Detecção de Sinalização de Efeitos Complexos Downstream de BMP4 Usando In situ PLA, um Ensaio Ligadura Proximidade

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar e quantificar a sinalização de BMP em células de cultura de tecidos. As BMPs ligam-se a receptores na superfície celular e FOSFOLATO três, efetores SMAD, SMAD um, SMAD cinco e SMAD oito. Estes formam complexos com smad quatro e se translocam para o núcleo onde orquestram a transcrição.

Aqui, usamos PLA para visualizar complexos que se formam entre os efetores endógenos de SMA e smad quatro em células de cultura de tecidos com ou sem estimulação de BMP. Isso começa com o uso paralelo de dois anticorpos primários, um dos quais reconhece todos os três efetores fosforilados, smma, e o outro reconhece smad quatro anticorpos secundários chamados sondas PLA, cada um com uma fita de DNA curta única ligada a ele, ligam-se aos anticorpos primários onde as sondas PLA estão próximas. As fitas de DNA interagem por meio de uma adição subsequente de dois oligonucleotídeos de DNA formadores de círculos.

Estes são unidos por ligação enzimática e formam um círculo que é amplificado por meio da replicação do círculo rolante após a reação de amplificação. A hibridização de sondas de oligonucleotídeos complementares marcadas destaca os pontos fluorescentes do produto associados à amplificação de cada circularizado. Os produtos de DNA são facilmente visíveis.

Quando vistos sob um microscópio de fluorescência, os pontos correspondem a complexos entre o efetor, seds e smad quatro, que significam sinalização ativa de BMP na célula. As principais vantagens do PLA sobre os métodos existentes é que ele é fácil de usar, altamente sensível e sem fundo, e pode ser usado para quantificar a sinalização BMP ativa in situ. A via BMP é essencial para o desenvolvimento de vários órgãos e tecidos e para processos que incluem proliferação e diferenciação de células-tronco.

O PLA pode ser usado para abordar questões-chave relacionadas à dinâmica de sinalização BMP, níveis e localização subcelular, mas também pode ser usado para diagnóstico. Como essa via está subjacente a várias doenças, o BLA pode ser usado para estudar outros componentes de transação de sinal do BMP ou outras vias e pode ser adaptado para trabalhar em seções de tecido ou embriões inteiros. Para iniciar o ensaio de ligação de proximidade in situ, prepare as culturas de células Neuro duas células A são cultivadas em GMEM suplementadas com 10% de FBS uma vez aminoácidos não essenciais, uma vez piruvato e uma vez L glutamina.

Divida as células usando tripsina e coloque 15.000 a 20.000 células por poço. Em uma lâmina de câmara de 16 poços, incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% por 24 horas. Após 24 horas.

Substitua o meio de cultura por soro suplementado sem GMEM e incube por mais duas a três horas para controles. Manter três alvéolos com células em cultura e condições normais após a segunda incubação. Inibir a via BMP tratando as células com morfina dorsal dois micromolares ou induzir a sinalização tratando as células com BMP quatro por 10 a 60 minutos.

Após a estimulação celular, aspire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS para evitar o descolamento celular. Não pipete o PBS diretamente nas células. Em seguida, aspire o PBS e remova as câmaras, mas deixe o silício ao redor dos poços.

Adicione 50 microlitros de formaldeído a 4% para recém-preparado e filtrado aos poços e incube por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após a fixação, lave as células com PBS por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação em um frasco de copin. Repita a lavagem duas vezes para um total de três lavagens.

Em seguida, permeável as células com 0,5% Triton X 100 em PBS em um frasco de copin e incube-as por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, lave as células com 0,05% entre 20 e TB S3 vezes por cinco minutos por lavagem com agitação em um frasco de acoplamento. Inicie o procedimento de bloqueio batendo na lâmina para remover a solução de lavagem final.

Tomando cuidado para não permitir que as células sequem. Adicione uma gota de link DUO à solução de bloqueio a cada um. Bem, incube as células em solução de bloqueio por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida que consiste em uma caixa de ponta de pipeta vazia com água destilada.

Para preparar as soluções de anticorpos primários, dilua o antifosfato smad 1 5 8 e o anti SMAD quatro de um a 100 em duo link dois diluente de anticorpos. Use cada anticorpo sozinho e em combinação. Agora bata na lâmina para remover a solução de bloqueio da lâmina e adicione 40 microlitros das soluções de anticorpos aos poços apropriados e o controle negativo apenas com diluente pode ser incluído.

Faça esta etapa rapidamente para que as células não sequem. Agora incube as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida por uma hora. Durante a incubação, diluir as duas sondas de PLA em diluente.

Para cada reação, misture oito microlitros de cada sonda e 24 microlitros de diluente para que as sondas sejam diluídas de um a cinco na solução. Após a incubação de uma hora, retire a solução de anticorpo primário e lave as lâminas duas vezes com o Duo link to Wash Buffer a por cinco minutos cada em temperatura ambiente com agitação em um frasco de acoplamento. Quando as lavagens estiverem concluídas, retire o tampão de lavagem A restante das lâminas e adicione 40 microlitros da solução de sonda PLA a cada um.

Bem, agora incube as lâminas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada pré-aquecida. Durante uma hora, a dupla se conecta ao estoque de ligadura e prepara um volume para a mistura de ligadura. Ao primeiro vórtice, a dupla se liga ao estoque de ligadura e dilui-o para uma vez em água de alta pureza.

Leve em consideração que a enzima ligase é adicionada de um a 40 nesta solução e são necessários 40 microlitros da mistura por poço. Após a incubação, retire a solução da sonda PLA das lâminas e lave-as duas vezes com o tampão de lavagem. A por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação em um frasco de acoplamento durante a última lavagem, pegue as saídas de Duo link Ligase em um bloco de congelamento e, em seguida, adicione-o à solução de ligação até uma diluição final de um a 40 e Vortex.

Agora retire o volume final do Wash Buffer A das lâminas e adicione 40 microlitros da ligadura. Misture com enzima para cada um enquanto l. Incubar as lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecida por 30 minutos.

A 37 graus Celsius, descongele o estoque de amplificação do link DUO e prepare-se para a etapa de amplificação durante a incubação, diluindo o estoque de amplificação do DUO Link em água de alta pureza para uma vez Mantenha os reagentes fora da luz porque são sensíveis à luz. Quando a etapa de ligadura estiver concluída, retire a solução e lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem A por dois minutos cada à temperatura ambiente com agitação em um frasco de acoplamento durante a última lavagem, adicione a polimerase duo link à solução de amplificação até uma diluição final de 1 2 80 e vórtice. Depois de retirar o tampão de lavagem, adicione 40 microlitros da amplificação misturada a cada poço e incube as lâminas em uma câmara de umidade escura pré-aquecida por 100 minutos a 37 graus Celsius.

Quando a incubação de amplificação estiver concluída, retire a solução de polimerase das lâminas e lave-as no tampão de lavagem B duas vezes por 10 minutos por lavagem com vegetação em um frasco de acoplamento, mantenha as lâminas fora da luz durante esta etapa porque os reagentes são sensíveis à luz. Siga as duas lavagens com um mergulho em 0,1 vezes o tampão de lavagem B.Agora remova completamente o silício do 16. Bem, deslize então a aproximadamente 40 microlitros da dupla.

Conecte ao meio de montagem com dappy a uma lamínula e coloque-o suavemente sobre as amostras, pressionando-o levemente para que não haja bolhas de ar sob a lamínula, fixe e sele a lamínula na lâmina usando esmalte, permitindo pelo menos 15 minutos antes da imagem. Estas são imagens confocais de células que foram tratadas com dois dorsa morfina micromolar, um inibidor da via BMP ou tratadas com 25 nanogramas por mililitro. BMP quatro por 60 minutos.

Anticorpos contra Phospho Smad 1 58 e Smad quatro foram usados para detectar os complexos smad ativos e são vistos como manchas vermelhas. A célula nuclear sustentada azul por dpi. Os sinais de PLA foram contados com o software DUO link image tool e o número médio de pontos no núcleo por célula é apresentado no gráfico.

Nenhuma coloração é observada quando qualquer um dos anticorpos primários é usado isoladamente, indicando que não há achado de fundo das sondas de PLA e subsequente ligação dos oligonucleotídeos. Da mesma forma, não são detectadas manchas em outro controle negativo que emita ambos os anticorpos primários. Em neuro duas células A, o SDS page immunoblotting revela SMAD 1 5 8 relacionado a fosfato em células não tratadas e tratadas com BMP.

No entanto, os níveis de fosfosofo são marcadamente reduzidos nas células tratadas com morfina dorsal. O anticorpo contra PCNA fornece um controle de carga. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como seguir os passos e a configuração que sugerimos para obter resultados em menos de seis horas após a fixação das células.

Em resumo, as etapas estão bloqueando a incubação primária de anticorpos, incubação de PLA prob, amplificação de ligação, montagem de uma imagem.