Análise do transcriptoma de uma única célula

O objetivo geral deste procedimento é preparar amostras de células únicas para análise do transcriptoma. Isso é feito primeiro encontrando uma célula adequada para isolamento. A micropipeta é então posicionada ao lado da célula a ser isolada.

Em seguida, a sucção é aplicada à seringa até que a célula seja puxada para a ponta da micropipeta. A etapa final do procedimento é quebrar a ponta da micropipeta no tubo de coleta e dejetar o conteúdo restante da micropipeta no tubo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram diferenças nas populações de mRNA entre células por meio da análise de microarray de material amplificado usando o método de amplificação de arna, também descrito no protocolo ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de próxima geração.

Embora esse método possa fornecer informações e as diferenças entre células individuais, ele também pode ser aplicado a compartimentos subcelulares, como dendritos ou classes de dendritos, e fornecer informações importantes sobre a função dos dendritos. Demonstrando o procedimento estará Jennifer Singh, uma pós-doutoranda em meu laboratório Antes do início deste protocolo, os neurônios primários do dia embrionário 18, o rato Hippo Campi foram colocados em lamínulas de 12 milímetros em um prato de 35 milímetros e mantidos conforme descrito no protocolo escrito. Para preparar pipetas para a colheita, use um extrator de micropipetas para puxar as pipetas de vidro da autoclave para um diâmetro apropriado para eletrofisiologia.

Usando o programa predefinido do fabricante, o tamanho do furo não é crítico, pois a ponta será quebrada antes da coleta da célula. Armazene cuidadosamente as pipetas em um ambiente livre de poeira, como um frasco de armazenamento de micropipetas, onde as pontas permanecerão intactas quando estiverem prontas para colher as células. Prepare o número desejado de tubos einor de 1,7 mililitro adicionando dois microlitros de PBS para armazenamento do material colhido.

Remova 1 prato de 35 milímetros de lamínulas da incubadora em uma capa de cultura de tecidos. Transfira rapidamente uma lamínula deste prato para a tampa de um novo prato de 35 milímetros contendo HBSS. É fundamental devolver as lamínulas que não estão sendo manipuladas para a incubadora à medida que as células se tornam insalubres.

Se deixado de fora por longos períodos de tempo. Um microscópio de luz invertida com uma objetiva de 40 x equipado com um micro manipulador é necessário para a colheita de células. Use um porta-pipetas com tubo flexível que se afaste do suporte, fixe o tubo em uma superfície estável para evitar movimentos indesejados da pipeta durante a coleta.

No final do tubo, insira uma agulha para que uma seringa de um mililitro com uma conexão de trava de isca possa ser conectada e trocada entre os usuários. Prepare a micropipeta quebrando a ponta de forma controlada, segurando um lenço Kim esticado entre os dedos de uma mão e escovando suavemente a ponta da pipeta no papel uma a duas vezes. A abertura deve ser de aproximadamente 75 a 100% do tamanho da célula-alvo.

Prenda a micropipeta no suporte da micropipeta e fixe o suporte da micropipeta no inserto dos micromanipuladores. Por fim, defina o objetivo de 40 x. Coloque o prato no microscópio e encontre uma região de células adequada para a colheita.

No caso de culturas neuronais primárias, a célula deve ser relativamente isolada de suas vizinhas. Para evitar a colheita de células e/ou processos circundantes, coloque a célula a ser colhida no centro do campo de visão. Use o micromanipulador para avançar a micropipeta em direção à solução no prato para o caminho da luz.

Abaixe a ponta da pipeta na solução. Olhando através da ocular, a pipeta deve aparecer como uma sombra no campo de visão. Aplique pressão positiva a partir deste ponto, soprando levemente através da seringa bem acima do plano das células.

Ajuste a posição da ponteira da pipeta até que ela esteja dentro do campo de visão e foque a ponteira da pipeta usando os botões de foco do curso. Neste ponto, avalie se o tamanho do furo da pipeta é muito grande ou muito pequeno. Se o tamanho do furo estiver incorreto, substitua por outra micropipeta até que o tamanho correto do furo seja encontrado Para evitar a quebra da pipeta na região de coleta.

Use o foco do curso para avançar o plano focal antes de avançar a ponta da pipeta em direção às células usando os manipuladores micrométricos. À medida que as células se aproximam, use o foco fino até que as células e a ponta da pipeta estejam em foco. Pare de aplicar pressão positiva antes que as células do demandante sejam alcançadas para evitar explodi-las da lamínula.

Posicione a ponta da pipeta com os micromanipuladores de forma que ela toque o soma celular a ser colhido. Usando a seringa, aplique uma sucção suave por via oral até que a célula entre na ponta da pipeta. Se a célula não estiver entrando na pipeta, mova suavemente a ponta para mais perto da célula e para baixo até que ela se levante da lamínula.

Use o micro manipulador para mover imediatamente a pipeta para cima e para fora da solução. Remova a pipeta do suporte. Segure o tubo einor de 1,7 mililitro preparado em uma mão e quebre suavemente a ponta da pipeta na lateral do tubo em direção ao fundo.

Apontando para a marca de 0,1 mililitro com a ponta quebrada centralizada dentro do tubo, insira uma agulha presa a uma seringa de um mililitro na abertura superior da pipeta. Pressione rapidamente o êmbolo, forçando a solução na pipeta a pulverizar para dentro do tubo. Tome cuidado para não tocar a ponta em nenhum líquido nas laterais do tubo.

Como a ação capilar trará o líquido de volta para a pipeta, a célula deve permanecer na ponta da pipeta, e isso deve ser adequado para expelir adequadamente a célula. Gire rapidamente o conteúdo do tubo usando uma micro fuga de mesa e congele em gelo seco ou coloque no gelo para processamento posterior ou para outras aplicações, como PCR ou sequenciamento de próxima geração. Aqui é mostrado um exemplo de uma colheita bem-sucedida de um neurônio isolado.

Para começar, uma região de densidade relativamente baixa de células foi selecionada. A ponta da pipeta foi então avançada em direção à célula desejada. Aqui, o campo de visão é mostrado após a célula ter sido colhida.

Observe que os processos circundantes permanecem na lamínula. Por outro lado, esta figura demonstra duas imagens de pontas de pipeta, que são de tamanho inadequado para uma colheita eficaz. Esta dica levará a uma colheita incompleta, enquanto a dica mostrada aqui resultará na colheita do meio circundante.

Após a colheita e a análise de amplificação de RNA A, recomenda-se o uso de um bioanalisador para examinar a distribuição e a quantidade de RNA amplificado. Uma amplificação bem-sucedida de material de célula única produzirá quantidades totais em microgramas baixos e terá uma distribuição suave e ampla Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em minutos se executada corretamente durante a execução deste procedimento, é importante usar a técnica livre de RNA.