Geração de plantas em Composite Medicago truncatula Utilizado para Ensaios Nodulação
27 de março de 2011
Demonstramos como as plantas de raiz peludo composto pode ser usado para estudar as interações planta rizóbio e nodulação na difíceis de transformar as espécies Medicago truncatula.
Olá, meu nome é Oliver Yu, do Centro de Ciências Vegetais Dan. Hoje vamos mostrar como gerar plantas de Ute Compote por meio de Agrobacterium Ogn. Esta técnica foi introduzida no Centro Dan pelo Dr. Chris Taylor, atualmente na Universidade Estadual de Ohio.
Vários dos meus ex-membros do grupo aprimoraram essas técnicas ao longo dos anos e, hoje, meu atual membro do grupo, Dr. Stone e Mao, produziram este vídeo para mostrar como são obtidos os planos compostos de Harry Root. Os Agrobacterium ZOS são muito semelhantes ao agrobacterium tumefaciens, pois introduzem DNA estranho em plantas, mas os ZOS podem induzir uma formação maior de raízes em tecidos do tipo selvagem, formando plantas compostas como esta. Assim, nessas plantas compostas, algumas das raízes são transgênicas, enquanto os ramos aéreos ainda são do tipo selvagem.
Portanto, esta tecnologia não produzirá sementes transgênicas. No entanto, existem três grandes vantagens das plantas com alta concentração de campim nas raízes que tornam esta tecnologia muito útil. Primeiro, muitas espécies vegetais, especialmente espécies dicotiledôneas, podem ser transformadas por bactérias do gênero Agrobacterium.
Segundo, não precisamos estabelecer cultura de tecidos antes da transformação. Podemos utilizar várias partes das plantas, como plântulas, brotos e co, para gerar diretamente plantas campilhas. E, por fim, podemos obter tecido radicular transgênico em questão de semanas.
Para a transformação de cargas de soja e medica, podemos obter raízes transgênicas em até três semanas, mais rápido do que uma transformação OPIS. No geral, a tecnologia de planta com maior citocinese radicular é uma ferramenta muito útil para estudar funções gênicas e fenótipos relacionados às raízes. Não. Olá, meu nome é Ong.
Olá, meu nome é, aqui está meu cinegrafista Bill. Hoje vamos apresentar o protocolo da planta composta Harry root. Sim, utilizamos este protocolo em diversos projetos nossos.
Já começamos, sim. Sim. Para a nossa demonstração, usaremos meta cargo Tula como exemplo. Estas são vagens maduras de meta cargo.
Coloque as vagens em uma caixa de moagem e, em seguida, moa-as com um movimento longo e firme. Separe as sementes das vagens de sementes agitando suavemente e coloque as sementes em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido sulfúrico concentrado.
Escarificação muito cuidadosa. Leva cerca de 10 minutos. Vortexar o tubo com ácido duas a três vezes.
Durante o tratamento ácido, a casca da semente mudará para uma cor amarela. Remova o ácido sulfúrico do tubo e lave as sementes pelo menos cinco vezes com água estéril. Mergulhe as sementes em água desionizada à temperatura ambiente por seis horas e, em seguida, mantenha-as a quatro graus centígrados por dois dias.
Para sincronizar a germinação. Espalhe de 20 a 30 sementes sobre papel-filtro úmido na placa de Petri. Após cinco a seis dias, transfira as plântulas para o solo e cultive-as na estufa por quatro semanas.
Para a transformação de plantas compostas, normalmente utilizamos a linhagem de agrobactéria Zony K 5 99. O vetor shuttle ou vetor binário pode ser transformado no K 5 99 seguindo o protocolo padrão de transformação de agrobactéria tumor facit. Inocule a agrobactéria, cultive-a a 30 graus centígrados por 16 a 24 horas após o período de crescimento. Colete as células colocando a solução de cultura em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Centrifugue a 5.000 G durante 30 minutos. Suspender o precipitado em solução nutritiva sem nitrogênio. Certifique-se de diluir as células de agrobactéria até 0,3 em OD 600.
Essa concentração é importante para a transformação máxima. Utilizamos parede de rocha como matriz de suporte. O uso desse material é importante para transformação de alta frequência.
Corte a parede de rocha no tamanho adequado. Tampão. Faça um furo na parte superior com cerca de um centímetro e meio a dois centímetros de diâmetro. Usando uma ponteira de pipeta, adicione cinco mililitros da solução de Agrobacterium Zony em suspensão em cada tampão.
Selecione um segmento do caule com dois a três brotos axilares e faça um corte oblíquo. Insira os segmentos da planta no orifício na parede de rocha. Coloque as plantas cortadas em uma câmara de crescimento ou bancada de laboratório por três semanas.
Adicione cinco mililitros de solução nutritiva em cada cubinho a cada 10 dias. Após três semanas, as raízes são regeneradas a partir do lado cortado. Mergulhe a planta na água.
Remova cuidadosamente a parede de rocha amolecida e não danifique as raízes. Certifique-se de remover toda a parede de rocha. Você pode transferir as plantas compostas de raízes peludas para areia ou perlita. Para experimentos de simbiose, cultive o rizóbio em meio extrato de levedura manitol por sete dias a 30 graus Celsius.
Colete as células zoia Resus. Suspenda o pellet com a solução nutritiva livre de nitrogênio. Dilua a solução para 0,08 na OD 600.
Adicione 10 mililitros de solução ZOA a cada cultura de planta composta, mantendo a planta por mais duas a três semanas para permitir a formação de nódulos. Remova a areia das plantas compostas desenterrando-as e lavando-as. Utilize a expressão da proteína verde fluorescente para verificar a raiz transgênica.
Você usará um microscópio fluorescente para fazer isso. Todas as nossas construções de raízes peludas possuem um cassete GFP constitutivo para seleção de linhagens transgênicas. Esta imagem mostra as plantas compostas de raízes peludas transgênicas com GFP observadas no microscópio fluorescente.
As raízes transgênicas com fluorescência verde mais intensa são fáceis de distinguir das raízes não transgênicas. Nódulos se formam na raiz peluda das plantas compostas. A seguir está o protocolo completo.
Mais uma vez, a geração de plantas compostas com raízes peludas é um método rápido e fácil para obter grandes quantidades de tecido transgênico, especialmente para espécies de dicotiledôneas. Embora este método não permita obter sementes transgênicas, ele pode produzir material transgênico em algumas semanas. É especialmente adequado para plantas que apresentam dificuldade em estabelecer cultura de tecidos e transformação.
Ao longo dos anos, utilizamos esta tecnologia para estudar funções gênicas, funções de promotores, microRNAs, desenvolvimento da raiz principal e raízes laterais, resposta ao estresse defensivo e antibiótico, nodulação e outros processos simbióticos. Estudamos resposta hormonal, perfil metabólico, perfil gênico e análise proteômica utilizando plantas compostas com raízes superiores. Esperamos que este vídeo ajude você a adaptar este sistema à sua espécie preferida.
Você é bem-vindo para entrar em contato conosco para perguntas relacionadas a esta tecnologia e boa sorte.
Visão Geral
Este artigo demonstra a geração de plantas compostas de raízes peludas para estudar as interações planta-rizóbio e a nodulação em Medicago truncatula. A técnica permite a produção rápida de tecido radicular transgênico sem a necessidade de métodos tradicionais de cultura de tecidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Vegetal
- Engenharia Genética
- Relações Simbióticas
Antecedentes
- Plantas compostas de raízes peludas são produzidas utilizando transformação mediada por Agrobacterium.
- Este método é particularmente útil para espécies que são difíceis de transformar.
- As raízes transgênicas podem ser geradas em questão de semanas.
- As plantas compostas consistem em raízes transgênicas e brotos do tipo selvagem.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para gerar plantas compostas de raízes peludas.
- Facilitar o estudo das funções gênicas e dos processos de nodulação.
- Fornecer um método rápido para obtenção de material transgênico.
Métodos Utilizados
- Transformação de Agrobacterium em sementes de Medicago truncatula.
- Uso de soluções nutritivas livres de nitrogênio para o crescimento das plantas.
- Microscopia fluorescente para identificar raízes transgênicas.
- Indução de nodulação mediante aplicação de culturas de rizóbio.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de plantas compostas transgênicas de raízes peludas.
- Foi observada a formação de nódulos em raízes transgênicas.
- A produção rápida de raízes transgênicas foi alcançada em semanas.
- O método é aplicável a várias espécies vegetais de difícil transformação.
Conclusões
- Plantas compostas de raízes peludas são uma ferramenta valiosa para o estudo da genética vegetal.
- Essa técnica permite a exploração eficiente de fenótipos relacionados às raízes.
- Ela fornece uma alternativa rápida aos métodos tradicionais de transformação vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Geração rápida de plantas compostas em Medicago truncatula utilizando Agrobacterium rhizogenes permite acelerar estudos de genômica funcional e fenótipos radiculares em espécies resistentes à transformação tradicional. Essa abordagem favorece a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas para características associadas à raiz, incluindo nodulação e interações simbióticas. A velocidade e versatilidade do método aprimoram a tomada de decisões em portfólios de pesquisa e desenvolvimento em biotecnologia vegetal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta da função gênica em tecidos radiculares relevantes para nodulação e simbiose.
- Facilita a redução de riscos biológicos ao contornar gargalos da cultura de tecidos em espécies de difícil transformação.
- Apóia a confiança preditiva na manipulação de características radiculares para pipelines de validação de características.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece produção rápida de raízes transgênicas validadas para ensaios fenotípicos subsequentes.
- Permite triagem reprodutível de construtos gênicos utilizando seleção baseada em GFP em raízes compostas.
- Permite o desenvolvimento escalonável de ensaios para estudos de interação raiz-microrganismo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à descoberta translacional de biomarcadores para fenótipos associados à raiz em modelos de leguminosas.
- Mantém a continuidade da descoberta da função gênica até a validação pré-clínica de características radiculares.
- Reduz o risco no avanço de candidatos para programas de melhoria de características em culturas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de planta composta se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico para pesquisa e desenvolvimento de características vegetais, particularmente para estudos de biologia radicular e interações simbióticas.
- Biologia da Descoberta: Acelera a verificação de hipóteses sobre a função gênica em tecidos radiculares sem a necessidade de gerar sementes transgênicas.
- Triagem: Fornece raízes transgênicas prontas para ensaio, com validação por GFP, para análise quantitativa de nodulação e fenótipos.
- Análises: Permite a medição de nodulação, desenvolvimento radicular e expressão de transgenes utilizando microscopia de fluorescência.
- Pesquisa Translacional: Apoia a avaliação pré-clínica de características radiculares em um sistema modelo de leguminosas relevante para o melhoramento de cultivos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para genômica funcional rápida em diversas espécies de dicotiledôneas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de características radiculares e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos simbióticos.
- Valor Operacional: Otimiza fluxos de trabalho ao eliminar a cultura de tecidos e permitir transformação radicular de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar no desenvolvimento de características e aumenta a eficiência do capital em pesquisa e desenvolvimento vegetal.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos genéticos e candidatos a características para desenvolvimento adicional.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em transformação de plantas e triagem baseada em fluorescência.
- Exige acesso a câmaras de crescimento, técnica estéril e infraestrutura de microscopia de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade na transformação e fenotipagem.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes espécies vegetais ou fenótipos de raiz.
- Não produz sementes transgênicas, limitando estudos de hereditariedade aos tecidos radiculares.
