Name: Isolamento de Drosophila melanogaster Testes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Aprenda a isolar testículos de Drosophila melanogaster machos de zero a três dias usando agulhas de dissecação e PBS gelado. Este método rápido preserva a integridade tecidual para análises de RNA e proteínas.

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Os autores agradecem Vasia Vagin para introduzir esta técnica em nosso laboratório.

<ol><li> Faça uma lâmina de vidro com um fundo preto: Corte papel 20 # branco para o mesmo tamanho que a lâmina de microscópio. Lado uma cor do papel preto deslize tamanho usando um marcador permanente (por exemplo, a Sharpie). Aplicar cola branca (Elmer) para o lado negro e aderir o papel para o slide. O slide pode ser reutilizado. Usando ¾ "tape label (Fisherbrand), assegurar a lâmina de microscópio, com o lado de vidro para cima, para o bloco de voar CO 2 para corrigi-lo no lugar. </li><li> Coletar 0-3 dias moscas macho velho. </li><li> Prepare um balde de gelo, tampão fosfato (PBS), agulhas de dissecção. </li><li> Anestesiar 5-10 voa usando um fluxo de CO 2 e transferi-los a partir da garrafa ou frasco para a plataforma de voar perto da lâmina de microscópio. </li><li> Pipetar 50 ul ~ gelada PBS em uma queda no meio da lâmina de microscópio. </li><li> Gentilmente pegar uma mosca do sexo masculino com a agulha de dissecação por imersão a agulha de dissecação em PBS, toque suave no lado ventral (isto é, perto das asas) da mosca-lo com a agulha no lugar gota de PBS. </li><li> Coloque uma agulha no meio da mosca, entre o tórax eo abdômen, empurrando para baixo com firmeza. Coloque a outra agulha entre a sexta (A6) e (A7), sétimo segmentos abdominais (as listras segundo e terceiro do fundo); puxe o abdômen de distância do tórax. </li><li> Tease os testículos para além de outros órgãos, especialmente o intestino. Especialmente em mutantes branco, testículos e intestino parecem semelhantes. Principais diferenças são que os testículos sempre vêm em pares, cada testículo tem um padrão de espiral e é mais do que na cor branca intestino. </li><li> Armazenar os testículos na gelada PBS em um tubo de microcentrífuga de polipropileno. </li></ol> Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vista dorsal do sistema reprodutor masculino, a partir de flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flubase atribuição:... "Depois de A Figura 38 na página 508 de Miller (1950) A. Miller A anatomia interna e histologia da imago de Drosophila melanogaster Em M. Demerec, editor, Biologia da Drosophila, capítulo 6, páginas 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edição fac-similar de 1994. Copyright 1994 por Cold Spring Harbor Laboratory Press. Usado com permissão tipo de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Ver <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> ".

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós fornecemos um protocolo para isolar os testículos de adultos do sexo masculino Drosophila melanogaster. Porque a técnica exige uma coordenação de duas mãos, a habilidade só vem com a prática.

<table><tbody><tr><td>Agulha de dissecação</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas microscópicas, lisas</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Luz de microscópio</td><td>Ferramenta</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Ferramenta</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Sistema completo Benchtop Flowbuddy</td><td>Ferramenta</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Umificador de bolhas</td><td>Ferramenta</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de enchimento com esfera</td><td>Ferramenta</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Fita de etiquetas &amp;#190;&amp;#8221;</td><td>Suprimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de drosophila melanogaster testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Os testículos de Drosophila melanogaster fornecer um importante modelo para o estudo de manutenção de células-tronco e diferenciação, a meiose, e soma-germline interações. Testículos são normalmente isoladas de machos adultos 0-3 dias após a eclosão do caso pupal. Os testículos de tipo selvagem moscas são facilmente distinguidos de outros tecidos, porque eles são o amarelo, mas os testículos de branco moscas mutantes, um fundo genético comum para experiências de laboratório são similares em forma e cor para o intestino da mosca. Realizar a dissecção de uma lâmina de vidro com um fundo preto torna a identificação dos testículos consideravelmente mais fácil. Testículos são removidos da voa usando agulhas de dissecção. Comparação com protocolos que utilize uma pinça para dissecção dos testículos, o nosso método é muito mais rápido, permitindo que um indivíduo bem praticada para dissecar testículos 200-300 do tipo selvagem voa por hora, produzindo 400-600 testículos. Testículos de moscas brancas ou de mutantes que reduzir o tamanho dos testículos são mais difíceis de dissecar e normalmente produzem 200-400 testes por hora.

Testículos Drosophila melanogaster pode ser rápida e eficiente isoladas dos machos adultos usando agulhas de dissecção. Com a prática, pode-se facilmente isolar em um ou dois dias uma quantidade de testes suficientes para a análise de DNA ou RNA por seqüenciamento de alto rendimento ou mais tradicionais métodos de biologia molecular ou de proteínas para ensaios de anticorpo ou enzima-based.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

Os testículos de Drosophila melanogaster fornecem um modelo importante para o estudo da manutenção e diferenciação de células-tronco, da meiose e da interação soma-linhagem germinativa...

O objetivo geral deste procedimento é isolar testículos de drosófilas machos (Drosophila melanogaster) com idade entre zero e três dias. Isso é realizado anestesiando moscas machos e disseccionando seus testículos em uma gota de PBS frio sobre gelo, sob um microscópio, utilizando duas agulhas de dissecação para puxar o abdômen da mosca para longe do tórax.Por fim, separe cuidadosamente os testículos do restante do tecido e colete-os para uso em diversas técnicas analíticas, como imunofluorescência, coloração ou isolamento de RNA total e proteínas. A demonstração visual deste método é essencial, pois a identificação dos testículos dissecados pode ser difícil de aprender, já que são difíceis de distinguir do intestino. A demonstração do procedimento será realizada por Shemei Ma, uma técnica do meu laboratório.Primeiro, monte um balde com gelo, agulhas de dissecação e cerca de 100 mililitros de solução salina tamponada com fosfato. Coloque o PBS no balde de gelo para resfriar. Prepare uma lâmina de microscópio com fundo preto cortando papel branco de 20 libras para ajustá-lo à lâmina.Em seguida, pinte um dos lados de preto. Usando uma caneta permanente, cole o papel no lugar sobre a lâmina e fixe a lâmina no suporte de CO2. Sob um microscópio estereoscópico, anestesie um frasco de moscas com zero a três dias de idade com um fluxo de CO2 e despeje-as sobre o suporte.Próximo à lâmina de microscópio fixada, identifique moscas machos pelos seus ganchos de acasalamento caracteristicamente escuros e separe entre 50 e 100. Pipete cerca de 50 microlitros de PBS gelado no centro da lâmina de microscópio, formando uma gota. Pegue uma mosca macho mergulhando uma agulha de dissecação na gota de PBS e tocando suavemente o lado ventral da mosca, fazendo com que ela adira à agulha.Coloque a mosca na gota de PBS e pressione firmemente uma agulha entre o tórax e o abdômen da mosca. Pressione a outra agulha entre os segmentos abdominais sexto e sétimo e, em seguida, puxe o abdômen para longe do tórax. Separe os testículos dos demais órgãos, especialmente do intestino, que pode parecer semelhante, para ajudar a diferenciar os testículos do intestino.Lembre-se de que os testículos sempre aparecem aos pares, têm forma espiral característica e são mais brancos do que o tecido intestinal. Colete os testículos em um tubo de microcentrífuga contendo PBS gelado e mantenha em gelo, onde podem ser armazenados por várias horas. Uma vez dominado o procedimento, uma mosca pode ser dissecada em menos de um minuto.Outros métodos, como o sequenciamento profundo de RNAs de silenciamento pequenos ou microRNAs, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: como o repertório de RNAs muda em uma mosca mutante específica?

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Biologia

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O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em&gt; Drosophila</em&gt; Folículo Isolamento

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Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

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Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

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Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Aprenda a isolar testículos de Drosophila melanogaster machos de zero a três dias usando agulhas de dissecação e PBS gelado. Este método rápido preserva a integridade tecidual para análises de RNA e proteínas.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

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