Name: Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Explore a análise de sequências genômicas usando ferramentas computacionais para detectar composições não aleatórias de nucleotídeos. Este recurso identifica regiões enriquecidas em genomas de diversos organismos.

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Somos gratos a Samuel Shepard, Bazeley Peter, David e John Bell para a administração da Genomic páginas web de ressonância magnética. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Carreira prémio &quot;Investigação de papéis intron celular&quot; [número de concessão MCB-0643542].

Todos os programas usados ​​no papel ter sido escrito usando perl, e todas as páginas web foram criados usando PHP. 1. Ponto de partida: Abra a home page do pacote de Genomic on-line por ressonância magnética no http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. O recurso da Web também oferece instruções / explicações sobre os programas do "Ajuda (How-to/README)" link, enquanto todos os materiais publicados no Genomic algoritmos de ressonância magnética e similares são listadas na seção "Links para recursos relevantes" link. 2. Preparação e Upload de seqüência de entrada (s). Crie um arquivo com FASTA-formatado seqüência (s) para iniciar uma sessão de análise GMRI. Cada seqüência de nucleotídeos neste formato deve ser precedido com uma única linha de partida com o caracter "&gt;" que representa um identificador, seguido na mesma linha por uma breve descrição dessa seqüência. Seqüências de nucleotídeos para análise GMRI também permite que personagens como R, Y, N, X, etc Hwever, não-A, T, C, G caracteres não serão processados ​​pelo programa e será ignorado. Seqüências em que os elementos repetitivos têm sido "mascarados" (substituído por "N" s) pode ser usado como entrada. Observe que os caracteres seqüência são case insensitive. <ol><li> Iniciar uma sessão GMRI clicando no "iniciar ou retomar" botão na página inicial Genomic MRI. Isso leva o usuário a uma página onde seqüências de nucleotídeos podem ser carregado. </li><li> Copie e cole o FASTA-formatado seqüências ou fazer upload de um arquivo contendo as seqüências de seu computador local usando a "escolha o arquivo" botão. </li><li> Clique no botão "Iniciar sessão nova com este arquivo" botão. Uma mensagem de confirmação deve aparecer acima da janela de entrada afirmando que "Sua seqüência foi enviada com sucesso" e você deve também ter uma alfanuméricos "GMRI identificador" [o site chama-lhe um "rótulo sessão"] para a sua sessão (por exemplo, b16yMj), que pode ser usado para recuperar e continuar a sessão por até duas semanas após a primeira utilização. </li></ol> NOTA: A partir de agora as seqüências de entrada são referidos como "userfile". 3. Obter uma distribuição de freqüência de Oligonucleotídeos das Seqüências de Entrada (opcional). Clique no botão "Analyzer SRI" tab (linha superior), a fim de obter uma distribuição de freqüências de oligonucleotídeos para todo o conjunto de seqüências de entrada. A sigla SRI representa curto alcance não homogeneidade. Nesta conjuntura, o usuário pode especificar o comprimento máximo de oligonucleotídeos (de 2 até 9 nucleotídeos, padrão 6 nts) para os quais frequências serão calculados. Esta seleção é feita clicando na opção desejada dentro do "Maximum oligômero tamanho" caixa de listagem. Em seguida, pressione o botão "Analyze File" botão para iniciar a computação. Uma representação aproximada da composição seqüência de entrada será imediatamente aparecem como uma pequena tabela no meio desta página web e para download como "userfile.comp.tbl". Esta tabela representa apenas os oligonucleotides mais e menos abundantes no seqüências de entrada. A tabela de freqüência inteira para todos oligonucleotides possível é gerado como um arquivo chamado "userfile.comp", que pode ser obtido através do "Download composição arquivo" link. NOTA: SRI analisador conta todo o conjunto de todos os oligonucleotides sobrepostas. 4. Gerar seqüências aleatórias com a mesma composição de Oligonucleotídeos Como no seqüências de entrada (opcional). (Conclusão da etapa 3 do protocolo é necessário para esta tarefa). <ol><li> Clique em "Gerador de SRI" tab (fila de cima) para abrir uma nova página da web que cria seqüências aleatórias. Escolha o número de amostras de seqüências aleatórias a ser gerado usando a caixa de lista nesta página web. Cada um desses arquivos de exemplo conterá seqüências aleatórias do mesmo número e extensão, como as seqüências de entrada em "userfile". Além disso, se uma seqüência de entrada contém caracteres não-A, T, C, G ou caracteres, a seqüência aleatória terá "N" s exatamente as mesmas posições que na seqüência de entrada. </li><li> Escolher o maior comprimento de oligonucleotídeos para os quais frequências serão aproximada em seqüências aleatórias. Isto pode ser escolhido por selecionando a opção para o nível desejado oligômero (por exemplo, "4-mers" por quatro-base oligonucleotides) na tabela no centro da tela. É de se notar aqui que as seqüências aleatórias consistirá não só as freqüências aproximadas ao nível oligômero escolhido, mas também as frequências correspondentes de níveis menores de oligômero, como nas seqüências de entrada. Pequenas flutuações na oligonucleotídeofreqüências de entrada e seqüências aleatórias são possíveis devido ao procedimento de Modelo Markov aplicados para a geração de seqüências aleatórias. </li><li> Inicie o programa clicando no botão "Gerar Arquivo" botão. Se as seqüências de entrada são grandes pode demorar alguns minutos para gerar seqüências aleatórias. Assim, um usuário deve esperar até que azul "Download" links aparecem na parte inferior desta página. Os conjuntos aleatórios são colocados em arquivos com nomes como "userfile.randX_Y", onde X é o número do conjunto de forma aleatória e Y é o nível de oligômero escolhido (por exemplo, "userfile_rand2_4"). </li></ol> 5. Análise do Médio heterogeneidade (MRI) de entrada e seqüências aleatórias. <ol><li> Clique no botão "MRI Analyzer" guia (linha superior), que abre uma nova página da web que analisa a heterogeneidade de gama média da composição de nucleotídeos das seqüências. </li><li> Selecione uma seqüência a ser analisada a partir do "File para analisar" caixa de lista (uma escolha entre a seqüência de entrada e conjuntos de seqüências geradas aleatoriamente podem ser feitas aqui). </li><li> Escolha o tipo de conteúdo de ressonância magnética para ser analisado através da caixa de lista fornecida. (Sete opções de conteúdo estão disponíveis: G + C; G + A; G + T; A; G, C, ou T.) </li><li> Escolher o comprimento da janela para que as seqüências de conteúdo rico e pobre em conteúdo será analisado através do "Window size" caixa de listagem (o padrão é de 50 nucleotídeos, o intervalo válido é de 3-10). </li><li> Escolha o limite superior e limite inferior para as regiões ricas em conteúdo e conteúdo-pobres, respectivamente. Esses limites podem ser definidos pelo número exato de nucleotídeos em particular na janela atual (usando a opção número por na caixa de listagem) ou por porcentagem desses nucleotídeos na janela (usando a opção pelo percentual) </li><li> Depois de todas as cinco escolhas já foram feitas (por exemplo: Seqüência = "userfile"; Content = GC; tamanho da janela = 50; limite superior = 35; limite inferior = 15), chamar o programa, premindo o botão Analyze File. O programa varre todas as seqüências a partir da entrada selecionada consecutivamente. A cada passo que obtém um segmento da corrente de seqüência com comprimento igual ao tamanho da janela especificada e calcula se o número ou a percentagem de nucleotídeos do conteúdo escolhido estiver acima do limite superior ou abaixo do limiar inferior. Se a janela não corresponde nem critérios, a próxima janela sobrepostas (desviado por um nucleotídeo) é selecionado para a mesma análise. Quando uma janela é encontrada onde a seqüência de cumprir um dos requisitos de limite para conteúdo rico composição ou pobres, o programa salva a seqüência desta janela no arquivo de saída e gera um aumento na saída gráfica. Após isso, o programa salta para a janela não se sobrepõem próxima adjacentes e recomeça o processo de digitalização até o fim da seqüência seja alcançado. </li><li> Após a conclusão do programa, um link para o arquivo de saída (com o nome "userfile_GC_50_35 .. 15" para o exemplo acima) aparece e uma representação gráfica dos resultados é exibido no meio da página web (veja Figura 1). Nesta apresentação gráfica todas as seqüências de entrada do userfile são concatenadas em uma única seqüência e apresentados como uma linha preta horizontal no eixo X, com comprimento em kilobases (kb) mostrado abaixo. Todas as regiões ricas em conteúdo ao longo de seqüências de entrada são marcados como azul "para cima" espigões, e conteúdo dos pobres regiões como o vermelho "para baixo" picos. O número total de janelas de conteúdo rico e conteúdo dos pobres são mostrados na parenthses na legenda na parte inferior desta figura (32 e 19, respectivamente). A figura serve para ilustrar a relativa abundância eo arranjo das regiões de ressonância magnética. Enquanto isso, os detalhes específicos são apresentados no arquivo de saída (ver Figura 3). Neste arquivo, todos os segmentos de seqüência de nucleotídeos que correspondem conteúdo rico ou pobre em critérios e suas coordenadas estão disponíveis para um usuário como uma lista de acordo com suas posições consecutivas ao longo do arquivo de entrada. </li><li> Após a conclusão da análise de MRI para a seqüência escolhido um usuário pode iniciar um novo processo na mesma página da web, fazendo mudanças nos parâmetros e / ou arquivos de entrada. Por exemplo, a fim de analisar a amostra aleatória gerada anteriormente # 1 com os mesmos parâmetros de ressonância magnética, o usuário só precisa mudar o arquivo de opção para analisar e selecionar o arquivo "userfile_rand1_4" e pressione o botão Arquivo Analisar novamente. Um novo arquivo e display gráfico irá substituir o antigo. Os resultados e os números de todos os exames em cada "sessão lable" (GMRI identificador) será salvo e estará disponível por duas semanas a partir da última atividade. A fim de salvar os resultados / figmentos de forma permanente, o usuário deve selecionar o "Download Files" guia (linha superior) e baixar a sessão inteira ou arquivos individuais, conforme necessário. </li><li> Com esta página web MRI Analyzer um usuário pode estudar <ul><li> (G + C) ricos e (A + T) regiões ricas </li><li> Purina (A G +)-ricos e pirimidina (C + T) regiões ricas </li><li> Keto (G + T) e rico em aminoácidos (A + C) regiões ricas </li><li> A-regiões ricas e pobres A- </li><li> G-regiões ricas e pobres G- </li><li> T-regiões ricas e pobres T- </li><li> C-ricos e pobres regiões C- </li></ul></li><li> A última versão do MRI Genomic tem uma nova opção para o estudo de regiões ricas em purinas (R) / Pirimidina (Y) padrões de alternância que pode formar Z-DNA conformações. Atualmente, essa opção está disponível no link "Z-DNA" e funciona na mesma base de outras regiões acima de ressonância magnética. Um usuário deve selecionar limiares superior e inferior para o número de (RY + YR) dinucleotídeos sobreposição na janela de digitalização. O programa produz uma saída semelhante gráfica e um arquivo de segmentos de DNA enriquecido e empobrecido por uma alternância de purinas e pirimidinas. O suposto Z DNA-regiões devem ser altamente enriquecido por uma alternância R / Y bases (ver revisão F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Programas adicionais dentro do pacote Genomic MRI (opcional). O recurso Genomic RM também tem duas opções avançadas para a geração de muito específico seqüências aleatórias. Eles estão disponíveis através do "Gerador de ressonância magnética" e "Generator CDS" tabs na linha superior. <ol><li> Gerador de MRI cria sequências ao acaso, com a mesma composição de oligonucleotídeos como o arquivo de entrada (semelhante ao SRI gerador). No entanto, além disso, seqüências randomizado imitar um determinado padrão de ressonância magnética especificado pelo usuário. Dentro desta página web, o usuário deve especificar a partir de uma caixa de listagem um determinado padrão de ressonância magnética para ser imitado. A caixa de lista contém todos os padrões que foram examinados nesta sessão por MRI analisador (por exemplo, "userfile_GC_50_35 .. 15"). A seqüência aleatória gerada com esta opção terá a mesma composição de oligonucleotídeos como o arquivo de entrada selecionado e também o mesmo GC-ricos e dos pobres padrões como visto em "userfile_GC_50_35 .. 15". </li><li> CDS gerador é usado para a randomização de sequências codificadoras de proteínas. Preserva a mesma seqüência de aminoácidos como a codificadas pela entrada especificado pelo usuário. Além disso, o programa mantém o mesmo códon e di-codon preconceitos, conforme especificado no usuário escolhido tabela de entrada. A versão online do gerador CDS também aceita uma seqüência de proteína como entrada. Todas as outras opções para o programa são oferecidas somente via stand-alone scripts Perl disponível para download a partir da página principal do web Genomic MRI. </li></ol> 7. Resultados representante Este protocolo permite que um usuário para estudar falta de homogeneidade de composição de seqüências de nucleotídeos. Importante, ele também suporta a geração de uma variedade de sequências ao acaso, com uma composição de oligonucleotídeos que se aproxima daquela das seqüências de entrada. Geralmente, as seqüências genômicas dos eucariotos complexos não são homogêneos em composição, mas representam um complexo mosaico de segmentos seqüência enriquecida por nucleotídeos particular (por exemplo, rica em purinas, (G + T)-ricos, (A + T), rico em etc.) Estes padrões de mid-range escala (3-10 pb) são visualizados através da saída gráfica do analisador de ressonância magnética que mostra selecionados conteúdo rico segmentos como superior picos de azul e de conteúdo pobre em segmentos como menores picos de vermelho (ver figuras 1 e 2). Normalmente, o número de todas as regiões ricas em conteúdo e conteúdo dos pobres em uma seqüência natural (Figura 1) é da ordem de vezes maior do que o número dos mesmos tipos de regiões em seqüências correspondentes ao acaso (Figura 2) com o oligonucleotídeo mesmo composição. Estes segmentos seqüência com mid-range heterogeneidade na composição de nucleotídeos podem ser de interesse para o usuário. Eles estão disponíveis a partir da Genomic arquivos de saída de ressonância magnética para investigação adicional. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um exemplo da saída analisador MRI gráfica a partir do passo 5.7. Os resultados foram obtidos em uma amostra de 44 introns humana. Barras azuis representam as posições de regiões ricas em GC ao longo destes íntrons. Barras vermelhas representam GC-pobre (ou AT-ricos) MRI regiões. O eixo y contém limiares superior e inferior para o tipo de conteúdo. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisador de saída MRI para a seqüência aleatória "userfile.rand1_4". O graphical representação de ressonância magnética dentro de uma seqüência aleatória gerada utilizando o programa gerador de SRI. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Um exemplo do início de um arquivo de saída textual de analisador de ressonância magnética. Todas as seqüências de conteúdo rico e pobre de conteúdo detectado pelo programa são apresentados na coluna (quarto) passado. Suas posições relativas, medido em número de janelas, são mostrados na primeira coluna. A segunda e terceira colunas são indicadores para as regiões ricas em conteúdo e conteúdo-pobres, respectivamente.

<ol><li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li>
<li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li>
<li>Fedorov, A., Fedorova, L. Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedorov%2C+A+%22Advances+in+Genomic+Sequence+Analysis+and+Pattern+Discovery%22">Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery</a>. , 65-91 (2010).</li>
<li>Shepard, S. S. Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+characterization+and+utilization+of+middle-range+sequence+patterns+within+human+genome+%5B%5D%22">The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]</a>. , The University of Toledo. 57-157 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Regiões com a composição de nucleotídeos não homogênea na mid-range escalas (3-10 nucleotídeos) são superabundantes nos genomas de eucariotos complexos e podem ser encontrados em qualquer lugar (regiões intergênicas, íntrons, as regiões não traduzidas dos exons, elementos repetitivos). Estas regiões são freqüentemente associados com conformações DNA incomum. Por exemplo, sequências purine-/pyrimidine-rich tendem a formar triplexes DNA (H-DNA); seqüências com a alternância de purina / pirimidina bases estão associados com Z-DNA conformações; (G + C) regiões ricas apresentam anormalidades estruturais no B- DNA e pode ser propenso a clivagem backbone; (A + T) regiões ricas podem formar uma estrutura incomum - um elemento DNA descontrair, etc (revisado por Fedorov &amp; Fedorova 2010). Alguns desses padrões de gama média (por exemplo, (G + T) regiões ricas) são mal investigados e ainda aguardam exploração completa e reconhecimento. O objetivo principal do nosso recurso web Genomic MRI é ajudar os usuários na identificação destas regiões RM para sua posterior análise experimental e para a exploração de suas possíveis funções. Conhecimento das regiões de ressonância magnética poderia ser incorporada e melhorar a nova geração de programas preditor gene (Shepard 2010) e avançar a nossa compreensão das funções do genoma e propriedades.

<ul><li> Computador com Internet </li><li> Arquivos com seqüências de nucleotídeos para exame. </li></ul>

genômica mri - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de dna genômico

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Regiões não codificantes do genoma em eucariotos complexos, incluindo áreas intergênica, introns e exons segmentos não traduzida, são profundamente não-aleatórios em sua composição de nucleotídeos e consistem em um complexo mosaico de padrões de seqüência. Estes padrões incluem a chamada Faixa de Mid-homogeneidade (MRI) regiões - seqüências de 3-10 nucleotídeos de comprimento, que são enriquecidas por uma base ou combinação de bases (por exemplo, (G + T)-ricos, ricos em purinas, etc ). MRI regiões estão associadas com estruturas de DNA incomum (não-forma B) que muitas vezes são envolvidos na regulação da expressão gênica, recombinação, e outros processos genéticos (Fedorova &amp; Fedorov 2010). A existência de um viés de fixação forte dentro das regiões de ressonância magnética contra mutações que tendem a reduzir sua heterogeneidade seqüência adicionalmente suporta a funcionalidade e importância dessas sequências genômicas (Prakash et al. 2009). Aqui demonstramos um recurso Internet disponível gratuitamente - o pacote de programas Genomic MRI - (. Bechtel et al 2008) concebidos para a análise computacional de seqüências genômicas, a fim de encontrar e caracterizar vários padrões de ressonância magnética dentro deles. Este pacote também permite a geração de sequências ao acaso, com várias propriedades e nível de correspondência para as seqüências de DNA natural de entrada. O objetivo principal deste recurso é facilitar o exame das vastas regiões de DNA não-codificante que ainda são pouco investigados e aguardam exploração completa e reconhecimento.

Apresentamos um sítio web público computacional para análise de seqüências genômicas. Ele detecta padrões de seqüência de DNA com vários não-aleatória composições de nucleotídeos. Este recurso também gera sequências ao acaso, com diversos níveis de complexidade.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Regiões genômicas não codificantes em eucariotos complexos, incluindo áreas intergênicas, íntrons e segmentos não traduzidos de éxons, são profundamente não aleatórias em...

O objetivo geral deste procedimento é explorar a não aleatoriedade em faixa intermediária, também chamada de heterogeneidade, de uma sequência genômica especificada pelo usuário. Isso é realizado primeiramente examinando a composição de oligonucleotídeos de uma sequência de entrada e gerando uma tabela de frequência dos oligonucleotídeos que compõem a sequência. Esse objetivo é alcançado invocando o programa SRI Analyzer.O segundo passo é produzir sequências aleatórias que tenham exatamente a mesma composição de oligonucleotídeos da sequência de entrada. Isso é obtido invocando o programa gerador SRI. O terceiro passo do procedimento é encontrar segmentos dentro das sequências de entrada e aleatorizadas que estejam significativamente enriquecidos com um determinado nucleotídeo ou combinação de nucleotídeos, por exemplo, GC ou ag.Esse objetivo é alcançado pelo programa MRI Analyzer. O passo final do procedimento é baixar os arquivos contendo as sequências de todas as regiões MRI detectadas pelo programa. Em última análise, podem-se obter resultados que mostram que a maioria das regiões genômicas de árias multicelulares está significativamente enriquecida por segmentos contendo extremos na composição de bases detectados para cada um dos quatro nucleotídeos ou qualquer combinação deles.Essas regiões homogêneas estão associadas a conformações incomuns do DNA e/ou a propriedades particulares do DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da genômica, como a identificação de elementos de DNA potencialmente funcionais dentro de vastas áreas de sequências não codificantes, incluindo regiões intergênicas ou regiões regulatórias. Embora este método possa fornecer informações sobre genomas de mamíferos, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como invertebrados, plantas, fungos e bactérias.Abra a página inicial do pacote online GRI (genomic mid-range in homogeneity ou G GM I) em www.bioinfo.utoledo.edu/gri/, o recurso da web. Também fornece informações detalhadas sobre os programas no link de ajuda Como Ler.Embora todos os materiais publicados sobre MRI genômica e algoritmos semelhantes estejam listados nos links para recursos relevantes, crie um arquivo com uma sequência formatada rapidamente para iniciar uma sessão de análise A-G-M-R-I. Uma sequência formatada rapidamente começa com um circunflexo ou com o símbolo de maior que, seguido por um identificador único ou nome e a sequência nas linhas seguintes. Apenas nucleotídeos T, G, A e C serão processados pela MRI genômica, embora outros caracteres de entrada sejam permitidos.O arquivo de sequência do gene PKD1 é utilizado. Para demonstrar a sessão, pressione o botão iniciar. Isso abre uma nova página da web, que oferece a opção de copiar e colar a sequência de entrada na janela fornecida, ou caso o arquivo seja grande.Para fazer o upload, clique no botão escolher arquivo para carregar um arquivo. Navegue até o arquivo desejado. Em seguida, clique no botão iniciar esta sessão com este arquivo. Uma confirmação de que o arquivo foi carregado com sucesso será exibida na parte superior da página abaixo.Esta mensagem é um identificador da sessão atual, que neste caso é C oito EP zero seis. Para analisar a baixa homogeneidade do intervalo curto da sequência de entrada, clique no botão analisar baixa homogeneidade do intervalo curto. O programa abre uma nova página, especificamente projetada para a execução do programa SRI Analyzer.Aqui, precisamos escolher o comprimento máximo dos oligonucleotídeos a serem examinados. Como nossas sequências de entrada têm tamanho médio de aproximadamente 50.000 nucleotídeos, selecionamos os formadores como o comprimento máximo de oligonucleotídeos para os quais as frequências serão calculadas. Por fim, precisamos pressionar imediatamente o botão analisar arquivo.O programa calcula as frequências de todos os oligonucleotídeos do comprimento escolhido e de comprimentos menores dentro da sequência de entrada. Para visualizar as frequências de todos os oligonucleotídeos, clique no link baixar arquivo de composição. Este arquivo é nomeado arquivo do usuário.com representa uma tabela com três colunas. A primeira coluna especifica os oligonucleotídeos. A segunda representa suas frequências relativas, e a terceira representa o número de ocorrências de oligonucleotídeos na sequência de entrada.Para gerar sequências randomizadas com a mesma composição de oligonucleotídeos do arquivo de entrada, clique na aba gerador SRI. Na nova página, escolha o número de amostras de sequências aleatórias a serem geradas. Cada uma dessas amostras conterá sequências aleatórias com o mesmo número e comprimento das sequências de entrada no arquivo do usuário.Neste exemplo, o arquivo do usuário é a sequência do gene PKD1. Em seguida, escolha o comprimento mais longo de oligonucleotídeos para o qual as frequências serão aproximadas nas sequências randomizadas, selecionando o botão de opção para formadores, que representa oligonucleotídeos de quatro bases. Em seguida, escolha dois como o número de amostras de sequências randomizadas a serem geradas.Por fim, inicie o programa clicando no botão gerar arquivo para as sequências de entrada de centenas de milhares de nucleotídeos. Pode levar alguns minutos para gerar sequências aleatórias. Portanto, aguarde até que links de download azuis apareçam na parte inferior desta página.Para analisar a homogeneidade na faixa intermediária de sequências de entrada e aleatórias, clique na guia analisador de RMI. Na nova página, selecione uma sequência a ser analisada na caixa de listagem de arquivos para análise. Em seguida, escolha conteúdo de GC a partir da lista de sete tipos de conteúdo.O conteúdo GC representa a composição de G mais C. O campo de tamanho da janela permite a seleção do comprimento da janela para a qual serão examinadas sequências ricas e pobres em conteúdo. Mantenha o tamanho padrão da janela de 50 nucleotídeos.Por fim, escolha os limites superior e inferior para regiões ricas em conteúdo e pobres em conteúdo, respectivamente. Esses limites podem ser definidos pelo número de nucleotídeos específicos na janela atual ou pela porcentagem desses nucleotídeos na janela. Neste caso, vamos inicialmente escolher valores aleatórios de 60% para o limite superior e 30% para o limite inferior.Em seguida, pressione o botão para analisar o arquivo. Após isso, um link para o arquivo de saída aparece e uma representação gráfica dos resultados é exibida. Todas as regiões ricas em conteúdo ao longo da sequência de entrada são marcadas como picos azuis ascendentes e as regiões pobres em conteúdo como picos vermelhos descendentes. O gráfico mostra que há muitos picos azuis que indicam regiões ricas em GC e muito menos picos vermelhos que indicam regiões pobres em GC.Isso significa que os parâmetros escolhidos não são ideais. Para a próxima iteração, utilize um limite superior de 75% e um limite inferior de 32%. Novamente, inicie o analisador de RNM clicando no botão analisar arquivo.O novo gráfico mostra que, mesmo para os novos parâmetros muito mais rigorosos, existem centenas de picos azuis. Portanto, aumente o limite superior para 80% e repita os cálculos. O novo gráfico mostra que 62 regiões ricas em GC possuem conteúdo de GC maior ou igual a 80% e 28 regiões pobres em GC com conteúdo de GC abaixo de 32%. Em seguida, compare os resultados do arquivo de entrada com as duas sequências randomizadas que possuem a mesma composição de oligonucleotídeos que o gene PKD1.Para fazer isso, altere a sequência do gene PKD um para a aleatória usando a caixa de seleção do arquivo a ser analisado, mantendo os mesmos parâmetros para regiões ricas em GC e pobres em GC. A nova exibição gráfica para a sequência aleatorizada número um ilustra que essa sequência aleatória possui apenas uma região pobre em GC e 31 regiões ricas em GC. Outra sequência aleatorizada pode apresentar alguma flutuação no número de regiões ricas e pobres em conteúdo, mas a tendência deve ser a mesma.Sequências aleatórias para o gene PKD possuem várias vezes menos regiões ricas em GC. Regiões pobres em GC são mais de 10 vezes mais abundantes do que as ricas em GC. A próxima demonstração utiliza outro tipo de conteúdo de RNM.No mesmo pacote, os íntrons de um gene humano contêm várias regiões ricas em purinas associadas às estruturas de DNAex. Na página da web do analisador de MRI, altere o conteúdo de DNA para nucleotídeos de ag, que representam purinas. Mantenha o tamanho da janela igual a 50 bases e modifique o limite superior para 80% e o limite inferior para 10%. Em seguida, pressione o botão analisar arquivo para invocar o programa.O gráfico exibido mostra que este gene possui seis regiões ricas em AG, indicadas por picos verticais azuis, e 14 regiões pobres em AG, indicadas por picos vermelhos. Em seguida, compare esses resultados obtidos para o gene PKD1 com os dados das sequências randomizadas que possuem a mesma composição de oligonucleotídeos do gene em estudo: primeiro mude para a sequência randomizada, por exemplo a número dois, e mantenha os mesmos parâmetros do teste anterior. O gráfico para essa sequência aleatória mostra que ela contém apenas uma região rica em AG e nenhuma região pobre em AG.Todos os dados gerados durante a sessão são salvos em arquivos especiais que podem ser acessados por meio da guia "arquivos para download" no canto superior direito de cada página da web. Após abrir este link, baixe a sequência de entrada, bem como todas as sequências randomizadas geradas. Abaixo dessa lista de arquivos, há um link para a tabela de frequência de oligonucleotídeos gerada pelo programa analisador SRI.Em seguida, há links para todos os resultados gerados pelo programa analisador de MRI durante a sessão. Por exemplo, clique no arquivo usuário um arquivo RAND um quatro AGCO 50 32 14, que representa os resultados obtidos para a sequência randomizada. Número um com os seguintes parâmetros, conteúdo de AG 50, janela de comprimento em nucleotídeos, limite superior, 32 nucleotídeos e limite inferior 14 nucleotídeos.Neste arquivo, todos os segmentos de sequência de nucleotídeos que correspondem aos critérios de conteúdo rico ou pobre, bem como suas coordenadas, estão disponíveis como uma lista de acordo com suas posições consecutivas ao longo da sequência de entrada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como navegar pelo MRI genômico, recurso computacional.

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PCR de fusão de alta resolução para determinar variações de sequência em sequências de DNA mutante

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Ao contrário dos dados de sequência de DNA, epigenomic dados não são prontamente submetidos a pesquisas baseadas em texto. Aqui apresentados são os procedimentos para usar uma versão atualizada do GeNemo, uma ferramenta de Bioinformática baseado na web, para realizar pesquisas baseada em padrões para semelhanças em epigenomic dados comparando bancos de dados disponíveis on-line incluindo livre de elementos de DNA com dados do usuário.

Pesquisa baseada em padrões de dados Epigenomic usando GeNemo

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Alvo da próxima geração sequenciamento é uma abordagem de tempo e custo-eficiente que está se tornando cada vez mais popular na pesquisa da doença e diagnóstico clínico. O protocolo descrito aqui apresenta o fluxo de trabalho complexo necessário para sequenciamento e bioinformática processo usado para identificar variantes genéticas que contribuem para a doença.

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

O propósito do presente protocolo é usar uma combinação de computacional e pesquisa do banco para encontrar romance sequências que não podem ser separadas facilmente uma sequência co purificante, que pode ser apenas parcialmente conhecida.

Sequência de romance descoberta pela genômica subtrativa

Long-leitura sequências facilitam grandemente a montagem de genomas complexas e caracterização da variação estrutural. Nós descrevemos um método para gerar as sequências ultra-longa pelas plataformas de sequenciamento baseado em nanopore. A abordagem adota uma extração de DNA otimizada seguida de preparações de biblioteca modificada para gerar centenas de mil leituras com cobertura moderada de células humanas.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Aqui, apresentamos um protocolo para acessar e analisar muitas bases de dados de organismos humanos e modelo de forma eficiente. Este protocolo demonstra o uso de MARRVEL para analisar variantes causadoras de doenças candidatas identificadas a partir de esforços de sequenciamento de próxima geração.

Navegando no MARRVEL, uma ferramenta Web que integra informações da genômica humana e genética de organismos modelo

Explore a análise de sequências genômicas usando ferramentas computacionais para detectar composições não aleatórias de nucleotídeos. Este recurso identifica regiões enriquecidas em genomas de diversos organismos.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

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