Análise do transcriptoma de uma única célula

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras de células individuais para análise do transcriptoma. Isso é realizado primeiramente localizando uma célula adequada para isolamento. Em seguida, a micropipeta é posicionada ao lado da célula a ser isolada.

Em seguida, aplica-se sucção à seringa até que a célula seja puxada para a ponta da micropipeta. O passo final do procedimento consiste em quebrar a ponta da micropipeta dentro do tubo de coleta e ejetar o conteúdo remanescente da micropipeta para dentro do tubo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram diferenças nas populações de mRNA entre células por meio de análise de microarranjo do material amplificado utilizando o método de amplificação de arna, também descrito no protocolo, ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de nova geração.

Embora este método possa fornecer informações e evidenciar as diferenças entre células individuais, ele também pode ser aplicado a compartimentos subcelulares, como dendritos ou classes de dendritos, e fornecer informações importantes sobre a função dendrítica. O procedimento será demonstrado por Jennifer Singh, pós-doutoranda no meu laboratório. Antes do início deste protocolo, neurônios primários provenientes do dia embrionário 18 de hipocampo de rato foram semeados em lamínulas de 12 milímetros em uma placa de 35 milímetros e mantidos conforme descrito no protocolo escrito. Para preparar as pipetas para a coleta, utilize um puxador de micropipetas para puxar pipetas de vidro autoclavadas até um diâmetro apropriado para eletrofisiologia.

Usando o programa predefinido do fabricante, o tamanho do orifício não é crítico, já que a ponta será quebrada antes da coleta celular. Armazene cuidadosamente as pipetas em um ambiente livre de poeira, como um frasco de armazenamento para micropipetas, onde as pontas permanecerão intactas até o momento de colher as células. Prepare o número desejado de tubos einor de 1,7 mililitro adicionando dois microlitros de PBS para armazenamento do material colhido.

Remova 1 placa de 35 milímetros com lamínulas do incubador em uma cabine de cultura de tecidos. Transfira rapidamente uma lamínula desta placa para a tampa de uma nova placa de 35 milímetros contendo HBSS. É fundamental devolver ao incubador as lamínulas que não estão sendo manipuladas, pois as células se tornam não saudáveis.

Se deixado fora por períodos prolongados de tempo. É necessário um microscópio invertido com objetivo de 40 x equipado com micro manipulador para a coleta celular. Utilize um suporte para pipeta com tubo flexível que se estende para longe do suporte; fixe o tubo a uma superfície estável para evitar movimentos indesejados da pipeta durante a coleta.

No final da tubulação, insira uma agulha para que uma seringa de um mililitro com conexão tipo lure lock possa ser fixada e trocada entre os usuários. Prepare a micropipeta quebrando a ponteira de forma controlada, segurando um lenço de papel Kim firmemente entre os dedos de uma das mãos e passando suavemente a ponta da pipeta sobre o papel de uma a duas vezes. A abertura deve ter aproximadamente 75 a 100% do tamanho da célula-alvo.

Fixe a micropipeta no suporte da micropipeta e prenda o suporte ao encaixe nos micromanipuladores. Por fim, coloque o objetivo de 40 x. Posicione a placa sobre a platina do microscópio e localize uma região de células adequada para colheita.

No caso de culturas neuronais primárias, a célula deve estar relativamente isolada em relação aos seus vizinhos. Para evitar a coleta de células ou processos circundantes, posicione a célula a ser colhida no centro do campo de visão. Use o micromanipulador para avançar a micropipeta em direção à solução no recipiente, inserindo-a no trajeto da luz.

Introduza a ponta da pipeta na solução. Olhando através da ocular, a pipeta deve aparecer como uma sombra no campo de visão. Aplique pressão positiva a partir deste ponto, soprando levemente através da seringa bem acima do plano das células.

Ajuste a posição da ponta da pipeta até que ela esteja dentro do campo de visão e foque a ponta da pipeta utilizando os botões de foco grosseiro. Neste momento, avalie se o diâmetro interno da pipeta é muito grande ou muito pequeno. Se o diâmetro interno estiver incorreto, substitua por outra micropipeta até encontrar o diâmetro adequado para prevenir a quebra da pipeta na região de coleta.

Use o foco grosseiro para avançar o plano focal antes de mover a ponta da pipeta em direção às células usando os micromanipuladores. À medida que as células ficam mais próximas, use o foco fino até que tanto as células quanto a ponta da pipeta estejam em foco. Interrompa a aplicação de pressão positiva antes de alcançar as células alvo para evitar que sejam removidas do lamínula.

Posicione a ponteira da pipeta com os micromanipuladores de modo que toque o corpo celular a ser colhido. Usando a seringa, aplique sucção suave com a boca até que a célula entre na ponteira da pipeta. Se a célula não estiver entrando na ponteira, mova suavemente a ponteira mais próximo da célula e para baixo até que ela se desprenda do lamínula.

Use o micro manipulador para mover imediatamente a pipeta para cima e para fora da solução. Remova a pipeta do suporte. Segure o tubo einor de 1,7 mililitro preparado em uma das mãos e quebre suavemente a ponta da pipeta na lateral do tubo, próximo ao fundo.

Visando a marca de 0,1 mililitro com a ponta quebrada centralizada dentro do tubo, insira uma agulha acoplada a uma seringa de um mililitro na abertura superior da pipeta. Pressione rapidamente o êmbolo, forçando a solução dentro da pipeta a ser pulverizada para dentro do tubo. Tenha cuidado para não tocar a ponta em nenhum líquido nas laterais do tubo.

Como a ação capilar fará com que o líquido retorne para a pipeta, a célula deve permanecer na ponta extremidade da pipeta, o que deve ser suficiente para expelir adequadamente a célula. Centrifugue rapidamente o conteúdo do tubo utilizando uma microcentrífuga de bancada e congele em gelo seco ou coloque em gelo para processamento posterior ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de nova geração. É mostrado aqui um exemplo de colheita bem-sucedida de um neurônio isolado.

Para começar, foi selecionada uma região com densidade relativamente baixa de células. Em seguida, a ponta da pipeta foi avançada em direção à célula desejada. Aqui, o campo de visão é mostrado após a célula ter sido coletada.

Observe que os processos circundantes permanecem no lamínula. Inversamente, esta figura demonstra duas imagens de pontas de pipeta, que possuem tamanho inadequado para uma colheita eficaz. Esta ponta levará a uma colheita incompleta, enquanto a ponta mostrada aqui resultará na colheita do ambiente circundante.

Após a colheita e uma análise de amplificação de RNA, utilizando um bioanalisador, recomenda-se examinar a distribuição e a quantidade de RNA amplificado. Uma amplificação bem-sucedida a partir de material de célula única produzirá quantidades totais na faixa de microgramas baixos e apresentará uma distribuição suave e ampla. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em minutos, se realizada corretamente; durante este procedimento, é importante utilizar técnicas livres de RNase.