz. Após as duas lavagens, mergulhe brevemente em 0,1 vezes o tampão de lavagem B. Remova completamente o silicone da lâmina de 16 poços e, então, adicione aproximadamente 40 microlitros do duo.

Ligue o meio de montagem com dappy a uma lamínula e coloque-a suavemente sobre as amostras, pressionando levemente para que não haja bolhas de ar sob a lamínula. Fixe e selar a lamínula sobre a lâmina utilizando esmalte de unha, deixando secar por pelo menos 15 minutos antes da aquisição de imagens. Estas são imagens confocais de células que foram tratadas com dois micromolares de dorsa morfina, um inibidor da via BMP, ou tratadas com 25 nanogramas por mililitro de BMP quatro durante 60 minutos.

Anticorpos contra a proteína Smad 1 58 fosforilada e Smad quatro foram utilizados para detectar os complexos Smad ativos e são observados como pontos vermelhos. Os núcleos celulares foram corados em azul com DAPI. Os sinais de PLA foram contados com o software DUO link image tool e o número médio de pontos no núcleo por célula é apresentado no gráfico.

Nenhuma marcação é observada quando qualquer anticorpo primário é usado isoladamente, indicando que não há sinal de fundo dos sondas PLA e subsequente ligação dos oligonucleotídeos. Da mesma forma, nenhuma mancha é detectada em outro controle negativo que contém ambos os anticorpos primários. Em células neuro dois A, a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de imunoblot revela SMAD 1 5 8 fosforilado em células não tratadas e em células tratadas com BMP.

No entanto, os níveis de smad fosforilada são acentuadamente reduzidos nas células tratadas com morfina dorsal. O anticorpo contra PCNA fornece um controle de carga. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como seguir os passos e a configuração que sugerimos para obter resultados em menos de seis horas após a fixação das células.

Em resumo, os passos são bloqueio, incubação com anticorpo primário, incubação com sonda PLA, amplificação por ligação e montagem para imagem.