Name: Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda o ensaio de imunoprecipitação da cromatina para estudar genes tecido-específicos em embriões de rato E 8.5. Este método permite analisar interações proteína-DNA durante o desenvolvimento embrionário.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM56244 a ANI, que inclui fundos concedidos através da Lei de Recuperação e Reinvestimento de 2009, e pelo NIH R01 GM87130 para JARP

1. Isolamento de embriões Nota: Todas as operações envolvendo ratos deve ser realizada de acordo com o cuidado de animais e políticas adequadas de uso e protocolos <ol><li> Verificar a presença de um plugue de acasalamento em camundongos fêmeas da manhã depois do acasalamento e as fêmeas separadas dos machos acasalaram parafuso, colocando-os em uma gaiola diferente. Meio-dia do dia que a ficha de acasalamento se observa é considerado o dia embrionárias 0,5 (E0.5) do desenvolvimento. </li><li> Em E8.5, (ou o estágio desejado, se for diferente), o sacrifício do mouse usando um protocolo aprovado. </li><li> Molhar a barriga do animal sacrificado com etanol 70% e abrir a cavidade abdominal. Os locais de implantação, indicando a presença de embriões em desenvolvimento são vistos como uma "contas em um colar" arranjo ao longo do comprimento de cada corno uterino (Figura 1A). Com uma tesoura, retire os dois cornos uterinos, corte cada local de implantação para separar individualmente (Figura 1B) e coloque-os em um prato de 100 milímetros de petri contendo temperatura ambiente (RT), médio dissecção (DMEM, 10% de soro fetal bovino, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 mg / ml de penicilina, estreptomicina 2 mM). </li><li> Utilizando uma pinça, remova cada embrião e as membranas que envolvem desde o tecido uterino (Figura 1C) e colocá-los em meio dissecção fresco. </li><li> Isolar embriões individuais sob um microscópio de dissecação com a pinça. Neste estágio de desenvolvimento, os embriões são rodeados por parietal saco vitelino, que em contato com o tecido deciduum, o saco vitelino visceral eo âmnio. O âmnio é uma membrana transparente que está em contato direto com o embrião. O saco vitelino visceral está localizado entre o âmnio eo saco vitelino parietal e é facilmente distinguido em E8.5-E9.5 embriões pela presença de vasos sanguíneos que nutrem importantes do embrião. Retire cada embrião de sua membranas que envolvem e transferência individualmente em um novo prato contendo media dissecção para remover o excesso de sangue. O estágio de desenvolvimento pode variar de embrião para embrião e entre ninhadas; representante E8.5 embriões e um representante do embrião E9.5 são mostrados na Figura 1D. </li><li> Transferência de cada embrião para um tubo eppendorf 1,5 ml contendo 200 mL de mídia dissecção (descrito na etapa 4 acima). </li></ol> 2. Homogeneização da Embryo isolados <ol><li> Adicionar 20 unidades de colagenase tipo II em um volume de 200 ul (diluído em fosfato 1X Dubbecco de Buffered Saline; DPBS) a cada tubo eppendorf. </li><li> Agite suavemente amostras em um shaker 37 ° C a 100 rpm por 20 min. </li><li> Ressuspender bem pipetando para perturbar aglomerados de células. </li><li> Aplicar a suspensão de células na parte superior do filtro de células estéreis (40 malhagem mm) colocado sobre um tubo eppendorf 1,5 ml. </li><li> Aplicar imediatamente 600 mL de temperatura ambiente 1X DPBS em cima do filtro de celular para completar a separação. Descartar o filtro. </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 5 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de DPBS RT 1X. </li><li> Centrifugar as amostras a 4000 xg por 1 min em temperatura ambiente. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 mL de mídia dissecção RT. </li><li> Contar as células embrionárias. Há um embrião 3-5 x 10 6 cells/E8.5 média. </li></ol> 3. Cross-link Chromatin <ol><li> Adicionar 5,6 mL de formaldeído 37% para as 200 amostras mL para uma concentração final de formaldeído a 1%. </li><li> Incubar as amostras por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 3 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células com frio 1X DPBS contendo 80 mL / cocktail inibidor da protease ml (PIC). </li><li> Centrifugar as amostras a 4 ° C a 4000 xg por 3 min. </li><li> Desprezar o sobrenadante. Nesta etapa, as amostras podem ser congeladas a -80 ° C. Os congelados, amostras reticuladas são estáveis ​​por vários meses. </li></ol> 4. Sonicação <ol><li> Ressuspender o pellet celular em 100 ul de tampão SDS RT lise (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), EDTA 10 mM e SDS 1% com PIC recém adicionado ao volume de 1 ml PIC/800 mL total). Quando ressuspenso, adicionar um adicional de 100 ul de tampão de lise RT SDS para promover a ressuspensão. Misture bem por pipetagem e inversão. </li><li> Incubar a suspensão de células no gelo por 10 min. </li><li> Sonicate células lisadas de DNA de cisalhamento para entre 200 e 500 pares de bases usando um Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 vezes: definição de amplitude de 30 seg on/30 sec fora do poder (320 watts) de altura). As amostras devem ser cercado por uma pasta de gelo. Não permita que as amostras para aquecer acima de 4 ° C ou congelar. Existem muitos tipos de sonicators disponíveis. Sonicação condições devem ser otimizados para cada sonicador resultar em ruptura do DNA cruzada para um comprimento de aproximadamente 500 pb. </li><li> Centrifugar amostras sonicado a 4 ° C a 14000 xg por 10 min. </li><li> TRANSFERÊNCIA o sobrenadante para um tubo eppendorf frescos pré-resfriado em gelo. </li><li> Dividir a amostra sonicado em um máximo de cinco alíquotas. Temos empiricamente determinou que um embrião E8.5 pode ser dividido em cinco alíquotas. Tamanhos de amostra menores ou maiores podem ser dimensionados de acordo. Nesta etapa, a amostra pode ser armazenada a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Reserve uma alíquota para uso como entrada e armazenar a -20 ° C até a etapa 6, quando o cross-links serão revertidas. Diluir as alíquotas outras 10 vezes em tampão de diluição ChIP (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl e SDS 0,01%), contendo PIC recém-added at 1 μl/800 mL de buffer. </li></ol> 5. Pré-compensação e imunoprecipitação <ol><li> Pré-claro sobrenadante diluído em 75 mL de esperma de salmão-DNA / proteína A ou G-Agarose suspensão de 50% a 4 ° C, com rotação, por 1 hora. Uso de qualquer proteína A ou G grânulos de proteína deve ser determinada pelo anticorpo a ser utilizado para o chip. Por exemplo, a proteína A contas são recomendados para anticorpos de coelho, enquanto esferas de proteína G são recomendados para anticorpos IgG de cabra ou um rato anticorpos. Para informações mais detalhadas, veja as recomendações feitas pelo fabricante do grânulo. </li><li> Centrífuga a 4 ° C a 2500 xg por 1 min. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo eppendorf pré-resfriada. </li><li> Adicionar anticorpo (4 mg / amostra) à alíquota de pré-limpo e incubar overnight a 4 ° C com rotação. </li></ol> 6. Lavar o Complexo de proteína-cromatina-bead <ol><li> Adicionar 60 mL de esperma de salmão DNA / proteína A ou G agarose suspensão em cada frasco e incubar a 4 ° C com rotação de 1 hr. Use o mesmo tipo talão utilizado para pré-limpeza no passo 3 acima. </li><li> Centrífuga a 4 ° C a 1000 xg por 1 min. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e descartar. Manter o complexo DNA-proteína-grânulo no gelo. </li><li> Ressuspender e lavar o pellet, conforme indicado abaixo com buffers de lavagem 1, 2, 3 e 4. Lavar buffers 03/01 devem ser refrigerados a 4 ° C e lavagens com esses buffers deve ser realizada a 4 ° C. Tampão de lavagem 4 deve estar em temperatura ambiente e lavagens com esse buffer deve ser realizada à temperatura ambiente. Cada lavagem é de 5 minutos com rotação à temperatura adequada. Após cada lavagem centrífuga, a 4 ° C (temperatura ambiente por 4 lavagens tampão de lavagem) a 1000 xg por 1 min, em seguida, aspirar cuidadosamente ou remover o sobrenadante. </li></ol> Tampão 1: tampão de lavagem Low sal (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl e SDS 0,1%), 1 ml x 2 lavagens. Buffer de 2: tampão de lavagem de alta sal (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl e SDS 0,1%), 1 ml x 2 lavagens. Tampão 3: LiCl tampão de lavagem de sal (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M LiCl e ácido deoxicólico 1% (sal sódico)), 1 x 1 ml de lavagem. Tampão 4: tampão TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 lavagens. 7. Eluição do Complexo Chromatin-anticorpo <ol><li> Ressuspender o complexa proteína-cromatina-bead lavados em 250 L de tampão de eluição recém-preparada (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Vortex vigorosamente a amostra por 5 segundos e, em seguida incubar a RT por 15 min com rotação. </li><li> Centrifugar a 2.500 xg por 1 min em temperatura ambiente e transferir o eluato em um tubo eppendorf novo. </li><li> Repita as etapas 1 e 2 e combinar os eluatos no tubo eppendorf mesmo. Os eluatos deve ser mantido em temperatura ambiente. Após a conclusão desta etapa, os eluatos podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol> 8. Reverso Cross-link e recuperar DNA <ol><li> Adicionar 20 l 5 M NaCl por 500 mL eluato (40 mL / ml para o controle de entrada). </li><li> Aqueça o eluatos a 65 ° C em banho-maria por 4 horas durante a noite. </li><li> 10 ml de cada amostra (incluindo o controle de entrada) podem ser executados em um gel de agarose 2% ao lado de marcadores de tamanho medindo 0,1-1 kbp para verificar o tamanho do fragmento de DNA. O DNA vai aparecer como uma mancha, e não uma banda afiada. O restante das amostras podem ser deixados a 65 ° C, enquanto o gel está sendo executado. </li><li> Recuperar o DNA de cada amostra usando um QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Adicionar 600 mL tampão QG (fornecido no kit) para otimizar o DNA de adsorção com a membrana de sílica em uma coluna QIAquick e 200 mL de isopropanol em uma amostra mL 500. Note-se que tampão QG contém um indicador de pH permitindo a determinação fácil do pH da amostra. Se a cor da amostra passa de amarelo para roxo (pH&gt; 7,5) após a mistura, adicione 10 ml de 3 NaAcetate M (pH 5,2) para a amostra e misturar. Isso reduz o pH da mistura para maximizar o DNA de ligação para as contas na coluna. </li><li> Antes de carregar a coluna, verifique a mistura para determinar se qualquer precipitado SDS está presente. Se SDS precipitação ocorreu, a amostra deve ser aquecida em um42 ° C banho-maria até que o precipitado desaparece. </li><li> Carga 700 mL da mistura na coluna QIAquick (coluna roxo no kit) e centrifugar a 14.000 xg na RT para 1 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de continuar e repetir este passo com o restante da amostra. </li><li> Adicionar 500 mL tampão QG para lavar a coluna. Centrifugar a 14.000 xg na RT por 2 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de prosseguir. </li><li> Lavar a coluna com 700 mL de tampão de lavagem PE (fornecido no kit) para que o etanol foi adicionado conforme as instruções do fabricante. Centrifugar a 14.000 xg na RT para 1 min. Descartar o fluxo através da coluna antes de prosseguir. </li><li> Repita a etapa de centrifugação para remover completamente o restante do tampão PE na coluna. Descartar o fluxo através do tubo e coleção. </li><li> Eluir o DNA da coluna em um tubo eppendorf fresco, adicionando 60 mL tampão EB (tampão de eluição fornecido no kit). </li><li> Centrifugar a temperatura ambiente em 14.000 xg por 1 min. O DNA eluído podem ser armazenadas a -20 ° C até a detecção. A 260 leituras do material recuperado normalmente indicam concentrações de 90-120 ng / ul, para uma recuperação total de ~ 6-7 ug por alíquota. No entanto, a proporção de 260/280 Um desses exemplos é tipicamente&gt; 1,8, sugerindo que a RNA está presente na amostra. Assim, a quantidade exata de DNA recuperado pode ser menor. </li></ol> 9. Análise de DNA recuperado <ol><li> SDS pode interferir com a actividade da PCR Taq polimerase. SDS deve ser completamente removido antes de realizar PCR. Incubar a DNA em gelo para precipitar qualquer SDS residual e centrifugar a 4 ° C em 14.000 xg por 1 min. Transfira o sobrenadante para um novo passo tube.This eppendorf é fortemente recomendado. </li><li> Os eluatos DNA podem ser detectadas quer por PCR convencional ou pela quantitativa PCR em tempo real (Q-PCR) com primers específicos para cada seqüência a ser analisado. ML de eluato 50-10 DNA total pode ser utilizado para um PCR ou Q-PCR reação. PCR com o controle de entrada pode ser realizada com uma diluição de 50-10 vezes do DNA em comparação com a quantidade de outras amostras. PCR e Q-PCR condições podem variar, no entanto, a quantidade limitada de matéria-prima exige ciclos adicionais PCR. Para a detecção de PCR convencional, recomendamos que comece com 40 ciclos e ajustar conforme necessário. </li></ol> 10. Resultados representante Nós temos usado esse protocolo para realizar ChIP de ambos E8.5 E9.5 e embriões (Figura 2). Os resultados demonstram que miogenina está presente no promotor miogenina em E8.5 e E9.5 embriões. DNAs ChIP purificados foram analisados ​​por PCR convencional (Figura 2A) e pelo quantitativo real-time PCR (Figura 2B). Em contraste, não houve indicação de miogenina ligação ao promotor miogenina no saco vitelino, onde miogenina não é expresso. O interferon-γ (IFNγ) promotor, que contém seqüências correspondentes do site miogenina vinculativo, foi usado como um controle de seqüência negativa. Como esperado, miogenina não estava preso ao promotor IFNγ em qualquer uma das amostras de tecido testado. Em E8.5 e 9,5 embriões, miogenina é especificamente expresso na somitos (Figura 3; 6,10), que são as precursoras de músculo esquelético. Assim, os resultados indicam que a miogenina é vinculado ao promotor miogenina na somitos E8.5 e E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. E8.5 dissecção embrião. (A) chifre Isolated uterina (painel superior; maior ampliação mostrado no painel inferior). (B) uterina chifre cortado com tesoura para separar locais de implantação individuais contendo embriões individuais. (C) Embriões projetando-se de tecido uterino durante a dissecção. Setas marcam os embriões ainda cobertos por extra-embrionária do tecido. (D) Dois E8.5 embriões de mesma ninhada. O embrião do lado esquerdo não começou o processo de transformação. O embrião do lado direito está passando por torneamento. Extrema-direita - embrião E9.5 representante. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. ChIP ensaio demonstrando miogenina ligação ao promotor miogenina em E8.5 e E9.5 embriões. (Top) análise de PCR convencional de 5 ul de DNA purificada a partir de experimentos chip usando um anticorpo miogenina ou não-específicas IgG foi realizada com primers que amplificam uma porção do promotor miogenina de -79 a 69 em relação ao local de início da transcrição que contém um sítio de ligação localizado no miogenina -12 ou primers que amplificam uma porção do promotor IFNγ que contém uma seqüência de combinação do site miogenina ligação localizada ~ 1075 pb a montante do local de início da transcrição. As seqüências de primers utilizadas foram IFNγ 5'-GCT GAC TCA GGC AGA CCC CGA-3 'e 5'-GGA TGG TGA GGC AGG AGG CC-3'. (Inferior) quantitativa em tempo real a análise PCR das mesmas amostras usadas em (A). Oos dados são plotados como% de entrada + / - desvio padrão. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Miogenina é especificamente expresso na somitos de E8.5 E9.5 e embriões. Montar toda a hibridização in situ de miogenina mostra a expressão do mRNA específico no somitos. Bar tamanho em E8.5 imagem - 200 mM. Bar tamanho em E9.5 imagem - 500 mm.

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<li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li>
<li>Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li>
<li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li>
<li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li>
<li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+and+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li>
<li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li>
<li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered%2C+cyclical%2C+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Massachusetts Medical School IACUC.

No protocolo ChIP descrito, mostramos que a miogenina regulador miogênico está associada com o promotor miogenina no tecido músculo esquelético precursor presente em E8.5 E9.5 única e embriões. Estudos anteriores extensamente caracterizada miogenina ligação a caixa de E contendo seqüências, começando com a inicial em experimentos in vitro, utilizando gel shift in vitro traduzido ou bactérias produzidas DNA miogenina e radiolabeled codificação a parte relevante de seqüências-alvo gene regulador...

<table><tbody><tr><td>Kit de Ensaio ChIP</td><td>Upstate, Millipore</td><td>17-295</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Diluição com PBS 1 x</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;meio de Eagle modificado (DMEM) </td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>12100-061</td><td>Alto teor de glicose</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s fosfato tamponado salino 1X (DPBS)</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Livre de cloreto de cálcio, livre de cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (SBF)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>QIAquick</td><td>28704</td><td>kit de 50 reações</td></tr><tr><td>Solução estoque de penicilina/estreptomicina</td><td>GIBCO, da Life Technologies</td><td></td><td>5000 &amp;#x03BC;concentração em g/ml</td></tr><tr><td>Coquetel de Inibidores de Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão/agarose Protein A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-miogenina</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-576</td><td></td></tr><tr><td>IgG de coelho normal</td><td>EMD Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Q-PCR master mix</td><td>Promega Corp.</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio para imunoprecipitação da cromatina genes tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Cromatina imunoprecipitação (chip) é uma ferramenta poderosa para identificar proteínas: interações cromatina que ocorrem no contexto de células vivas 1-3. Esta técnica tem sido amplamente explorada em células de cultura de tecidos, e, em menor grau, no tecido primário. A aplicação do chip para o tecido embrionário de roedores, sobretudo em momentos iniciais de desenvolvimento, é complicado pela quantidade limitada de tecido e da heterogeneidade das células e tecidos no embrião. Aqui apresentamos um método para realizar chip usando um dia dissociada embrionárias 8.5 (E8.5) do embrião. Cromatina tosquiada de um embrião E8.5 única pode ser dividido em até cinco alíquotas, que permite que o investigador material suficiente para controles e para a investigação de proteínas específicas: interações cromatina. Temos utilizado esta técnica para começar a documentar proteína: interações cromatina durante a especificação de tecido programas específicos de expressão gênica. A heterogeneidade de tipos de células em um embrião, necessariamente, restringe a aplicação desta técnica porque o resultado é a detecção de proteínas: interações cromatina sem distinguir se as interações ocorrem em todos, um subconjunto de, ou um único tipo de células (s). No entanto, o exame de tecido específico genes durante ou após o aparecimento de tecido-específicos de expressão gênica é viável por dois motivos. Primeiro, imunoprecipitação de fatores tecido específico necessariamente isola cromatina do tipo de célula onde o fator é expresso. Segundo, imunoprecipitação de coativadores e histonas contendo modificações pós-translacionais que estão associados com a ativação do gene só deve ser encontrada em genes e seqüências regulatórias no tipo de células onde o gene está sendo ou foi ativado. A técnica deve ser aplicado ao estudo da maioria dos tecidos específicos eventos de ativação do gene. No exemplo descrito abaixo, utilizamos E8.5 e E9.5 embriões de camundongos para analisar fator determinante em um esqueleto promotor do gene do músculo específico. Somitos, que são os tecidos precursor a partir do qual os músculos esqueléticos do tronco e membros formarão, estão presentes em E8.5-9.5 4,5. Miogenina é um fator de regulação necessários para a diferenciação do músculo esquelético 6-9. Os dados demonstram que miogenina está associado ao seu próprio promotor em E8.5 e E9.5 embriões. Porque miogenina é expresso apenas em somitos nesta fase de desenvolvimento 6,10, os dados indicam que as interações com miogenina seu promotor própria já ocorreu em células do músculo esquelético precursor em E8.5 embriões.

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para identificar interações proteína:cromatina que ocorrem no contexto de células vivas 1-3. Esta ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar embriões de camundongo E 8.5 para uso em ensaios de cromatina, imunoprecipitação ou chip. Isso é realizado primeiramente isolando os embriões de camundongo e preparando suspensões de células individuais. O segundo passo do procedimento é realizar a reticulação química das proteínas ligadas ao DNA com o DNA genômico, seguida por sonicação para fragmentar o DNA.O terceiro passo do procedimento é imunoprecipitar os complexos de proteína e cromatina e isolar o DNA purificado. O passo final do procedimento é analisar o DNA imunoprecipitado purificado por PCR convencional ou por PCR quantitativo em tempo real. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram interações proteicas com sequências reguladoras de genes específicos da diferenciação durante a iniciação do programa de diferenciação em tecidos e órgãos em desenvolvimento.Este semestre pode ajudar a responder boas perguntas sobre o início do programa de diferenciação durante a embriogênese, por meio da identificação de fatores regulatórios que interagem com as sequências regulatórias de genes específicos de diferenciação à medida que se tornam transcripcionalmente competentes. Para iniciar este procedimento, os cornos uterinos são removidos de um camundongo sacrificado no dia embrionário 8,5. De acordo com um protocolo aprovado, o tecido é colocado em uma placa de Petri contendo meio de corte fresco usando uma tesoura.Corte cada local de implantação individualmente e coloque-os em uma placa de Petri contendo meio de dissecação fresco para evitar excesso de sangue. Com o auxílio de uma pinça, remova a camada uterina de cada local de implantação para expor o embrião e isolar os embriões individuais usando pinça. Nesta fase do desenvolvimento, os embriões estão rodeados pelo saco vitelino parietal, que entra em contato com o tecido decidular, o saco vitelino visceral e o âmnio.O âmnio é uma membrana transparente que está em contato direto com o embrião. O saco vitelino visceral está localizado entre o âmnio e o saco vitelino parietal e é facilmente distinguido nos embriões de 8,5 a 9,5 dias pela presença de vasos sanguíneos proeminentes que nutrem o embrião. Remova cada embrião de suas membranas circundantes e transfira individualmente para uma nova placa contendo meio de dissecação para remover o excesso de sangue.Em seguida, transfira cada embrião para um tubo einor de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de meio de dissecação. A homogeneização do embrião isolado inicia-se com a adição de 200 microlitros de colagenase. Adicione a solução tipo dois a cada tubo einor contendo os embriões.Agite suavemente as amostras em um agitador a 37 graus Celsius a 100 RPM por 20 minutos. Em seguida, ressuspenda as amostras batendo levemente para dispersar aglomerados de células. Aplique a suspensão celular na parte superior de um filtro celular estéril com malha de 40 micrômetros colocado sobre um tubo eppendorf de 1,5 mililitro.Aplique imediatamente 600 microlitros de D-P-B-S 1X à temperatura ambiente sobre a parte superior do filtro celular para completar a separação. Após a filtração da suspensão, descarte o filtro celular e centrifugue as amostras a 4.000 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes reus.Suspenda cada pellet em um mililitro de DPBS 1X à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue as amostras a 4.000 × g durante um minuto à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante pela segunda vez, ressuspenda cada pellet em 200 microlitros de meio de dissecação à temperatura ambiente. Reticule a cromatina adicionando 5,6 microlitros de formaldeído a 37% às amostras de 200 microlitros, obtendo uma concentração final de 1% de formaldeído.Incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, centrifugue as amostras a 4.000 G por três minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células com D-P-B-S a uma X frio contendo 80 microlitros por mililitro de coquetel de inibidores de protease ou PIC. Em seguida, centrifugue as amostras a 4.000 G por três minutos a quatro graus Celsius.Após descartar o sobrenadante, as amostras podem ser congeladas a menos 80 graus Celsius e permanecem estáveis por vários meses antes da sonicação. Deixe o pellet celular congelado descongelar no gelo ou coloque o pellet do passo anterior no gelo. Re-suspenda o pellet celular em 100 microlitros de tampão de lise SDS à temperatura ambiente após a re-suspensão. Adicione mais 100 microlitros de tampão de lise SDS à temperatura ambiente e re-suspenda a amostra por pipetagem e inversão.Incube a suspensão celular no gelo por 10 minutos. Após a incubação, prepare o ator para fragmentar o DNA com ligação cruzada em fragmentos de 200 a 500 pares de bases. Nesta demonstração, utiliza-se um DIO geno bio rupture UCD 200.Sonicar a amostra cercada por uma mistura de gelo. Não permita que a temperatura suba acima de quatro graus Celsius nem que congele na centrífuga. Centrifugar a amostra sonicada a 14.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Transfira o sobrenadante para um tubo eend DPH novo pré-resfriado em gelo. Divida a amostra sonicada em no máximo cinco alíquotas. Armazene uma alíquota a menos 20 graus Celsius para reservar sua entrada para a reversão da ligação cruzada.Dilua em etapas os outros alíquotos em dez vezes no tampão de diluição do chip contendo PIC recém-adicionado na proporção de um microlitro por 800 microlitros de tampão. Primeiro, determine quais velocidades de centrifugação serão utilizadas para o pré-limpeza com base no anticorpo a ser usado para a proteína do ensaio no chip. As microesferas A são usadas aqui porque o anticorpo a ser usado para o chip é de origem raba.Pré-limpe o sobrenadante diluído adicionando 75 microlitros de uma solução a 50% de esperma de salmão, DNA e proteína. Incube em agitação a quatro graus Celsius durante uma hora; após a incubação, centrifugue as amostras a 2.500 ×g por um minuto a quatro graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para um novo tubo DPH pré-resfriado.Adicione quatro microgramas de anticorpo por amostra ao Eloqua pré-limpo e incube durante a noite a quatro graus Celsius com rotação. Comece adicionando 60 microlitros da suspensão de espermatozoide de salmão, DNA proteico, uma suspensão de microesferas a cada amostra e incube a quatro graus Celsius com rotação por uma hora. Centrifugue as amostras a 1000 G por um minuto a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, remova cuidadosamente os sobrenadantes e descarte-os, mantendo o complexo de DNA, proteína e microesferas no gelo. Ressuspenda e lave os pellets conforme descrito no protocolo escrito, utilizando os tampões um a quatro.Cada lavagem consiste em um período de incubação de cinco minutos com rotação, seguido por centrifugação a 1000 G durante um minuto e remoção do sobrenadante após a lavagem. Elua o complexo anticorpo de cromatina ressuspendendo vigorosamente o complexo de perlas de proteína de cromatina lavado em 250 microlitros de tampão de eluição recém-preparado. Vortex cada amostra por cinco segundos e, em seguida, incube as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos com rotação, após centrifugação a 2.500 G durante um minuto. À temperatura ambiente, transfira cada eluato para um novo tubo eppendorf.Repita o processo de eluição e combine o eluato de cada amostra no mesmo tubo eppendorf. Para reverter as ligações cruzadas, adicione 20 microlitros de cloreto de sódio 5 M a cada eluato de 500 microlitros. Para o controle de entrada previamente reservado, adicione 40 microlitros de cloreto de sódio 5 M por mililitro.Aqueça os EITs em banho-maria a 65 graus Celsius por quatro horas. Para a análise noturna, aplique 10 microlitros de cada amostra no controle de entrada em um gel de agarose 2% ao lado de um marcador de tamanho que varie de 0,1 a um par de quilobases para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA. O DNA aparecerá como uma mancha difusa e não como uma banda nítida.Recupere o DNA de cada amostra de 500 microlitros utilizando um kit de extração em gel rápido kaya. Comece adicionando 600 microlitros de tampão qg para otimizar a absorção do DNA pela membrana de sílica em uma coluna de centrifugação rápida kaya e, em seguida, adicione 200 microlitros de isopropanol antes de carregar a coluna. Verifique a mistura para determinar se há presença de precipitado de SDS.Se ocorreu precipitação de SDS, as amostras devem ser aquecidas em banho-maria a 42 graus Celsius até que o precipitado desapareça. Em seguida, aplique as amostras nas colunas e elua o DNA conforme instruções do fabricante. O SDS pode interferir na atividade da polimerase PCRT e, portanto, deve ser completamente removido antes de realizar a PCR.Incube cada amostra de DNA no gelo para precipitar qualquer resíduo de SDS e centrifugue a 14.000 G por um minuto a quatro graus Celsius. Transfira o SANE para novos tubos einor. Os EITs de DNA podem ser detectados por PCR convencional ou por PCR quantitativa em tempo real ou QPCR com primers específicos. Para cada sequência a ser analisada, utilize cinco a 10 microlitros do DNA total IIT para uma reação de PCR ou QPCR. As condições de PCR e QPCR variarão.No entanto, a quantidade limitada de material inicial exige ciclos adicionais de PCR para a detecção por PCR convencional; inicie com 40 ciclos e ajuste conforme necessário. Utilizando este protocolo, experimentos de ChIP foram realizados com embriões de E 8,5 e E 9,5. Os DNAs purificados por ChIP foram analisados por PCR convencional e por PCR quantitativo em tempo real.Os resultados demonstram que o fator miogênico e regulatório está presente no promotor miogênico em embriões de E 8,5 e E 9,5. Em contraste, não houve indicação de ligação miogênica ao promotor miogênico no saco vitelino, onde o miogênico não é expresso. O promotor do interferon gama, que contém sequências correspondentes ao sítio de ligação miogênico, foi utilizado como controle negativo de sequência, conforme esperado; o miogênico não se ligou ao promotor do interferon gama em nenhuma das amostras de tecido testadas.Os resultados indicam que Myogenic está ligado ao promotor Myogenic nos somitos de embriões de E 8,5 e E 9,5, já que myo Genin é expresso especificamente nos somitos nessas fases. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e preparar embriões de camundongo de EA 0,5 para precipitação de cromatina, avaliação que identificará fatores regulatórios associados a genes específicos de tecidos em tecidos em desenvolvimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Aqui, descrevemos uma produção eficiente de...

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Demonstramos um método para enxertar células cultivadas em locais definidos de embriões de camundongos iniciais para determinar seu potencial in vivo. Também introduzimos um método de eletroporação otimizado que usa capilares de vidro de diâmetro conhecido, permitindo a entrega precisa de DNA exógeno em algumas células dos embriões.

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.

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Este artigo estabelece um pipeline para suspensões de células e núcleos únicos de alta qualidade de embriões de camundongos gastrulados para sequenciamento de células e núcleos únicos.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Aprenda o ensaio de imunoprecipitação da cromatina para estudar genes tecido-específicos em embriões de rato E 8.5. Este método permite analisar interações proteína-DNA durante o desenvolvimento embrionário.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

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