Name: Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Aprenda a dissecar e imunocolorir larvas de Drosophila melanogaster para visualizar proteínas da zona ativa na junção neuromuscular. Este protocolo permite estudar a morfologia sináptica e disfunções neurológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Dr. Nael Alami e Dr. Chul Kim Nam por seus comentários sobre este manuscrito.

1. Preparação para Imunofluorescência: <ol><li> Para criar uma superfície de dissecação, despeje Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone em uma pequena placa de cultura de tecidos. Certifique-se de não encher o prato completamente para que a área de dissecção é menor do que o aro. </li><li> Guarnição pinos de dissecação para um comprimento de cerca de 3,5 mm para maior facilidade de manipulação, e certifique-se de ter pelo menos 6 pinos por larva. </li><li> Você vai precisar de uma pinça sem corte que permitirá que você alcance os pinos para a dissecção. </li></ol> 2. Dissecção das larvas: <ol><li> Selecione vagando larvas de terceiro estádio que estão rastejando ao redor dos lados do frasco e não começaram a pupate. </li><li> Coloque uma larva na superfície dissecção sob microscópio estereoscópico. Pavio fora úmido em excesso com um Kimwipe. </li><li> Organizar cada larva de modo que o lado dorsal é voltada para cima. Você será capaz de ver dois traquéia, linhas brancas ao longo do lado dorsal das larvas. Tente centro desses no meio, tanto quanto possível, porque esta marca a linha média dorsal. </li><li> Pin lugar # 1 logo acima da boca ganchos (Figura 1). </li><li> Coloque o pino # 2 na cauda um pouco acima dos espiráculos entre as traquéias. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de PBS para as larvas para evitar a secagem da cutícula. </li><li> Repita os passos acima, com todas as larvas, certificando-se que os genótipos são separados espacialmente, colocando um pino entre cada genótipo. </li><li> Faça um pequeno corte transversal direito acima pin # 2 em ambas as traquéias (Figura 1). </li><li> Insira o seu tesoura no primeiro corte e corte ao longo da linha média dorsal entre as traquéias todo o caminho até o pino passado # 1. </li><li> Você terá de fazer outros cortes pequenos na parte inferior e superior de cada lado da cutícula, de modo que os lados esquerdo e direito irá abrir o que lhe permite fixá-los para baixo, sem puxar a cutícula. </li><li> Coloque o pino # 's 3, 4, 5 e 6 em cada canto. </li><li> Fixar a amostra com PFA 4% para 20-25 minutos em temperatura ambiente </li><li> Decantar a PFA e enxaguar com PBS 3-4 vezes, decantação de cada vez. </li></ol> 3. Remoção de tecido: <ol><li> Comece por retirar tecidos na extremidade posterior, porque normalmente você deseja proteger a área onde o cérebro está localizado. </li><li> Enquanto estiver usando uma steromicroscope e com as larvas em uma gota de PBS, primeiro pegue a extremidade posterior de um dos traquéia e puxe-o que pode remover alguns dos de gordura corporal com ele. Repita o procedimento para a traquéia segundo. </li><li> Pegar alguns do corpo posterior gordura ou intestino e retirá-los da prep. Uma vez que a maior parte do tecido posterior tenha sido removido, o foco na remoção dos tecidos pequenos ao redor do cérebro. Se você está interessado somente nos músculos, ou morfologia do MNJ você pode remover o cérebro também. </li><li> Remoção do cérebro permite uma melhor visualização do músculo 31, que é um marcador útil para orientação segmento abdominal. </li></ol> 4. Imunofluorescência para Zonas de atividade: <ol><li> Adicionar agente de bloqueio (5% soro de cabra normal em PBS) para o preps dissecados no prato dissecção. Bloco para uma hora em temperatura ambiente. Se você gostaria de fazer apenas uma solução para o bloqueio e anticorpos diluições, incluem 0,1% tritonX-100 ao seu agente de bloqueio para permeabilização do tecido. </li><li> Aplicar o anticorpo primário diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100. O anticorpo zona ativa é atingível através do desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Use um anticorpo de referência (por exemplo, horseradish peroxidase-Cy3 conjugado) para rotular a membrana MNJ e axônios. </li><li> Incubar os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. De modo que a secura do frigorífico não irá evaporar a solução de anticorpos, criar uma câmara de umidade, colocando um pouco de água no fundo de uma caixa utilizada pipeta ponta. Cobrir a tampa translúcida com folha de alumínio para reduzir fluorescentes de branqueamento. Coloque o slide dissecção na câmara de umidade e colocar a caixa inteira no 4 ° C incubadora durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, lave com PBST (PBS com 0,2% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada. </li><li> Incube com o anticorpo secundário (por exemplo, Invitrogen Goat Alexa anti-Mouse-488) diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100 à temperatura ambiente por 2-4 horas na câmara de umidade coberto. Incluem uma mancha nuclear (por exemplo, DAPI) no secundário, se você gostaria de identificar a localização do núcleo nos músculos ou cérebro. </li><li> Lavar com PBST (PBS com 0,02% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada. </li></ol> 5. Amostras de montar o Larval em Slides: <ol><li> Decantar e pavio fora a lavagem PBST passado. </li><li> Pipetar 1mL de glicerol cerca de 80% para cobrir as peles preso larval. </li><li> Remove 5 dos 6 pinos em todas as larvas. </li><li> Quando você está pronto para colocar o genótipo primeiro em um slide remova o pino durar todas as larvas desse genótipope. </li><li> Prepare um "lavar" slide colocando duas gotas de seu meio de montagem sobre uma lâmina limpa. Este passo é importante lavar a solução de água fora das larvas para a montagem e clara imagem. </li><li> Agarre uma larva pela cauda com o fórceps sem corte, arraste a larva em torno do glicerol e, em seguida, ao longo das bordas seca do seu prato dissecção, para remover a maioria dos glicerol. Coloque as larvas na gota primeiro meio de montagem. </li><li> Repita a etapa 6 para todas as larvas do mesmo genótipo. </li><li> Uma vez que todas as larvas estão em queda primeiro meio de fixação, agarre a primeira larva pelo rabo e puxá-lo através da gota e, em seguida, ao longo das bordas do prato seco para remover a maioria do meio. Em seguida, coloque as larvas na gota segundo meio de montagem. </li><li> Repita o passo 8 para todas as larvas com o mesmo genótipo. </li><li> Prepare o seu slide final, rotulando-o e colocando uma pequena forma de "T" de meio de montagem no slide. </li><li> Como no passo 5.8, agarrar a larva pela cauda; puxar a pele através da gota média segundo a montagem e, em seguida, ao longo dos lados da seca "Wash" slide. Depois que a maioria do meio veio fora, coloque o pelt larval no slide final no meio de montagem. </li><li> Repita o procedimento para todas as peles larval. </li><li> Certifique-se de que todas as peles larval são organizados como desejado certificando-se que o lado cutícula é baixo e os músculos expostos é voltada para cima. </li><li> Coloque uma lamínula sobre o slide para cobrir as larvas dissecadas, com a borda de partida na linha superior do "T" </li><li> Coloque um pequeno peso (por exemplo, bateria de 9 volts) na lamínula, certificando-se que o meio de montagem espalha completamente sob a lamínula. </li><li> Para reduzir quenching fluorescentes possível, coloque o slide em uma gaveta ou um espaço escuro até o meio de montagem curou. </li><li> Limpar o meio de montagem que transbordam das bordas da lamínula. Limpe meio secos excesso de montagem na lamínula ou slide com etanol 70%. </li><li> Para criar um selo final, selar com unha polonês. </li></ol> 6. Resultados representativos: Um slide de exemplo de larvas dissecadas e imunocoradas é mostrado na Figura 2. Quando a dissecção larvas, manchas, e de montagem são feitos corretamente, o usuário pode identificar o músculo larvas de interesse (Figura 3) em segmentos A2 A6. Hoang et al. Fornece uma descrição detalhada da posição muscular, bem como caracterização de específicas boutons sináptica (Hoang e Chiba, 2001). Usando um objetivo de alta potência que o usuário possa se concentrar em uma única sinapse e tomar z-stack da imagem. Um representante da imagem de projeção máxima de uma porção de sinapse 07/06 é mostrada (Figura 4). Em seguida, usando software de imagem, as zonas de ativos podem ser quantitativamente avaliados por características que são específicas para o seu fenótipo mutante. Exemplos de recursos que poderá ser alterada em um fenótipo específico mutante incluir o número total, intensidade Fluorescência e espaçamento entre zonas ativo. Armadilhas em potencial: Avaliação de imunofluorescência da junção neuromuscular larval é um sistema valioso que pode fornecer informações valiosas sobre a biologia sináptica, embora haja perigos potenciais que podem limitar a utilidade deste sistema. Por exemplo, freqüentemente é desejável para a imagem do padrão de coloração de dois ou mais anticorpos primários na mesma amostra. A escolha dos anticorpos primários adequados, fluoróforos apropriado e adequado controles negativos é essencial para o sucesso. Se dois antígenos de imagem na sua experiência, a certeza de que os anticorpos primários são de espécies diferentes de modo que cada proteína de interesse pode ser identificado exclusivamente com um anticorpo fluorescente etiquetado secundário. A forma recomendada para reduzir a fundo é a utilização de um agente de bloqueio contendo o soro normal da espécie de que os anticorpos secundários foram derivados (por exemplo, usar soro normal de cabra como um agente de bloqueio quando se utiliza de cabra anti-coelho ou rato anticorpos anti-secundário). Após o planejamento dos anticorpos primário e secundário que você irá usar em sua experiência, você também deve considerar a inclusão de controles na sua coloração sets para garantir que o sinal fluorescente que você está vendo é real e não apenas de fundo. Se possível, inclua amostras de controlo negativas que não contêm a proteína de interesse. Isso é facilmente feito em estudos de superexpressão transgene exógenos, incluindo um animal do tipo selvagem, mas em alguns casos pode ser feito usando um mutante homozigoto de sua proteína de interesse. Outro controle essencial negativo, útil para medir os níveis de fundo de seu sinal fluorescente, é a utilização do anticorpo secundário sem incluir o primário. Quando o seu preps imagem resultante, é importante entender que todos os sinais fluorescentes que você está vendo pode não ser real, e pode ser de fundo de your anticorpos secundários ou de fundo de tecido endógeno. Você pode precisar para normalizar suas imagens a considerar fluorescência de fundo quando se examina as mudanças entre a intensidade de fluorescência. Escolha de fluoróforo também deve ser feita com cuidado. Consideração da excitação e espectros de emissão para cada fluoróforo ea capacidade de detectar exclusivamente cada sinal é essencial para evitar sangrar canal através do. Se há alguma incerteza, uma maneira simples de determinar se a extensão da hemorragia é através immunostain com um anticorpo marcado com fluoróforo de cada vez e verifique a imagem com cada canal que você irá utilizar em sua experiência final. Isso deve revelar se sangrar através está ocorrendo com seu conjunto de microscópio filtro. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma de cortar cutícula e colocação de pinos 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Clique aqui para ver uma imagem maior</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Colocação de larvas no slide final. Certifique-se que o preps larvas são expostas lado do músculo para cima e para baixo do lado cutícula. Deixe pelo menos uma largura do corpo larval entre cada amostra. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Quando imagem, localize os músculos e segmentos de interesse. Comum junções neuromusculares caracterizadas músculos inervam 07/06, músculo 13, 12 músculos, ou músculo 4. No lado oposto da linha média ventral, há um espelho estrutura muscular imagem do mostrado hemi-segmento. Use Muscle 31 como um marcador para identificar qual o segmento que você está imaginando. A imagem da mesma sinapses e segmentos para o resto de suas amostras, coletando muitas imagens sináptica por genótipo que pode ser usado para a quantificação. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A imagem de projeção representante máximo de uma porção do músculo MNJ inervam 07/06 é mostrado. NC82 coloração (Bruchpilot) é mostrada em verde. HRP pré-sináptica da mancha é mostrado em vermelho. Observe o punctae zona ativa que pode ser ainda quantificada pelo software de imagem.

<ol><li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li>
<li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li>
<li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li>
<li>Keshishian, H., Kim, Y. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+development+and+function%3A+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li>
<li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly%2C+Ca2%2B+Channel+Clustering%2C+and+Vesicle+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li>
<li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+neuromuscular+junction%3A+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+ALS%3A+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li>
<li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+Protein+with+Homology+to+ELKS%2FCAST%2C+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li>
<li>Zweier, C., Jong, E. K. de, Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para os neurônios, a área terminal sináptico é de fundamental importância, e é a ponte para a comunicação adequada entre o pós e pré-sináptica células. Uma forma poderosa para investigar a saúde do neurônio em modelos de doença é analisar proteínas do terminal sináptico por imunofluorescência. O método de imunofluorescência apresentado aqui permite que o pesquisador examine muitas larvas simultaneamente, limitar as diferenças ambientais entre os grupos. O sistema nervoso central de Drosophila larvas do terceiro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Após a mistura permitir bolhas a subir lentamente para fora, colocando em rotator lenta ou permita a sentar-se por 30 minutos ou mais. </td></tr><tr><td> Aço Inoxidável PINs Minutien </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Guarnição para aprox. 3-4mm de comprimento, com tesouras regulares </td></tr><tr><td> Pinça laminectomia (Blunt-Usado para agarrar pinos) </td><td> Multa ferramentas da Ciência </td><td> 11223-20 </td><td> Use como uma pinça para agarrar blunt pinos </td></tr><tr><td> Pinça dissecção </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Tesoura Vannas, 8cm longo </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Rato de anticorpos anti-Brp </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Use diluição 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 Goat Affinipure Peroxidase Anti-rábano </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 123-165-021 </td><td> Use a diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Use aprox. Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissecção e imagem das zonas de ativos no drosophila junção neuromuscular

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

As larvas Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é um excelente modelo para o estudo da estrutura e função sináptica. Drosophila é bem conhecida pela facilidade de poderosas manipulações genéticas e do sistema nervoso das larvas tem-se revelado particularmente útil no estudo não só a função normal, mas também perturbações que acompanham algumas doenças neurológicas (Lloyd e Taylor, 2010). Muitos dos principais moléculas synaptic encontrados em Drosophila também são encontrados em mamíferos e como a maioria das sinapses excitatórias do SNC em mamíferos, o MNJ Drosophila é glutamatérgica e demonstra dependente de atividade de remodelação (Koh et al., 2000). Além disso, os neurônios Drosophila pode ser identificados individualmente, porque os seus padrões de inervação são estereotipados e repetitivos tornando possível estudo identificou terminais sinápticos, como aquelas entre neurônios motores e as fibras do corpo na parede muscular que eles inervam (Keshishian e Kim, 2004). A existência de componentes sinapse evolutivamente conservadas junto com a facilidade de manipulação genética e física tornar o modelo Drosophila ideal para investigar os mecanismos subjacentes função sináptica (Budnik, 1996). As zonas de ativos nos terminais sinápticos são de particular interesse porque estes são os locais de liberação do neurotransmissor. NC82 é um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína Drosophila Bruchpilot (BRP), um membro da família CAST1/ERC que é um componente importante da zona ativa (Wagh et al., 2006). Brp foi mostrado diretamente moldam a zona ativa T-bar e é responsável por efetivamente agrupamento Ca 2 + canais abaixo da densidade de T-bar (Fouquet et al., 2009). Mutantes de Brp reduziram Ca 2 + densidade de canais, a liberação da vesícula deprimido evocada, e plasticidade de curto prazo alterados (Kittel et al., 2006). Alterações às zonas ativas têm sido observadas em modelos de doenças Drosophila. Por exemplo, imunofluorescência usando o anticorpo NC82 mostrou que a densidade zona ativa foi diminuída em modelos de esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Assim, a avaliação das zonas de ativo, ou de outras proteínas sinápticas, em modelos de larvas de Drosophila da doença pode fornecer uma pista valiosa inicial para a presença de um defeito sináptico. Preparar toda montagem dissecados larvas Drosophila para análise de imunofluorescência do MNJ requer alguma habilidade, mas pode ser realizado pela maioria dos cientistas com um pouco de prática. Apresentada é um método que fornece para as larvas múltiplos a ser dissecados e imunocoradas no prato dissecção mesmo, limitando as diferenças ambientais entre cada genótipo e fornecer animais suficiente para a confiança na reprodutibilidade e análise estatística.

A junção neuromuscular (MNJ) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; É um sistema modelo importante para o estudo da função sináptica normal, assim como perturbações de função sináptica encontrada em certas doenças neurológicas. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção da<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval sistema motor e imunomarcação de proteínas zona ativa dentro do MNJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

A junção neuromuscular (JNM) das larvas de Drosophila é um modelo excelente para o estudo da estrutura e função sináptica. A Drosophila é bem conhecida por...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma coloração por imunofluorescência para proteínas da zona ativa em larvas de terceiro instar de drosófila. Isso é realizado primeiramente selecionando e fixando as larvas sobre o prato de dissecação. O segundo passo do procedimento consiste em dissecar as larvas, removendo tecido em excesso para expor os músculos e as junções neuromusculares.O terceiro passo do procedimento é imunomarcar diretamente as peles de larvas dissecadas na placa de dissecação. O passo final do procedimento é montar as peles de larvas em uma lâmina de microscópio. Em última análise, os resultados podem ser obtidos quanto à morfologia da zona ativa da junção neuromuscular de CHO por meio de microscopia de imunofluorescência.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurologia, como a regulação de proteínas da junção neuromuscular envolvidas na morfologia da zona ativa. Para criar uma superfície de dissecação, despeje a base de elastômero de silicone Sylgard 180 em uma placa de cultura de tecidos pequena. Certifique-se de não encher completamente a placa, para que a área de dissecação fique abaixo da borda. Corte os alfinetes de dissecação para um comprimento de aproximadamente três a cinco milímetros para facilitar a manipulação, e certifique-se de ter pelo menos seis alfinetes por larva, provenientes de cepas selvagens e mutantes. Identifique e selecione larvas de terceiro estágio vagantes que estejam se movimentando ativamente pela parede do frasco e que ainda não tenham iniciado a pupação.Retire duas larvas de cada genótipo dos frascos e coloque-as em uma cuba contendo PBS para remover detritos sob um microscópio estereoscópico. Remova o excesso de umidade na superfície de dissecação usando um lenço de papel absorvente. Posicione as larvas com o lado dorsal voltado para cima, de modo que as duas traqueias brancas fiquem visíveis ao longo da região dorsal central das larvas.As traqueias no meio das larvas, marcando o local da linha média dorsal. Fixe o alfinete número um logo acima dos ganchos bucais e, em seguida, posicione o alfinete número dois na região da cauda, logo acima das espiráculos e entre as traqueias. Adicione uma pequena quantidade de PBS às larvas para evitar a dessecação da cutícula.Certifique-se de manter genótipos diferentes separados, colocando um alfinete entre cada grupo. Uma vez que as larvas tenham sido fixadas, faça um corte transversal através das traqueias logo acima do alfinete número dois. Insira a tesoura nesse corte e corte ao longo da linha média dorsal entre as traqueias, subindo até além do alfinete número um, se necessário.Realize mais quatro cortes pequenos na parte superior e inferior de cada lado da cutícula para que os lados esquerdo e direito se abram, permitindo que você os fixe sem puxar a cutícula. Uma vez que cada canto da cutícula esteja fixado firmemente sobre a placa de dissecação, fixe as larvas em filete com paraformaldeído 4% por 20 a 25 minutos à temperatura ambiente. Após cerca de 25 minutos de tempo de fixação, despreze o paraformaldeído e lave com PBS três vezes, descartando cada lavagem com as larvas em uma gota de PBS sob o microscópio estereoscópico; segure a extremidade posterior de uma das traqueias com pinça de dissecação e puxe-a para fora.Repita para a segunda traqueia. Agarre um pouco do corpo adiposo posterior ou tecido intestinal e puxe-o para fora da área de dissecação. Uma vez que a maior parte do tecido posterior tenha sido removida, concentre-se em remover os tecidos pequenos ao redor do cérebro.Uma vez que a pele larval esteja livre de tecido em excesso, ela pode ser corada diretamente sobre a placa de dissecação utilizando um anticorpo primário para reconhecer a zona ativa, seguido por um anticorpo secundário fluorescente. Após a coloração por imunofluorescência da zona ativa, o próximo passo é montar as peles larvais imunomarcadas. Comece por decantar e remover com papel absorvente a última lavagem após a incubação com o anticorpo secundário e pipete aproximadamente um mililitro de glicerol a 80%. Para cobrir as peles larvais fixadas, remova todas as pinças exceto uma de cada larva e, em seguida, coloque duas gotas do meio de montagem sobre uma lâmina de microscópio.Remova o último alfinete e segure as larvas pela cauda com pin&ccedil;as rombas. Arraste as larvas no glicerol e, em seguida, coloque-as na primeira gota de meio de montagem, repetindo o procedimento com as larvas restantes do mesmo gen&oacute;tipo. Quando todas as larvas estiverem na primeira gota de meio de montagem, pegue-as uma por uma, arrastando-as pela gota e depois pelas bordas secas da l&acirc;mina para remover a maior parte do meio.Em seguida, coloque as larvas na segunda gota de meio de montagem. Prepare a lâmina final rotulando-a e colocando uma pequena forma em T de meio de montagem sobre a lâmina. Repita o procedimento de arraste e secagem com as larvas na segunda gota de meio de montagem e, então, organize as larvas com o lado do tegumento voltado para baixo no meio de montagem.No lâmina final, coloque uma lamínula sobre a lâmina para cobrir as larvas dissecadas com a borda inicial. Na linha superior do suporte, coloque um pequeno peso sobre a lamínula por cerca de cinco minutos para garantir que o meio de montagem se espalhe completamente, e depois deixe repousar no escuro até que o meio de montagem tenha curado. Para preparar a lâmina para microscopia, remova qualquer resíduo de meio de montagem e selar a lamínula com esmalte de unha. A orientação adequada das peles larvais montadas é mostrada aqui.Observe que as cerdas estão planas, com o lado da cutícula voltado para baixo, e que há pelo menos uma distância equivalente à largura do corpo larval entre as cerdas. Após as dissecações larvais, coloração e montagem serem concluídas, a microscopia pode ser utilizada para identificar o músculo larval de interesse localizado nos segmentos de a dois a a seis.Usando uma objetiva de alta potência, é possível focar uma única sinapse e obter uma imagem em pilha ZS com um microscópio. Aqui é mostrada uma imagem representativa de projeção máxima de uma porção da sinapse, com marcação do NC 82 em verde e marcação pré-sináptica de HRP em vermelho. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imunomarcação para proteínas importantes da junção neuromuscular, como aquelas envolvidas na morfologia da zona ativa.

dissection-imaging-active-zones-drosophila-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Drosophila larval Dissection MNJ

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

A junção neuromuscular (JNM) é alterada em uma variedade de condições que às vezes podem culminar em insuficiência sináptica. Este relatório descreve métodos baseados em microscópio de fluorescência para quantificar essas mudanças estruturais.

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.

Dissecção de fibras musculares esqueléticas únicas para análises imunofluorescentes e morfométricas de junções neuromusculares de monte inteiro

Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Este protocolo descreve um método para análise morfométrica de junções neuromusculares por microscopia confocal combinada e STED que é usado para quantificar alterações patológicas em modelos de camundongos de SMA e CMS relacionada ao ColQ.

Caracterização de Junções Neuromusculares em Camundongos por Microscopia Confocal Combinada e Super-Resolução

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda a dissecar e imunocolorir larvas de Drosophila melanogaster para visualizar proteínas da zona ativa na junção neuromuscular. Este protocolo permite estudar a morfologia sináptica e disfunções neurológicas.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Explorar mais vídeos