Name: Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprenda a detectar sinalização de BMP4 em células Neuro 2A usando ensaio de ligadura de proximidade in situ. Este método permite quantificar complexos de efeitos ativados em biologia celular.

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Esta pesquisa é financiada pelo MRC e as subvenções BBSRC. Agradecemos a Agata Zieba e Katerina Pardalis no laboratório de Ulf Landegren, Uppsala University para ajudar com a criação da técnica e conselhos úteis. Olink Biosience para ajuda técnica e apresentação.

1. Chapeamento de Células e Tratamento com BMP <ol><li> Células de cultura em Neuro2a GMEM suplementado com 10% FBS, 1x Non-aminoácidos essenciais (NEAM), 1x piruvato de sódio e 1x L-glutamina. Dividir as células usando tripsina (0,05%-EDTA) e placa de 15,000-20,000 células por poço em um slide de câmara de 16 também. Cultura HEK293T ou Cos7 células em DMEM suplementado com 10% FBS, 1x L-glutamina e penicilina 1x / estreptomicina. Esterilizar slides polysine por imersão em etanol 70% e usando caneta Immedge empate 1 cm 2 poços. Dividir as células usando tripsina (0,05%-EDTA) e placa de 20,000-25,000 células por poço em 50 mL médio. </li><li> Incubar as células a 37 ° C em um umidificado, 5% CO 2 incubadora. </li><li> Após 24 h substituir o meio com soro livre GMEM (suplementado com 0,1% de albumina, NEAM 1x, 1x piruvato de sódio e 1x L-glutamina) para Neuro2a ou com soro livre DMEM (suplementada com L-Glutamina e penicilina 1x / estreptomicina) para HEK293T / Cos7 e incubar as células por 2-3 h. Manter três poços com células em condições de cultura normal (ou seja, 10% FBS) para uso como controles. </li><li> Tratar as células com dorsomorphin (inibidor da via BMP, 2 mM) ou BMP4 (25 ng / ml) para o tempo desejado (por exemplo, para h 10 min-1) 5. </li></ol> 2. Fixação e permeabilização <ol><li> Prepare o fixador, PFA 4%. Pesar 4 g de PFA para preparar uma solução de 4% em 100 ml PBS. Aquecer a solução a 50 ° C até que fique claro. Filtrar a solução através de um filtro 0,22 mm e armazenar a 4 ° C até o uso. Use fixador fresco (não armazenados por mais de 2 dias). </li><li> Aspirar o meio dos poços e lavar com 1xPBS. Não pipete as soluções diretamente sobre as células, pois isso pode resultar em descolamento das células. Antes de ir para a próxima etapa, se slides câmara são usados ​​remover as câmaras, mas deixar o silicone em torno dos poços. </li><li> Adicionar 50 ul PFA 4% e incubar por 10 minutos, à temperatura ambiente, sem agitação. </li><li> Lavar as células com PBS por 3 x 5 min em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Tratar as células com 0,5% Triton X-100 em PBS por 10 min, sem agitação à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com Tween 0,05% 20 em TBS (TBS-T) por 3 x 5 min em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Bloqueio <ol><li> Torneira da TBS-T. Adicione uma gota de solução de bloqueio Duolink II (1x) por poço. </li><li> Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 4. Anticorpos primários <ol><li> Misturar e diluir aP-Smad1/5/8 (coelho policlonal) em 1:100 e a-Smad4 (mouse monoclonal) a 1:100 na II anticorpos Duolink Diluente (1x). Prepare também aP-Smad1/5/8 e-Smad4 sozinho nas mesmas concentrações para ser usado para controles. </li><li> Torneira a solução de bloqueio dos slides. Remover o bloqueio solução muito possível, mas tomar cuidado extra para não deixar que as células secas antes de adicionar o anticorpo. Adicionar 40 mL das soluções de anticorpos aos poços. Em um poço adicionar Diluente de anticorpos apenas como um controle negativo adicional. </li></ol> 5. Sondas PLA <ol><li> Diluir as duas sondas PLA (Duolink II anti-Mouse MINUS e Duolink II anti-coelho PLUS) 1:05 em diluente de anticorpo. </li><li> Torneira a solução anticorpo primário do slides. Lavar as lâminas duas vezes 5 min cada um com 1x Duolink tampão de lavagem II A em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução PLA sonda (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 1 hora a 37 ° C. </li></ol> 6. Ligadura <ol><li> Vortex da Duolink estoque Ligadura II (5x) e diluir 1:5 em água de alta pureza e misturar. Ao calcular o volume de água, levar em conta o volume da Ligase que será adicionado a uma diluição final de 1:40, pouco antes da adição da mistura aos poços. </li><li> Torneira a solução sonda PLA do slides. Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x A por 2 vezes 5 minutos cada um em uma jarra de Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Retire o Ligase do congelador usando um bloco de congelamento (-20 ° C). Adicione o Ligase à solução Ligadura (elaborado em 6.1), com uma diluição de 1:40 e vortex. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução Ligadura Ligase-a cada poço (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido por 30 min a 37 ° C. </li></ol> 7. Amplificação Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Diluir o Duolink estoque Amplificação II (5x) 1:5 em água de alta pureza e misturar. Ao calcular o volume de água ter em conta o volume do Polymerase que será adicionado a uma diluição final de 1:80, pouco antes da adição da mistura para poe poços. </li><li> Torneira a solução Ligadura Ligase a partir do slides. Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x A por 2 vezes com 2 min cada um em uma jarra de Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Retire a polimerase do freezer usando um bloco de congelamento (-20 ° C). Adicione o Polimerase para a solução de amplificação (elaborado em 7.1) na diluição de 1:80 e vortex. </li><li> Toque fora do tampão de lavagem A partir dos slides e adicionar a solução de amplificação da Polimerase para cada poço (40 mL / poço). Incubar as lâminas em câmara úmida pré-aquecido para 100 min a 37 ° C. </li></ol> 8. Preparação para a imagem Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Torneira a solução de amplificação da Polimerase a partir do slides e lavar por 2 vezes a cada 10min em 1x Duolink II Wash Buffer B em um frasco Coplin com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Mergulhar as lâminas em 0,1 x Wash Buffer B. </li><li> Remover o silicone a partir do slide 16 bem completo. Adicionar ~ 40μl da II Duolink Meio de Montagem com DAPI na lamela e gentilmente coloque-o sobre as amostras pressionando-o ligeiramente de modo que não há bolhas de ar sob a lamínula. Fix e selar a lamela no slide utilizando unha polonês. Esperar pelo menos 15min antes de proceder à imagem. </li><li> Analisar as amostras com um microscópio confocal ou fluorescência. Obtenção de imagens digitais. </li></ol> 9. Quantificação Nota: Light reagentes sensíveis. Manter os slides protegido da luz. <ol><li> Use Duolink ImageTool para contar os sinais nas imagens para obter uma medição do nível de sinalização. </li><li> Compare as medidas e fazer um gráfico. </li></ol> 10. Resultados representante O resultado de um experimento em PLA situ mostra como discretos pontos fluorescentes. A localização do sinal depende das proteínas específicas estudadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. PLA situ em células Neuro2a após a estimulação BMP4. Células foram tratadas com 2 mM dorsomorphin (inibidor da via BMP) (A) ou 25 ng / ml BMP4 (B) por 60 min ou não tratada (CE). Anticorpos contra P-Smad1/5/8 e Smad4 foram usados ​​para detectar os complexos ativos em A e B. Os anticorpos primários aP-Smad1/5/8 sozinho (C) e a-Smad4 sozinho (D) ou omissão do primário anticorpos (E) foram utilizados como controle. Azul: DAPI; Vermelho: sinal de PLA. Imagens foram obtidas com um microscópio confocal Leica SP5. (F) Os sinais de PLA foram contados com o software ImageTool Duolink eo número médio de manchas no núcleo por célula é apresentado no gráfico. (G) células Neuro2a foram deixados sem tratamento ou tratados com Dorsomorphin (2 mM) ou BMP4 (25 ng / ml) por 60 min. As células foram lisadas e as proteínas foram submetidas a SDS-PAGE e analisadas por immunoblotting com aP-Smad1/5/8 e PCNA-como o carregamento de controle. (*) Banda não específico. Note que o anticorpo aP-Smad1/5/8 não pode distinguir entre os 3 diferentes proteínas presentes no complexo com Smad4.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela OLINK que faz um reagente utilizado no procedimento de ensaio proximidade ligadura.

A visualização de complexos de proteínas in situ está em grande demanda, especialmente para estudos na sinalização onde a interação de proteínas e modificação de proteínas são os meios que as células usam para o envio de um sinal de sua superfície para o núcleo. Não foi possível visualizar e quantificar complexos entre duas proteínas endógenas in situ por imunofluorescência antes. Co-localização de anticorpos apresenta baixa resolução e não pode ser usado para visualizar verdadeira interação. PLA é uma nova técnica que os pesquisadores começaram a usar em diferentes sistemas com grande sucesso 6, 7. Aqui, demonstramos como usar PLA não só de visualizar, mas também para quantificar complexos endógenos entre effectors Smad ativada a jusante de estimulação BMP ao longo do tempo. Nós usamos células do tecido diferente de cultura, incluindo Neuro2a e contou com anticorpos comerciais levantadas em diferentes espécies (rato e coelho-Smad4 aP-Smad1/5/8) para alcançar este (fig. 1). Este método permitiu, pela primeira vez, para ver a ativação de BMP-efetoras complexos ao longo do tempo e não apenas a presença do Smad1/5/8 fosforilada, que não podem ser todos envolvidos em complexos ativos com Smad4. Nós contamos os sinais (fig. 1F) e comparou a medida com a quantificação obtida immunoblot das mesmas células 8 (figura 1G). Concluiu-se que o número de pontos fornecem uma medida exata comparativa dos níveis de sinalização ao longo do tempo. A técnica também foi aplicado em linhas de outra célula (HEK293T e Cos7) com resultados semelhantes (dados não mostrados). O princípio da tecnologia é baseada em duas sondas exclusivas fornecidas com o kit Duolink. Cada sonda PLA consiste de um anticorpo secundário ligado a um oligonucleotídeo sintético única, que atua como repórter. A proximidade das sondas de DNA permite a ligadura no local exato onde essas sondas encontram-se em proximidade. A distância do oligonucleotides, que permite a hibridização de DNA e ligadura é pequeno (40nm &lt;) e, portanto, apenas as proteínas que interagem pode permitir ligadura. O DNA ligado pode então ser amplificado e detectado com hibridização de oligonucleotídeos rotulado da seqüência amplificada. A amplificação é específico, uma vez que depende de princípios hibridização DNA-DNA e também fornece alta sensibilidade como o DNA é amplificado ligado várias vezes, resultando em melhoria do evento ligadura inicial. O DNA amplificado é detectado por hibridização com oligonucleotídeos marcados e produz um local visível e bastante grande. Como as manchas podem ser contados, o sinal PLA fornece não só a informação exata espacial (o local dos eventos de interação), mas também uma forma objetiva de quantificar esses eventos 2-4. Outras técnicas que são empregadas para a detecção de interações proteína incluem co-imunoprecipitação, imunofluorescência e transferência de energia fluorescente ressonância (FRET). Co-imunoprecipitação ensaios são amplamente utilizados permitindo o isolamento de complexos de proteínas. O método é acompanhado por immunoblotting o que significa que as proteínas devem ser expressas em níveis relativamente elevados, a fim de ser detectado. Problemas de fundo elevado ou ligação não específica de algumas proteínas que as contas são por vezes difíceis de superar, em co-imunoprecipitação. Além disso, co-imunoprecipitação ensaios permitem a detecção de proteínas que pode ser parte de um complexo de proteínas, mas não pode distinguir aqueles que estão muito próximas fisicamente interagindo uns com os outros. Além disso, co-immunoprecipitations não pode fornecer quantificação na resolução única célula ou informações sobre a localização dos complexos de proteína na célula. Detecção de co-existência de complexos de proteínas em uma célula ou um compartimento celular por imunofluorescência é baseado na sobreposição de sinais difusos e, portanto, tem baixa resolução espacial e não pode fornecer informações precisas sobre as interações proteína. Quantificação do sinal de imunofluorescência pode ser feito por estimativa visual apenas se a diferença é várias vezes, e não pode ser exato ou mensuráveis ​​como os pontos PLA. FRET permite a visualização de complexos de proteínas em células vivas e supera a necessidade de anticorpos e da exposição do epítopo. No entanto, FRET geralmente depende da superexpressão de proteínas fundidas artificial, que pode não refletir a complexos de proteína endógena como no PLA. Condições de bloqueio no protocolo de PLA são críticos como agregação de anticorpos pode ocorrer e aumentar o fundo. Alternativas condições de bloqueio pode ser encontrado em folhas de produtos de anticorpos. Controles apropriados com omissão do anticorpo primário e secundário fornecer informações sobre o que pode ter dado errado e eles precisam ser sempre incluído. É importante para a tela anticorpos diferentes que vai dar o mínimo de fundo quando eles são usados ​​sozinhos e o melhor sinal quando estão juntos. Fixação de cells é crítica como sobre a fixação de complexos de proteínas pode causar a total desnaturar e degradar, enquanto que a fixação insuficiente pode levar à perda de complexos de proteínas durante as etapas do procedimento. Isto pode ser controlado através da redução da concentração do fixador a 3% ou limitando o tempo de fixação. No entanto, a fixação depende também se os anticorpos primários reconhecer proteínas desnaturadas ou não. Como a técnica de PLA é muito sensível, cuidados especiais são necessários para manter os tempos de incubação e as condições micro iguais entre diferentes amostras. As amostras não devem ser deixadas para secar em qualquer caso, antes da etapa final. A secagem das amostras pode levar a aumento de fundo. A remoção completa da solução de bloqueio também é fundamental para evitar a fundo. Os buffers de lavagem deve sempre estar à temperatura ambiente antes do uso, como baixa temperatura retarda as reações enzimáticas. Para solucionar o problema, consulte o manual do Kit. É útil usar manchas para determinar a localização sub-celular do sinal de PLA (por exemplo, DAPI, actina etc). Aqui nós temos utilizado DAPI (no meio de montagem) para manchar os núcleos. PLA é compatível com o uso de imunofluorescência com anticorpos para determinar o tipo de célula ou compartimento celular (não mostrado aqui). Quantificação exata pode ser feito através da contagem de sinais eo uso de software específico (Image Tool Duolink, Olink Biosience). Em conclusão, demonstramos como usar no PLA situ, utilizando o kit para detectar Duolink BMP sinalização em células fixas e apresentou as suas vantagens: fácil de usar, altamente sensível, sem fundo, e uma capacidade única para quantificar ativos de sinalização BMP in situ. A limitação da aplicação desta técnica para estudar as interações proteína diferente depende da disponibilidade e qualidade dos anticorpos primários que reconhecem as proteínas sob investigação.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4Na, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas com câmara de 16 poços</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>Polysine</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4 recombinante de camundongo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Reagentes de Detecção Duolink II (Laranja)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda Duolink II PLA anti-Camundongo MENOS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Sonda Duolink II PLA anti-Coelho MAIS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Meio de Montagem Duolink II com DAPI&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Tampões de Lavagem Duolink II para Fluorescência&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de sinalização de efeitos complexos downstream de bmp4 usando in situ pla, um ensaio ligadura proximidade

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs são responsáveis ​​por uma grande variedade de efeitos no desenvolvimento e biológicas. Receptores de BMP ativar (fosforilar) o Smad1/5/8 efetores, que então, formam um complexo com Smad4 e translocar para o núcleo onde funcionam como fatores de transcrição para iniciar BMP efeitos específicos a jusante 1. Tradicionais imuno-fluorescência técnicas com anticorpos contra fosfo Smad-peptídeos apresentam baixa sensibilidade fundo, alta e oferecer quantificação bruta como eles dependem da intensidade do sinal de anticorpos particularmente se este é fotossensível fluorescente. Além disso, fosfo-Smads não podem ser todos em um complexo com Smad4 e engajados na transcrição ativa. In situ PLA é uma tecnologia capaz de detectar as interações de proteínas com alta especificidade e sensibilidade 2-4. Esta nova tecnologia de reconhecimento de casais de anticorpos com a amplificação de DNA substituto da proteína. Ele gera um sinal, localizada em uma discreta forma de spots revelando a posição exata do evento de reconhecimento. O número de sinais podem ser contados e comparados proporcionando uma medição. Nós aplicamos em PLA situ, utilizando o kit Duolink, com uma combinação de anticorpos que permite a detecção do effectors BMP e sinalização phospho-Smad1/5/8 Smad4 apenas quando estes estão em proximidade ou seja, em um complexo, que ocorre apenas com a sinalização ativação. Isto permitiu, pela primeira vez, a visualização e medição de BMP endógenos de sinalização com alta especificidade e sensibilidade em um experimento de curso de tempo sob estímulo BMP4.

Aqui nós mostramos como usar Assay Proximidade Ligadura (PLA), com uma combinação de anticorpos para visualizar proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) de sinalização em células fixas. Esta técnica permitiu-nos a seguir o acúmulo nuclear de BMP activada endógena efetoras complexos e quantificar os seus níveis ao longo do tempo sob BMP4 estimulação.

Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

As BMPs são responsáveis por uma ampla gama de efeitos biológicos e de desenvolvimento. Os receptores de BMP ativam (fosforilam) os efetores Smad1/5/8, que então...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar e quantificar a sinalização BMP em células de cultura tecidual. As BMPs ligam-se a receptores na superfície celular e FOSFORILAM três efetores Smad: Smad1, Smad5 e SMAD8. Esses formam complexos com o Smad4 e translocam para o núcleo, onde coordenam a transcrição.Aqui utilizamos o PLA para visualizar complexos formados entre os efetores SMA endógenos e o smad quatro em células de cultura de tecidos com ou sem estimulação por BMP. O procedimento inicia com o uso paralelo de dois anticorpos primários, um dos quais reconhece os três efetores SMA fosforilados e o outro reconhece o smad quatro. Os anticorpos secundários, denominados sondas PLA, cada um com uma sequência curta de DNA ligada, ligam-se aos anticorpos primários quando as sondas PLA estão em proximidade. As sequências de DNA interagem mediante a adição subsequente de dois oligonucleotídeos de DNA formadores de círculo.Esses são unidos por ligação enzimática e formam um círculo que é amplificado por meio da replicação em círculo rolante após a reação de amplificação. A hibridização de sondas oligonucleotídicas complementares marcadas destaca os pontos fluorescentes do produto associados à amplificação de cada molécula circularizada. Os produtos de DNA são facilmente visíveis.Quando visualizados em um microscópio de fluorescência, os pontos correspondem a complexos entre efetor, seds e smad quatro, que indicam sinalização BMP ativa na célula. As principais vantagens do PLA em relação aos métodos existentes são sua facilidade de uso, alta sensibilidade, ausência de fundo e a possibilidade de quantificar a sinalização BMP ativa in situ. A via BMP é essencial para o desenvolvimento de diversos órgãos e tecidos e para processos como proliferação e diferenciação de células-tronco.O PLA pode ser usado para responder perguntas fundamentais sobre a dinâmica, os níveis e a localização subcelular da sinalização BMP, mas também pode ser empregado para diagnóstico. Como essa via está envolvida em diversas doenças, o PLA pode ser utilizado para estudar outros componentes da transdução de sinais da via BMP ou de outras vias, e pode ser adaptado para funcionar em cortes de tecidos ou embriões inteiros. Para iniciar o ensaio de ligação por proximidade in situ, prepare culturas celulares: células Neuro2A são cultivadas em GMEM suplementado com 10% de FBS, ácidos aminoácidos não essenciais na concentração de 1×, piruvato na concentração de 1× e L-glutamina na concentração de 1×.Divida as células usando tripsina e plaque de 15.000 a 20.000 células por poço. Em uma lâmina de câmara de 16 poços, incube as células a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas.Substitua o meio de cultura por GMEM livre de soro suplementado e incube por mais duas a três horas para os controles. Mantenha três poços com células em cultura e condições normais após a segunda incubação. Iniba a via BMP tratando as células com dois micromolares de dorsa morfina ou induza a sinalização tratando as células com BMP4 por 10 a 60 minutos.Após a estimulação celular, aspire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS para evitar a dessanexação celular. Não pipete o PBS diretamente sobre as células. Em seguida, aspire o PBS e remova as câmaras, mas mantenha o silicone ao redor dos poços.Adicione 50 microlitros de paraformaldeído a 4%, recém-preparado e filtrado, aos poços e incube por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Após a fixação, lave as células com PBS por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação em um frasco Coplin. Repita a lavagem duas vezes, totalizando três lavagens.Em seguida, permeabilize as células com Triton X-100 0,5% em PBS em um frasco de Coplin e incube-as por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, lave as células com tween 20 0,05% e TB S3 vezes por cinco minutos por lavagem com agitação em um frasco de acoplamento. Inicie o procedimento de bloqueio batendo levemente na lâmina para remover a solução final da lavagem.Tendo cuidado para não deixar as células secarem. Adicione uma gota de DUO link à solução bloqueadora em cada poço. Incube as células na solução bloqueadora por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida, composta por uma caixa vazia de ponteiras com água destilada.Para preparar as soluções de anticorpo primário, dilua o anticorpo anti-fosfo-SMAD 1 5 8 e o anticorpo anti-SMAD 4 um para 100 no diluente de anticorpos Duo Link 2. Utilize cada anticorpo separadamente e em combinação. Agora, bata levemente na lâmina para remover a solução bloqueadora e adicione 40 microlitros das soluções de anticorpo aos poços apropriados; um controle negativo com apenas o diluente pode ser incluído.Realize este passo rapidamente para que as células não sequem. Incube agora as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por uma hora. Durante a incubação, dilua as duas sondas PLA no diluente.Para cada reação, misture oito microlitros de cada sonda e 24 microlitros de diluente, de modo que as sondas sejam diluídas na proporção de um para cinco na solução. Após a incubação de uma hora, remova a solução do anticorpo primário batendo levemente e lave as lâminas duas vezes com o Duo link para o Tampão de Lavagem A, durante cinco minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação em um frasco de acoplamento. Quando as lavagens estiverem concluídas, remova o restante do tampão de lavagem A das lâminas batendo levemente e adicione 40 microlitros da solução de sonda PLA a cada uma.Agora, incube as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida. Por uma hora, th o duo link para o estoque de ligação e prepare um volume para a mistura de ligação. Primeiro, vortexe o duo link para o estoque de ligação e dilua-o para uma vez em água de alta pureza.Leve em consideração que a enzima Ligase é adicionada na diluição de um para 40 nesta solução e que são necessários 40 microlitros da mistura por poço. Após a incubação, remova delicadamente a solução do PLA probe das lâminas e lave-as duas vezes com Tampão de Lavagem A por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação em um frasco de acoplamento. Durante a última lavagem, retire o Duo link Ligase de um bloco congelado e adicione-o à solução de ligação até a diluição final de um para 40 e vortexie.Agora, remova o volume final do Tampão de Lavagem A das lâminas e adicione 40 microlitros da ligação. Misture com a enzima em cada uma delas. Incube as lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecida por 30 minutos.Descongele o estoque de amplificação DUO link a 37 graus Celsius e prepare para a etapa de amplificação durante a incubação, diluindo o estoque de amplificação DUO link em água de alta pureza até uma concentração de um vezes. Mantenha os reagentes protegidos da luz, pois são sensíveis à luz. Quando a etapa de ligação for concluída, remova a solução batendo levemente e lave as lâminas duas vezes com Tampão de Lavagem A por dois minutos cada, à temperatura ambiente, com agitação em um frasco de acoplamento; durante a última lavagem, adicione a polimerase duo link à solução de amplificação até uma diluição final de 1:280 e vortexie. Após remover o tampão de lavagem batendo levemente, adicione 40 microlitros da mistura de amplificação a cada poço e incube as lâminas em uma câmara úmida pré-aquecida e escura por 100 minutos a 37 graus Celsius.Após a conclusão da incubação de amplificação, remova a solução de polimerase das lâminas e lave-as duas vezes em tampão de lavagem B, durante 10 minutos por lavagem, com agitação em um frasco de acoplamento; mantenha as lâminas protegidas da luz nesta etapa, pois os reagentes são sensíveis à luz. Após as duas lavagens, mergulhe brevemente em 0,1 vezes o tampão de lavagem B. Remova completamente o silicone da lâmina de 16 poços e, então, adicione aproximadamente 40 microlitros do duo.Ligue o meio de montagem com dappy a uma lamínula e coloque-a suavemente sobre as amostras, pressionando levemente para que não haja bolhas de ar sob a lamínula. Fixe e selar a lamínula sobre a lâmina utilizando esmalte de unha, deixando secar por pelo menos 15 minutos antes da aquisição de imagens. Estas são imagens confocais de células que foram tratadas com dois micromolares de dorsa morfina, um inibidor da via BMP, ou tratadas com 25 nanogramas por mililitro de BMP quatro durante 60 minutos.Anticorpos contra a proteína Smad 1 58 fosforilada e Smad quatro foram utilizados para detectar os complexos Smad ativos e são observados como pontos vermelhos. Os núcleos celulares foram corados em azul com DAPI. Os sinais de PLA foram contados com o software DUO link image tool e o número médio de pontos no núcleo por célula é apresentado no gráfico.Nenhuma marcação é observada quando qualquer anticorpo primário é usado isoladamente, indicando que não há sinal de fundo dos sondas PLA e subsequente ligação dos oligonucleotídeos. Da mesma forma, nenhuma mancha é detectada em outro controle negativo que contém ambos os anticorpos primários. Em células neuro dois A, a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de imunoblot revela SMAD 1 5 8 fosforilado em células não tratadas e em células tratadas com BMP.No entanto, os níveis de smad fosforilada são acentuadamente reduzidos nas células tratadas com morfina dorsal. O anticorpo contra PCNA fornece um controle de carga. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como seguir os passos e a configuração que sugerimos para obter resultados em menos de seis horas após a fixação das células.Em resumo, os passos são bloqueio, incubação com anticorpo primário, incubação com sonda PLA, amplificação por ligação e montagem para imagem.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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