Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

O objetivo geral deste procedimento é isolar embriões de camundongo E 8.5 para uso em ensaios de cromatina, imunoprecipitação ou chip. Isso é realizado primeiramente isolando os embriões de camundongo e preparando suspensões de células individuais. O segundo passo do procedimento é realizar a reticulação química das proteínas ligadas ao DNA com o DNA genômico, seguida por sonicação para fragmentar o DNA.

O terceiro passo do procedimento é imunoprecipitar os complexos de proteína e cromatina e isolar o DNA purificado. O passo final do procedimento é analisar o DNA imunoprecipitado purificado por PCR convencional ou por PCR quantitativo em tempo real. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram interações proteicas com sequências reguladoras de genes específicos da diferenciação durante a iniciação do programa de diferenciação em tecidos e órgãos em desenvolvimento.

Este semestre pode ajudar a responder boas perguntas sobre o início do programa de diferenciação durante a embriogênese, por meio da identificação de fatores regulatórios que interagem com as sequências regulatórias de genes específicos de diferenciação à medida que se tornam transcripcionalmente competentes. Para iniciar este procedimento, os cornos uterinos são removidos de um camundongo sacrificado no dia embrionário 8,5. De acordo com um protocolo aprovado, o tecido é colocado em uma placa de Petri contendo meio de corte fresco usando uma tesoura.

Corte cada local de implantação individualmente e coloque-os em uma placa de Petri contendo meio de dissecação fresco para evitar excesso de sangue. Com o auxílio de uma pinça, remova a camada uterina de cada local de implantação para expor o embrião e isolar os embriões individuais usando pinça. Nesta fase do desenvolvimento, os embriões estão rodeados pelo saco vitelino parietal, que entra em contato com o tecido decidular, o saco vitelino visceral e o âmnio.

O âmnio é uma membrana transparente que está em contato direto com o embrião. O saco vitelino visceral está localizado entre o âmnio e o saco vitelino parietal e é facilmente distinguido nos embriões de 8,5 a 9,5 dias pela presença de vasos sanguíneos proeminentes que nutrem o embrião. Remova cada embrião de suas membranas circundantes e transfira individualmente para uma nova placa contendo meio de dissecação para remover o excesso de sangue.

Em seguida, transfira cada embrião para um tubo einor de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de meio de dissecação. A homogeneização do embrião isolado inicia-se com a adição de 200 microlitros de colagenase. Adicione a solução tipo dois a cada tubo einor contendo os embriões.

Agite suavemente as amostras em um agitador a 37 graus Celsius a 100 RPM por 20 minutos. Em seguida, ressuspenda as amostras batendo levemente para dispersar aglomerados de células. Aplique a suspensão celular na parte superior de um filtro celular estéril com malha de 40 micrômetros colocado sobre um tubo eppendorf de 1,5 mililitro.

Aplique imediatamente 600 microlitros de D-P-B-S 1X à temperatura ambiente sobre a parte superior do filtro celular para completar a separação. Após a filtração da suspensão, descarte o filtro celular e centrifugue as amostras a 4.000 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes reus.

Suspenda cada pellet em um mililitro de DPBS 1X à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue as amostras a 4.000 × g durante um minuto à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante pela segunda vez, ressuspenda cada pellet em 200 microlitros de meio de dissecação à temperatura ambiente. Reticule a cromatina adicionando 5,6 microlitros de formaldeído a 37% às amostras de 200 microlitros, obtendo uma concentração final de 1% de formaldeído.

Incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugue as amostras a 4.000 G por três minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células com D-P-B-S a uma X frio contendo 80 microlitros por mililitro de coquetel de inibidores de protease ou PIC. Em seguida, centrifugue as amostras a 4.000 G por três minutos a quatro graus Celsius.

Após descartar o sobrenadante, as amostras podem ser congeladas a menos 80 graus Celsius e permanecem estáveis por vários meses antes da sonicação. Deixe o pellet celular congelado descongelar no gelo ou coloque o pellet do passo anterior no gelo. Re-suspenda o pellet celular em 100 microlitros de tampão de lise SDS à temperatura ambiente após a re-suspensão. Adicione mais 100 microlitros de tampão de lise SDS à temperatura ambiente e re-suspenda a amostra por pipetagem e inversão.

Incube a suspensão celular no gelo por 10 minutos. Após a incubação, prepare o ator para fragmentar o DNA com ligação cruzada em fragmentos de 200 a 500 pares de bases. Nesta demonstração, utiliza-se um DIO geno bio rupture UCD 200.

Sonicar a amostra cercada por uma mistura de gelo. Não permita que a temperatura suba acima de quatro graus Celsius nem que congele na centrífuga. Centrifugar a amostra sonicada a 14.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o sobrenadante para um tubo eend DPH novo pré-resfriado em gelo. Divida a amostra sonicada em no máximo cinco alíquotas. Armazene uma alíquota a menos 20 graus Celsius para reservar sua entrada para a reversão da ligação cruzada.

Dilua em etapas os outros alíquotos em dez vezes no tampão de diluição do chip contendo PIC recém-adicionado na proporção de um microlitro por 800 microlitros de tampão. Primeiro, determine quais velocidades de centrifugação serão utilizadas para o pré-limpeza com base no anticorpo a ser usado para a proteína do ensaio no chip. As microesferas A são usadas aqui porque o anticorpo a ser usado para o chip é de origem raba.

Pré-limpe o sobrenadante diluído adicionando 75 microlitros de uma solução a 50% de esperma de salmão, DNA e proteína. Incube em agitação a quatro graus Celsius durante uma hora; após a incubação, centrifugue as amostras a 2.500 ×g por um minuto a quatro graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para um novo tubo DPH pré-resfriado.

Adicione quatro microgramas de anticorpo por amostra ao Eloqua pré-limpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius com rotação. Comece adicionando 60 microlitros da suspensão de espermatozoide de salmão, DNA proteico, uma suspensão de microesferas a cada amostra e incube a quatro graus Celsius com rotação por uma hora. Centrifugue as amostras a 1000 G por um minuto a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente os sobrenadantes e descarte-os, mantendo o complexo de DNA, proteína e microesferas no gelo. Ressuspenda e lave os pellets conforme descrito no protocolo escrito, utilizando os tampões um a quatro.

Cada lavagem consiste em um período de incubação de cinco minutos com rotação, seguido por centrifugação a 1000 G durante um minuto e remoção do sobrenadante após a lavagem. Elua o complexo anticorpo de cromatina ressuspendendo vigorosamente o complexo de perlas de proteína de cromatina lavado em 250 microlitros de tampão de eluição recém-preparado. Vortex cada amostra por cinco segundos e, em seguida, incube as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos com rotação, após centrifugação a 2.500 G durante um minuto. À temperatura ambiente, transfira cada eluato para um novo tubo eppendorf.

Repita o processo de eluição e combine o eluato de cada amostra no mesmo tubo eppendorf. Para reverter as ligações cruzadas, adicione 20 microlitros de cloreto de sódio 5 M a cada eluato de 500 microlitros. Para o controle de entrada previamente reservado, adicione 40 microlitros de cloreto de sódio 5 M por mililitro.

Aqueça os EITs em banho-maria a 65 graus Celsius por quatro horas. Para a análise noturna, aplique 10 microlitros de cada amostra no controle de entrada em um gel de agarose 2% ao lado de um marcador de tamanho que varie de 0,1 a um par de quilobases para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA. O DNA aparecerá como uma mancha difusa e não como uma banda nítida.

Recupere o DNA de cada amostra de 500 microlitros utilizando um kit de extração em gel rápido kaya. Comece adicionando 600 microlitros de tampão qg para otimizar a absorção do DNA pela membrana de sílica em uma coluna de centrifugação rápida kaya e, em seguida, adicione 200 microlitros de isopropanol antes de carregar a coluna. Verifique a mistura para determinar se há presença de precipitado de SDS.

Se ocorreu precipitação de SDS, as amostras devem ser aquecidas em banho-maria a 42 graus Celsius até que o precipitado desapareça. Em seguida, aplique as amostras nas colunas e elua o DNA conforme instruções do fabricante. O SDS pode interferir na atividade da polimerase PCRT e, portanto, deve ser completamente removido antes de realizar a PCR.

Incube cada amostra de DNA no gelo para precipitar qualquer resíduo de SDS e centrifugue a 14.000 G por um minuto a quatro graus Celsius. Transfira o SANE para novos tubos einor. Os EITs de DNA podem ser detectados por PCR convencional ou por PCR quantitativa em tempo real ou QPCR com primers específicos. Para cada sequência a ser analisada, utilize cinco a 10 microlitros do DNA total IIT para uma reação de PCR ou QPCR. As condições de PCR e QPCR variarão.

No entanto, a quantidade limitada de material inicial exige ciclos adicionais de PCR para a detecção por PCR convencional; inicie com 40 ciclos e ajuste conforme necessário. Utilizando este protocolo, experimentos de ChIP foram realizados com embriões de E 8,5 e E 9,5. Os DNAs purificados por ChIP foram analisados por PCR convencional e por PCR quantitativo em tempo real.

Os resultados demonstram que o fator miogênico e regulatório está presente no promotor miogênico em embriões de E 8,5 e E 9,5. Em contraste, não houve indicação de ligação miogênica ao promotor miogênico no saco vitelino, onde o miogênico não é expresso. O promotor do interferon gama, que contém sequências correspondentes ao sítio de ligação miogênico, foi utilizado como controle negativo de sequência, conforme esperado; o miogênico não se ligou ao promotor do interferon gama em nenhuma das amostras de tecido testadas.

Os resultados indicam que Myogenic está ligado ao promotor Myogenic nos somitos de embriões de E 8,5 e E 9,5, já que myo Genin é expresso especificamente nos somitos nessas fases. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e preparar embriões de camundongo de EA 0,5 para precipitação de cromatina, avaliação que identificará fatores regulatórios associados a genes específicos de tecidos em tecidos em desenvolvimento.