Name: Geração de plantas em Composite Medicago truncatula Utilizado para Ensaios Nodulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprenda a gerar plantas compostas de raiz peluda em Medicago truncatula para estudar nodulação e interações planta-rizóbio. Este método rápido permite obter tecido transgênico em semanas sem cultura de tecidos tradicional.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Chris Taylor (Ohio State University) para a introdução de tecnologia de raiz peluda para o nosso laboratório e as Dras. Senthil Subramanian (South Dakota State University), Juan Zhang (Ludong University, Shandong China) para melhorar o protocolo. Agradecemos também o Dr. Cheng Hao (Nanjing University Agricultura) para ajuda a fazer este vídeo. Este trabalho é apoiado em parte por concessões do DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) e USDA (2010-65116-20514) para OY

O protocolo a seguir foi usado para gerar plantas raiz peludo composto em um modelo de espécies de leguminosas M. truncatula. Protocolos semelhantes foram adaptados para pelo menos oito espécies de plantas 1-4. Usamos M. plantas raiz truncatula peludo composto para estudar as funções dos genes no desenvolvimento de raiz e de nódulos. O protocolo foi dividido em quatro seções: 1) materiais vegetais a preparar, 2) geração de plantas de raiz peludo composto; 3) infecção rizóbios simbiótica e 4) transgênico identificação raiz. Utilizou-se o vetor binário contendo o gene da proteína verde fluorescente (GFP) como repórter para a triagem da raiz nas plantas transgênicas composto 3. Em comparação com antibióticos baseado seleção, GFP-despistagem é rápido, fácil e barato. Em nossa construção, a ER-expressão otimizado gene GFP é conduzido pelo promotor de super ubiquitina, que tem fortes sinais GFP constitutiva em raízes transgênicas, permitindo fácil distinção entre raízes transgênicas e não transgênicas. 1. Preparação de materiais vegetais <ol><li> Sementes de M. truncautla são colhidos a partir de plantas cultivadas em uma estufa (50% de umidade relativa, 16 / 8 h claro / escuro, 22/18 ° C de temperatura dia / noite). Sementes maduras podem ser armazenados a 4 ° C. </li><li> Cerca de 100 sementes são escarificadas em 10 ml de ácido sulfúrico concentrado (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) por 10 min com agitação periódica. </li><li> As sementes são lavadas 5-7 vezes com água esterilizada com agitação suave. </li><li> As sementes são, então, embebidos em água à temperatura ambiente por 6 horas e mantidos a 4 ° C por 36-48 horas para sincronizar a germinação. </li><li> Cerca de 20-30 sementes são espalhadas em papel de filtro úmido colocado em uma placa de Petri. Eles são mantidos a 22 ° C, com 16 / 8 h ciclo claro / escuro, e 40 μmol.m -2. Intensidade da luz s -1, por 5-6 dias. </li><li> Plântulas germinadas são transferidas para o solo e colocadas em estufa por um mês. </li></ol> 2. Geração de Plantas Root Cabeludo Composite <ol><li> Constrói binários portadores de genes de interesse foram transformados em A. rhizogenes utilizando protocolos padrão. Nós projetamos um conjunto de vetores binários contendo o gene GFP como um marcador que facilitam a triagem de tecidos transgênicos. Esses vetores contêm promotores diferentes e todos têm sites de Gateway de clonagem (Invitrogen, Carlsbad, CA) para a sobre-expressão ou silenciamento de genes alvo 3,5. </li><li> A. rhizogenes é cultivada em 50ml de meio LB com a seleção antibiótico adequado a 28 ° C durante 16-24 horas. </li><li> As bactérias são coletadas e re-suspenso para uma concentração final de OD 600 = 0,3 em uma solução nutritiva de nitrogênio livre de plantas (Tabela 1 e 6). </li><li> Para apoiar a reabilitação de raiz peludo, uma matriz esterilizados de apoio ("Lã de Rocha", Hummert International, Earth City, MO) é cortado em plugs de aproximadamente 3 cm 3. Nós colocamos quatro velas em uma placa de Petri. </li><li> Um buraco é picado por cima de cada vela usando uma ponteira de pipeta para facilitar a inserção de explantes. A. rhizogenes (5 mL) é adicionado para cada plugue. </li><li> A seção de atirar com 2-3 gemas axilares é retirado por um corte oblíquo. O explante é então inserido no plugue, e cresceu a 22 ° C por cerca de três semanas. Mantemos os explantes Medicago sem molhar durante os primeiros 10 dias, então, molhá-los com 5 ml de solução de nitrogênio-livre, quando necessário. Descobrimos que a remoção do meristema apical pode diminuir a formação de raízes adventícias. </li></ol> 3. Simbiótica rizóbios (Sinorhizobium meliloti) Infecção <ol><li> Depois de três semanas, algumas raízes adventícias vão surgir a partir da lã de rocha. As plantas de raiz peludo compostos são transferidos para areia ou vermiculite (esterilizado), com ou sem a lã de rocha. Elas são cultivadas em estufa a 22 ° C, 16 / 8 h ciclo claro / escuro, e 300 μmol.m -2. S -1 de intensidade de luz para mais uma semana. </li><li> Antes de rizóbio infecção, S. meliloti 1201 é cultivado em 50 extrato de levedura-manitol ml de meio por 7 dias a 30 ° C (Tabela 2 e 6,7). </li><li> Células re-suspensão de rizóbio são diluídos para uma concentração final de OD 600 = 0,08 usando nitrogênio solução de nutrição gratuita. A suspensão de 10 ml fresca de S. meliloti foi aplicado para cada planta composto para induzir a formação de nódulos. </li></ol> 4. Identificação Root transgênicos <ol><li> Duas semanas após inoculação com rizóbio, as plantas são compostas de enraizadas pela lavagem em água. As raízes podem ser facilmente separadas das areias ou perlite na água. </li><li> Nós colocamos as raízes cabeludas sob um microscópio UV (Nikon SMZ1500, Excitação 460-500nm, 505nm Dichroic, Barreira mais de 510 Nm.). As raízes transgênicas GFP são positivas e as raízes adventícias são GFP negativo. Em seguida, recolher as raízes according o sinal de GFP, e contar os números de nódulos, medir o comprimento da raiz, e calcular a densidade da raiz lateral. As raízes GFP negativos são usados ​​como controle. </li></ol> 5. Resultado representante Em nosso experimento, as raízes do cabelo novo reciclados a partir de explantes em 2-3 semanas após o A. rhizogenes inoculação. Sob o microscópio UV, raízes transgênicas com o gene GFP mostram forte fluorescência verde (Fig. 1). A quantidade de raízes regeneradas ea parte das raízes GFP positivos dependem das condições de explantes e do ambiente de crescimento da média plants.On composto, 25% das raízes foram produzidas raízes transgênicas 3. Para aumentar a eficiência de transformação, 1) a condenação tampa de plástico, como mostrado no vídeo, é suficiente para manter a umidade na bandeja de crescimento para os primeiros dias, e só as plantas necessitam de pouca água no primeiros dias. Rega excessiva é prejudicial para a formação de raízes cabeludas, 2) a concentração de inoculante Agrobacterium é importante para a transformação. Quantidade excessiva de células não são úteis para a formação de raízes cabeludas ou formação de nódulos. Para formação de nódulos, a solução de rega precisa ser isentos de azoto, caso contrário, nódulos poucos irá se formar. As plantas de raiz peludo composto pode ser gerado usando cotilédones ou mudas entact como o material de partida. Apenas pequenas modificações do protocolo acima são ncessary para gerar raízes cabeludas de outros tecidos 8. Importante, cada raiz peludo é um evento de transformação independente. Portanto, os fenótipos observados em uma planta composta são a soma de eventos transforamtion várias que precisava ser confirmado por repetições em várias plantas compostas <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A. raízes transgênicas pode ser resolvido a partir de raízes cabeludas. Nódulos B. foram formadas nas plantas raiz peludo composto. Colocamos quatro semanas de idade M. plantas raiz truncatula peludo sob o microscópio UV e as raízes GFP positivos podem ser facilmente identificados. (Seta vermelha: root GFP; seta amarela: não-GFP root) <table border="1"><tbody><tr><td> Estoque </td><td> g/200ml </td><td> ml de ações / litro </td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> 12,3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> 14,7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 .3 H 2 O </td><td> 6,8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Fe Cl 3 .6 H 2 O </td><td> 0,49 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Micronutrientes </td><td> Veja abaixo </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Micronutrientes </td><td> g por litro </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0,142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0,077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 .7 H 2 O </td><td> 0,1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0,037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0,024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> 0,0025 </td></tr><tr><td> Niso 4 </td><td> 0,001 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Solução de nutrição Nitogen livre <table border="1"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> Extrato de levedura </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6,8 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Extrato de levedura manitol médio (por litro)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Gerando planta raiz peludo composto é um método rápido e fácil para obter grandes quantidades de material transgênico para muitas outras espécies floridas. Embora este método não pode produzir sementes transgênicas, pode produzir material transgênico em algumas semanas. O método é especialmente adequado para as plantas que têm dificuldade de estabelecer culturas de tecidos ou a geração de transformantes estáveis. Ao longo dos anos, temos usado esta tecnologia para estudar as funções dos genes, as funções de promotor, microRNAs, raiz e desenvolvimento radicular lateral, defesa e resposta ao estresse abiótico, nodulação e outros processos simbióticos, respostas hormonais, perfil metabólico, perfil genético, análise proteômica e outros processos biológicos. O protocolo é robusto e replicáveis.

geração de plantas em composite medicago truncatula utilizado para ensaios nodulação

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Semelhante ao tumerfaciens Agrobacterium, Agrobacterium rhizogenes pode transferir DNAs estrangeiros em células de plantas com base na raiz autônoma de indução (Ri) plasmídeo. A. rhizogenes podem causar a formação de raízes cabeludas sobre os tecidos da planta e forma de plantas compostas após a transformação. Sobre essas plantas compostas, algumas das raízes regeneradas são transgênicos, carregando o tipo selvagem T-DNA eo vetor binário engenharia, enquanto os tiros ainda são não-transgênico, que serve para fornecer energia e sustentar o crescimento. Estas plantas raiz peludo composto não vai produzir sementes transgênicas, mas há uma série de características importantes que fazem estas plantas compostos muito úteis na investigação de plantas. Primeiro, com uma ampla gama de hospedeiros, A. rhizogenes pode transformar muitas espécies de plantas, principalmente dicotiledôneas, permitindo que a engenharia genética em uma variedade de espécies. Segunda, A. rhizogenes infectar tecidos e explantes diretamente, sem culturas de tecidos antes da transformação é necessária para obtenção de plantas compostas, tornando-as ideais para transformar espécies de plantas recalcitrantes. Além disso, os tecidos da raiz transgênicos podem ser gerados em uma questão de semanas. Para Medicago truncatula, podemos obter as raízes transgênicas em tão curto quanto três semanas, mais rápido do que o normal transformação mergulho floral de Arabidopsis. No geral, o cabeludo raiz tecnologia das centrais composto é uma ferramenta versátil e útil para estudar as funções dos genes e raiz-relacionados fenótipos. Aqui demonstramos como as plantas de raiz peludo composto pode ser usado para estudar as interações planta rizóbio e nodulação do M. difícil de transformar as espécies truncatula.

Demonstramos como as plantas de raiz peludo composto pode ser usado para estudar as interações planta rizóbio e nodulação na difíceis de transformar as espécies<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

Geração de plantas em Composite Medicago truncatula Utilizado para Ensaios Nodulação

Semelhante ao Agrobacterium tumefaciens, o Agrobacterium rhizogenes pode transferir DNAs exógenos para células vegetais com base no plasmídeo Ri (indutor de raízes) autônomo...

Olá, meu nome é Oliver Yu, do Centro de Ciências Vegetais Dan. Hoje vamos mostrar como gerar plantas de Ute Compote por meio de Agrobacterium Ogn. Esta técnica foi introduzida no Centro Dan pelo Dr. Chris Taylor, atualmente na Universidade Estadual de Ohio.Vários dos meus ex-membros do grupo aprimoraram essas técnicas ao longo dos anos e, hoje, meu atual membro do grupo, Dr. Stone e Mao, produziram este vídeo para mostrar como são obtidos os planos compostos de Harry Root. Os Agrobacterium ZOS são muito semelhantes ao agrobacterium tumefaciens, pois introduzem DNA estranho em plantas, mas os ZOS podem induzir uma formação maior de raízes em tecidos do tipo selvagem, formando plantas compostas como esta. Assim, nessas plantas compostas, algumas das raízes são transgênicas, enquanto os ramos aéreos ainda são do tipo selvagem.Portanto, esta tecnologia não produzirá sementes transgênicas. No entanto, existem três grandes vantagens das plantas com alta concentração de campim nas raízes que tornam esta tecnologia muito útil. Primeiro, muitas espécies vegetais, especialmente espécies dicotiledôneas, podem ser transformadas por bactérias do gênero Agrobacterium.Segundo, não precisamos estabelecer cultura de tecidos antes da transformação. Podemos utilizar várias partes das plantas, como plântulas, brotos e co, para gerar diretamente plantas campilhas. E, por fim, podemos obter tecido radicular transgênico em questão de semanas.Para a transformação de cargas de soja e medica, podemos obter raízes transgênicas em até três semanas, mais rápido do que uma transformação OPIS. No geral, a tecnologia de planta com maior citocinese radicular é uma ferramenta muito útil para estudar funções gênicas e fenótipos relacionados às raízes. Não. Olá, meu nome é Ong.Olá, meu nome é, aqui está meu cinegrafista Bill. Hoje vamos apresentar o protocolo da planta composta Harry root. Sim, utilizamos este protocolo em diversos projetos nossos.Já começamos, sim. Sim. Para a nossa demonstração, usaremos meta cargo Tula como exemplo. Estas são vagens maduras de meta cargo.Coloque as vagens em uma caixa de moagem e, em seguida, moa-as com um movimento longo e firme. Separe as sementes das vagens de sementes agitando suavemente e coloque as sementes em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido sulfúrico concentrado.Escarificação muito cuidadosa. Leva cerca de 10 minutos. Vortexar o tubo com ácido duas a três vezes.Durante o tratamento ácido, a casca da semente mudará para uma cor amarela. Remova o ácido sulfúrico do tubo e lave as sementes pelo menos cinco vezes com água estéril. Mergulhe as sementes em água desionizada à temperatura ambiente por seis horas e, em seguida, mantenha-as a quatro graus centígrados por dois dias.Para sincronizar a germinação. Espalhe de 20 a 30 sementes sobre papel-filtro úmido na placa de Petri. Após cinco a seis dias, transfira as plântulas para o solo e cultive-as na estufa por quatro semanas.Para a transformação de plantas compostas, normalmente utilizamos a linhagem de agrobactéria Zony K 5 99. O vetor shuttle ou vetor binário pode ser transformado no K 5 99 seguindo o protocolo padrão de transformação de agrobactéria tumor facit. Inocule a agrobactéria, cultive-a a 30 graus centígrados por 16 a 24 horas após o período de crescimento. Colete as células colocando a solução de cultura em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Centrifugue a 5.000 G durante 30 minutos. Suspender o precipitado em solução nutritiva sem nitrogênio. Certifique-se de diluir as células de agrobactéria até 0,3 em OD 600.Essa concentração é importante para a transformação máxima. Utilizamos parede de rocha como matriz de suporte. O uso desse material é importante para transformação de alta frequência.Corte a parede de rocha no tamanho adequado. Tampão. Faça um furo na parte superior com cerca de um centímetro e meio a dois centímetros de diâmetro. Usando uma ponteira de pipeta, adicione cinco mililitros da solução de Agrobacterium Zony em suspensão em cada tampão.Selecione um segmento do caule com dois a três brotos axilares e faça um corte oblíquo. Insira os segmentos da planta no orifício na parede de rocha. Coloque as plantas cortadas em uma câmara de crescimento ou bancada de laboratório por três semanas.Adicione cinco mililitros de solução nutritiva em cada cubinho a cada 10 dias. Após três semanas, as raízes são regeneradas a partir do lado cortado. Mergulhe a planta na água.Remova cuidadosamente a parede de rocha amolecida e não danifique as raízes. Certifique-se de remover toda a parede de rocha. Você pode transferir as plantas compostas de raízes peludas para areia ou perlita. Para experimentos de simbiose, cultive o rizóbio em meio extrato de levedura manitol por sete dias a 30 graus Celsius.Colete as células zoia Resus. Suspenda o pellet com a solução nutritiva livre de nitrogênio. Dilua a solução para 0,08 na OD 600.Adicione 10 mililitros de solução ZOA a cada cultura de planta composta, mantendo a planta por mais duas a três semanas para permitir a formação de nódulos. Remova a areia das plantas compostas desenterrando-as e lavando-as. Utilize a expressão da proteína verde fluorescente para verificar a raiz transgênica.Você usará um microscópio fluorescente para fazer isso. Todas as nossas construções de raízes peludas possuem um cassete GFP constitutivo para seleção de linhagens transgênicas. Esta imagem mostra as plantas compostas de raízes peludas transgênicas com GFP observadas no microscópio fluorescente.As raízes transgênicas com fluorescência verde mais intensa são fáceis de distinguir das raízes não transgênicas. Nódulos se formam na raiz peluda das plantas compostas. A seguir está o protocolo completo.Mais uma vez, a geração de plantas compostas com raízes peludas é um método rápido e fácil para obter grandes quantidades de tecido transgênico, especialmente para espécies de dicotiledôneas. Embora este método não permita obter sementes transgênicas, ele pode produzir material transgênico em algumas semanas. É especialmente adequado para plantas que apresentam dificuldade em estabelecer cultura de tecidos e transformação.Ao longo dos anos, utilizamos esta tecnologia para estudar funções gênicas, funções de promotores, microRNAs, desenvolvimento da raiz principal e raízes laterais, resposta ao estresse defensivo e antibiótico, nodulação e outros processos simbióticos. Estudamos resposta hormonal, perfil metabólico, perfil gênico e análise proteômica utilizando plantas compostas com raízes superiores. Esperamos que este vídeo ajude você a adaptar este sistema à sua espécie preferida.Você é bem-vindo para entrar em contato conosco para perguntas relacionadas a esta tecnologia e boa sorte.

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Biologia

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