Name: Análise do transcriptoma de uma única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a isolar células únicas de culturas primárias de neurônios de rato para análise do transcriptoma usando amplificação de aRNA. Este método permite estudar a variabilidade da expressão gênica em nível individual.

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Obrigado a Kevin Miyashiro para revestimento e manutenção de culturas de células, ao Dr. Terri Schochet para a prestação de culturas de células para as fotos incluídas neste documento. Além disso, obrigado a Kevin Miyashiro, Peter Dr. Buckley, e Pertiz Tiina para a entrada sobre o procedimento ARNA. Financiamento para este trabalho foi do Instituto Nacional do Envelhecimento, o Instituto Nacional de Saúde Mental e Recursos Humanos fundos Fact Finder a partir da Pensilvânia.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
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<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
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<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
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</ol>

Dr. Eberwine é um inventor da patente ARNA que foi licenciado para LBS tecnologias em que Dr. Eberwine é um accionista.

Notas e solução de problemas <ul><li> Você pode querer tomar antes e depois de imagens mostrando que a célula-alvo foi isolado e que a penumbra restante foi deixado intocado. </li><li> Se demasiada solução é entrar na pipeta como você está colhendo, você pode usar 3 vias Luer-Lock e acessórios para o êmbolo da seringa para manter pressão positiva na tubulação. O volume desejado irá variar com o tipo de processamento, mas até 5 mL deve ser bom para a maioria das aplicações. </li></ul> Dicas gerais sobre técnicas da biologia molecular <ul><li> Vortex todos os tubos de ações e spin-las antes de adicionar a uma reação. NUNCA enzimas vortex. </li><li> Misturar bem reações antes de adicionar a enzima para garantir que o buffer está na concentração adequada. </li><li> Manter o estoque de enzimas a -20 ° C, se possível usando um stratacooler. Caso contrário, remova direito antes do uso, manter no gelo, e retornar imediatamente a -20 ° C. </li><li> Sempre fazer misturas de mestre na elaboração de mais de uma reação para reduzir os erros de pipetagem. Calcular o volume necessário com base no número de amostras e adicionar 10-20%. </li><li> Loja RNA a -80 ° C para a degradação retard. RNA é mais estável armazenados em buffer para retardar apurination de RNA que ocorre em condições ácidas. </li></ul> Esquema Geral do Procedimento ARNA Figura 4A ilustra a primeira rodada do processo de ARNA. Na reação de primeira vertente, a parcela de poli-T da T7-oligo primer (dT) seleciona para as espécies de mRNA (retângulo branco longo) ligando-se à cauda poli. Alguns microRNAs são também polyadenylated e será capturado por esse procedimento. Mais importante, porém, os RNAs mais abundante na célula, RNAs ribossomais, não. Este oligo funciona como um primer para transcriptase reversa para sintetizar uma fita complementar de cDNA (retângulo cinza longo) usando o mRNA como um modelo. A porção do T7 T7-oligo primer (dT) incorpora o promotor T7 RNA polimerase no quadro com a seqüência de antisense para o mRNA de partida. Esta é usada mais tarde na reação in vitro de transcrição. Em seguida, o mRNA no híbrido mRNA / DNA criado na etapa anterior é parcialmente hidrolisada por Rnase H criação de RNA &quot;primers&quot; (pequenos retângulos brancos), semelhante aos fragmentos Okazaki criado em síntese lagging strand DNA. DNA Polimerase I utiliza fragmentos de RNA para preparar a síntese de DNA usando o DNA complementar ao mRNA como um modelo. Quando atinge o fragmento de RNA que vem, seus 5 &#39;para 3&#39; atividade nuclease remove o ribonucleotídeos e substitui-los com desoxirribonucleótidos. DNA ligase é adicionado a qualquer ligadura vertentes em que a substituição da fita líder não está completo. Polimerase DNA T4 é adicionada para preencher as áreas onde fragmentos de RNA serviu como primers inicial para Polimerase DNA eu criar uma ponta e dupla fita de cDNA, que depois é purificado antes de realizar a reação IVT. Na reação IVT, T7 RNA polimerase se liga ao promotor T7 incorporados ao cDNA dupla fita e sintetiza moléculas de RNA antisense (long retângulos pretos), utilizando a vertente sentido como um modelo. Isto serve como etapa de amplificação em que milhares de moléculas de RNA antisense são produzidos a partir de cada molécula de cadeia dupla de cDNA (Figura 4A). A segunda rodada, conforme apresentado na Figura 4B, começa com uma reação de transcrição reversa, que é ligeiramente diferente da primeira rodada desde o RNA de partida é antisense (retângulo preto sólido) e não tem o rabo polyadenylated que foi alvo pela T7-oligo (dT) primário no primeiro turno. Portanto, essa reação é preparado com primers aleatórios (pequenos retângulos cinza) e posteriormente o RNA desnaturado. A reação segunda vertente é, então, preparado pela T7-oligo primer (dT), que se liga ao poli-A seqüência na extremidade 3 &#39;do RNA sentido criado na reação de transcrição reversa anteriores. Outra reação IVT é realizada na mesma maneira que no primeiro turno. Esta segunda ronda geralmente é repetido pelo menos uma vez para atingir três rounds de amplificação de uma única célula. Aplicações As técnicas que apresentamos neste artigo pode ser traduzido em um grande número de aplicações. O protocolo de isolamento única célula pode ser modificado para uso em fatias aguda. 14 Embora tecnicamente mais desafiador, os mesmos princípios se aplicam nesta preparação alternativo. Além disso, se o tamanho da pipeta é ligeiramente ajustada, as gravações da fisiologia das células pode ser feita antes da colheita permitindo uma investigação bem controlados dos mecanismos moleculares por trás saídas fisiológicas. Outra pequena modificação é isolar os processos da soma das células. 15 Para esta aplicação, recolher corpos celulares com uma pipeta e depois voltar com uma pipeta nova e recolher 100-300 Dendrit identificadoses ou axônios por tubo de coleta. 16 Uma vez que as células foram colhidas, as comparações de abundância de mRNA e composições podem ser feitas entre diferentes e mesmo dentro da mesma célula populações. Incorporando-biotinilado UTP no ARNA terceira rodada microarray permite a análise para determinar esses abundâncias mRNA relativo. A composição da população mRNA original pode também ser determinada após o procedimento ARNA utilizando seqüenciamento da próxima geração. O ARNA amplificados também podem ser usados ​​para confirmar os estudos de células fenótipo de conversão em que um conjunto completo de mRNAs de um tipo de célula são transfectadas em um tipo de célula diferente, a fim de induzir a transição do fenótipo do tipo de célula última em que do primeiro, um procedimento desenvolvido pelo laboratório e conhecido como TIPeR 17. Esses estudos são particularmente úteis para o estudo de estados de doença e fenótipos celulares e tais estudos estão em andamento no laboratório. RT-PCR ou qPCR pode ser realizada sobre o material amplificado para confirmar a expressão de genes específicos de células. Além disso, as avaliações da eficiência de transfecção ou transdução pode ser feita no nível da célula única. Vantagens e Limitações Como dito no resumo, o isolamento de células individuais para análise elimina os efeitos média de visto com a análise de populações de células heterogêneas. Estes efeitos média deturpar abundâncias mRNA em uma única célula por excesso de transcrições representando abundante e média para fora e evitar a detecção de muitos de baixa abundância transcrições. Citometria de fluxo pode ser usado para classificar as células individuais, mas este método requer o conhecimento de marcadores celulares específicos e equipamentos caros. 18 microdissecção de captura a laser ou com sistemas de laser UV ou IR microdissecção de captura permitem única célula e até mesmo a captura subcelulares, mas requer células de interesse para estar localizados na superfície de seções muito finas. 19 Semelhante a citometria de fluxo, laser microdissecção de captura também exige equipamentos caros. Um dos principais benefícios da técnica de coleta de eletrodo baseado descrito acima é que valiosos dados eletrofisiológicos pode ser obtido a partir da célula de interesse antes da colheita, permitindo a análise funcional e transcriptoma a ser realizada na mesma célula. 20 A desvantagem da nossa técnica é que exige experiência com micromanipuladores. Investigadores familiarizados com micromanipuladores encontrará esta técnica muito intuitiva, no entanto, os indivíduos com tal experiência será necessário tornar-se confortável com os movimentos bem necessário. Inerentes a qualquer técnica de amplificação é a amplificação preferencial de certas transcrições com base no tamanho e na composição de nucleotídeos. 4,6,7 reação em cadeia da polimerase (PCR), tais como técnicas baseadas transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e amplificação rápida de cDNA termina resultado (RACE) na amplificação exponencial de transcrições, enquanto que o procedimento de amplificação ARNA resultados na amplificação linear. Assim, uma das principais vantagens do procedimento ARNA reside na sua capacidade de preservar melhor a abundância relativa de transcritos mRNA por apenas linearmente ampliando quaisquer erros ou desvios que ocorrem no processo de amplificação em oposição a amplificar exponencialmente disse erros e distorções. O procedimento ARNA juntamente com a análise de microarray permite a comparação da abundância de mRNA entre as células individuais da morfologia semelhantes ou diferentes, tratada ou não. Além disso, material amplificado podem ser enviadas para o seqüenciamento da próxima geração. 5,8 No entanto, o cuidado deve ser tomado em tais análises, pois, em contraste com o uso de primers aleatórios para o procedimento, o procedimento de oligo-dT preparado descrito acima preconceitos amplificação do 3 &#39;extremidades do mRNA e geralmente resulta em redução ligeira de material amplificado subseqüente a cada rodada. Cuidados devem ser tomados na análise dos resultados microarray com métodos padrão como algumas chamadas falsas ausentes podem surgir a partir ligeiramente encurtado material amplificado. Além disso, os resultados enquanto o seqüenciamento vai realmente proporcionar a plena 5 &#39;seqüência da maioria dos mRNA original, a 5&#39; seqüências de alguns mRNA pode ser desperdiçada. Por estas razões, o número de rodadas de amplificações devem ser limitados.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>lamínulas Spiegelglas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura Nunc 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Água para cultivo celular</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Para preparar soluções utilizadas para cultura celular e lavagem de lamínulas</td></tr><tr><td>Polid-L-lisina PM 70-150 k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, ultrapura</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM com Earle&amp;rsquo;sais e GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Para plaqueamento de células</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Citosina beta-D-arabinofuranosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM com Earle&amp;rsquo;s sais e L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Para o cultivo de células</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>suplemento livre de soro B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidro borossilicato (1,5 mm de diâmetro externo, 100 mm de comprimento)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Qualquer pipeta de vidro borossilicato funcionará, desde que o tamanho adequado do orifício seja alcançado. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Qualquer solução funcionará, desde que os componentes não sejam&amp;rsquo;não interferir com qualquer processamento futuro (ou seja, sem Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ou Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Agulha</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>O calibre depende do diâmetro das pipetas</td></tr><tr><td>mistura de dNTPs</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Personalizado</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Tampão da segunda fita (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Fornecido com tampão da segunda fita</td></tr><tr><td>Ligase de DNA de E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Primer aleatórios</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase Reversa</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>no kit (18080-044) acompanha o tampão da primeira fita (Y02321) e DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetador de Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter possui muitos outros modelos, dos quais vários são discutidos no cookbook</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Muitos outros micromanipuladores funcionarão, como os modelos mais recentes da Eppendorf</td></tr><tr><td>Suporte para pipeta</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Variará conforme o micromanipulador e o diâmetro externo da pipeta</td></tr><tr><td>Kit Bioanalyzer RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

análise do transcriptoma de uma única célula

Transcriptome Analysis of Single Cells

Muitas técnicas de análise de expressão gênica confiar no material isolado de populações heterogêneas de células de homogeneizados de tecidos ou células em cultura. 1,2,3 No caso do cérebro, regiões, tais como o hipocampo contém um arranjo complexo de diferentes tipos de células, cada uma com distintos perfis de mRNA. A capacidade de colheita de células individuais permite uma maior investigação detalhada sobre as diferenças molecular entre e dentro de populações de células. Nós descrevemos um método simples e rápido para a colheita de células para posterior processamento. Pipetas muitas vezes utilizados em eletrofisiologia são utilizados para isolar (por meio de aspiração) uma célula de interesse e convenientemente depositá-lo em um tubo Eppendorf para posterior processamento com qualquer número de técnicas de biologia molecular. Nosso protocolo pode ser modificada para a safra de dendrites de cultura de células ou até células individuais de fatias aguda. Descrevemos também o método de amplificação ARNA como uma das principais aplicações a jusante de isolamentos única célula. Este método foi desenvolvido anteriormente por nosso laboratório como uma alternativa a outras técnicas de expressão de genes de análise, como transcrição reversa em tempo real ou reação em cadeia da polimerase (PCR). 4,5,6,7,8 Esta técnica prevê ampliação linear do RNA polyadenylated começando com femtogramas só de material, resultando em quantidades micrograma de RNA antisense. O material amplificado linearmente fornece uma estimativa mais precisa do que a amplificação exponencial da abundância relativa dos componentes do transcriptoma da célula isolada. O procedimento básico consiste em dois rounds de amplificação. Resumidamente, a T7 RNA polimerase promotor local é incorporada dupla cDNA encalhado criado a partir de transcritos no mRNA. Uma noite de transcrição in vitro de reação (FPI) é então feita em que T7 RNA polimerase produz muitas transcrições antisense do cDNA dupla fita. A segunda rodada repete este processo, mas com algumas diferenças técnicas desde a matéria-prima é antisense RNA. É padrão para repetir o segundo turno, resultando em três rounds de amplificação. Muitas vezes, a terceira rodada in vitro a reação de transcrição é realizada utilizando-nucleosídeos trifosfatos biotinilado para que o RNA antisense produzido pode ser cruzados e detectado em um microarray. 7,8

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Muitas técnicas de análise de expressão gênica dependem de material isolado de populações heterogêneas de células provenientes de homogenatos de tecidos ou células em...

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras a partir de células individuais para análise do transcriptoma. Isso é realizado primeiramente localizando uma célula adequada para isolamento. Em seguida, a micropipeta é posicionada ao lado da célula a ser isolada.Em seguida, aplica-se sucção à seringa até que a célula seja puxada para a ponta da micropipeta. O passo final do procedimento consiste em quebrar a ponta da micropipeta dentro do tubo de coleta e expelir o conteúdo remanescente da micropipeta para dentro do tubo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram diferenças nas populações de mRNA entre células por meio de análise de microarranjo do material amplificado utilizando o método de amplificação de arna, também descrito no protocolo, ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de nova geração.Embora este método possa fornecer informações e as diferenças entre células individuais, ele também pode ser aplicado a compartimentos subcelulares, como dendritos ou classes de dendritos, e fornecer informações importantes sobre a função dendrítica. O procedimento será demonstrado por Jennifer Singh, pós-doutoranda no meu laboratório. Antes do início deste protocolo, neurônios primários do dia 18 embrionário, do hipocampo de rato, foram semeados em lamínulas de 12 milímetros em uma placa de 35 milímetros e mantidos conforme descrito no protocolo escrito. Para preparar as pipetas para a coleta, utilize um puxador de micropipetas para puxar pipetas de vidro autoclavadas até um diâmetro apropriado para eletrofisiologia.Usando o programa predefinido do fabricante, o tamanho do orifício não é crítico, já que a ponta será quebrada antes da coleta celular. Armazene cuidadosamente as pipetas em um ambiente livre de poeira, como um frasco de armazenamento para micropipetas, onde as pontas permanecerão intactas até o momento de colher as células. Prepare o número desejado de tubos einor de 1,7 mililitro adicionando dois microlitros de PBS para armazenamento do material colhido.Remova 1 placa de 35 milímetros com lamínulas do incubador em uma cabine de cultura de tecidos. Transfira rapidamente uma lamínula desta placa para a tampa de uma nova placa de 35 milímetros contendo HBSS. É fundamental devolver ao incubador as lamínulas que não estão sendo manipuladas, pois as células se tornam não saudáveis.Se deixado por períodos prolongados de tempo. É necessário um microscópio invertido com objetivo de 40 x equipado com micro manipulador para a coleta celular. Utilize um suporte para pipeta com tubo flexível que se estende para longe do suporte; fixe o tubo a uma superfície estável para evitar movimentos indesejados da pipeta durante a coleta.No final da tubulação, insira uma agulha para que uma seringa de um mililitro com conexão tipo lure lock possa ser acoplada e trocada entre os usuários. Prepare a micropipeta quebrando a ponteira de forma controlada, segurando um lenço de papel Kim firmemente entre os dedos de uma das mãos e passando suavemente a ponta da pipeta sobre o papel de uma a duas vezes. A abertura deve ter aproximadamente 75 a 100% do tamanho da célula alvo.Fixe a micropipeta no suporte da micropipeta e prenda o suporte ao encaixe nos micromanipuladores. Por fim, posicione o objetivo de 40 x. Coloque a placa na platina do microscópio e localize uma região de células adequada para colheita.No caso de culturas neuronais primárias, a célula deve estar relativamente isolada em relação aos seus vizinhos. Para evitar a coleta de células ou processos circundantes, posicione a célula a ser colhida no centro do campo de visão. Use o micromanipulador para avançar a micropipeta em direção à solução no recipiente, inserindo-a no trajeto da luz.Introduza a ponta da pipeta na solução. Olhando através da ocular, a pipeta deve aparecer como uma sombra no campo de visão. Aplique pressão positiva a partir deste ponto, soprando levemente através da seringa bem acima do plano das células.Ajuste a posição da ponta da pipeta até que ela esteja dentro do campo de visão e foque a ponta da pipeta utilizando os botões de foco grosseiro. Neste momento, avalie se o diâmetro interno da pipeta é muito grande ou muito pequeno. Se o diâmetro interno estiver incorreto, substitua por outra micropipeta até encontrar o diâmetro adequado para prevenir a quebra da pipeta na região de coleta.Use o foco grosseiro para avançar o plano focal antes de mover a ponta da pipeta em direção às células usando os micromanipuladores. À medida que as células ficam mais próximas, use o foco fino até que tanto as células quanto a ponta da pipeta estejam em foco. Interrompa a aplicação de pressão positiva antes de alcançar as células-alvo para evitar que sejam removidas do lamínula.Posicione a ponta da pipeta com os micromanipuladores de modo que toque o corpo celular a ser colhido. Usando a seringa, aplique sucção suave com a boca até que a célula entre na ponta da pipeta. Se a célula não estiver entrando na pipeta, mova suavemente a ponta mais próximo da célula e para baixo até que ela se desprenda do lamínula.Use o micromanipulador para mover imediatamente a pipeta para cima e para fora da solução. Remova a pipeta do suporte. Segure o tubo de 1,7 mililitro previamente preparado em uma das mãos e quebre suavemente a ponta da pipeta na lateral do tubo, próximo ao fundo.Visando a marca de 0,1 mililitro com a ponta quebrada centralizada dentro do tubo, insira uma agulha acoplada a uma seringa de um mililitro na abertura superior da pipeta. Pressione rapidamente o êmbolo, forçando a solução dentro da pipeta a ser pulverizada no tubo. Tenha cuidado para não tocar a ponta em nenhum líquido nas laterais do tubo.Como a ação capilar fará com que o líquido retorne para a pipeta, a célula deve permanecer na ponta extremidade da pipeta, o que deve ser suficiente para expelir adequadamente a célula. Centrifugue rapidamente o conteúdo do tubo utilizando uma microcentrífuga de bancada e congele em gelo seco ou coloque em gelo para processamento posterior ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de nova geração. Aqui é mostrado um exemplo de colheita bem-sucedida de um neurônio isolado.Para começar, foi selecionada uma região com densidade relativamente baixa de células. Em seguida, a ponta da pipeta foi avançada em direção à célula desejada. Aqui, o campo de visão é mostrado após a célula ter sido colhida.Observe que os processos circundantes permanecem no lamínula. Inversamente, esta figura demonstra duas imagens de pontas de pipeta, que possuem tamanho inadequado para uma colheita eficaz. Esta ponta resultará em colheita incompleta, enquanto a ponta mostrada aqui levará à colheita do ambiente circundante.Após a colheita e uma análise de amplificação de RNA, utilizando um bioanalisador, recomenda-se examinar a distribuição e quantidade de RNA amplificado. Uma amplificação bem-sucedida a partir de material de célula única produzirá quantidades totais na faixa de microgramas baixos e apresentará uma distribuição suave e ampla. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em minutos se realizada corretamente; ao executar este procedimento, é importante utilizar técnicas livres de RNase.

Research

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Neuroscience

Neurociência

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