Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco neurais humanas de tecido cortical frontal descartado. Isso é realizado primeiramente preparando as soluções e materiais com antecedência antes da dissecação de cérebros fetais humanos. Em seguida, realiza-se a manutenção das células-tronco neurais isoladas, incluindo expansão adicional, caracterização e experimentação.

O armazenamento de longo prazo é viável, assim como o estabelecimento de subculturas para a diferenciação de progenitores em tipos celulares neuronais e gliais. Em última análise, a diferenciação de células do SNC normal pode ser caracterizada e comparada à de células derivadas do SNC com distúrbios neurológicos conhecidos. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de qualquer distúrbio humano do SNC.

A técnica fornece uma plataforma simples e confiável para avaliar S patológica e para avaliar a eficácia farmacológica de novas drogas para uma determinada desordem. Devido ao valor excepcional das células pluripotentes, todos os materiais precisam estar prontos com antecedência antes de iniciar o protocolo. Para minimizar o risco de comprometer as amostras, prepare o dissecção refrigerado, banho de meio aquecido a 37 graus Celsius para cultura, meio e células refrigeradas e meio de congelamento para armazenamento de longo prazo.

Crio-preservação para a dissecação: tenha pinças estéreis autoclavadas e lâminas de bisturi com cabos prontos para a dissociação celular. Tenha um pipetador, pipetas de transferência de 10 mililitros e uma peneira de células de 40 micromolares. Prepare e reserve várias placas de cultura de 10 centímetros para a dissecação.

Tubos de centrífuga de 50 mililitros para dissociação. Tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para armazenamento de tecido e frascos congelados para congelamento de células para garantir o sucesso. Tecido viável de 18 a 22 semanas precisa ser colhido dentro de duas horas após sua disponibilidade.

Idealmente, o tecido fetal pode ser obtido em minutos após sua disponibilidade, mediante acordos para coleta após procedimentos eletivos. Os tecidos muitas vezes estão fragmentados, no entanto, uma porção significativa do cérebro permanece intacta. Colete o cérebro em uma placa de Petri de 10 mililitros preenchida com meio de dissecação gelado.

Identifique as diferentes partes do córtex por meio de marcos anatômicos. Os limites dos córtices frontal, parietal e occipital são orientados pela interseção extrapolada do sulco central e do sulco de Silvio. Disseque o tecido do córtex frontal anterior ao sulco central e ao longo da borda do sulco silviano com lâminas cirúrgicas.

Certifique-se de manter o ventrículo intacto e sem danos. Agora, remova qualquer sangue residual e meninges do bloco separado do córtex frontal. Se a amostra não estiver muito fragmentada e for suficientemente grande, dissecione o bloco em várias amostras menores para reservar parte para histologia e ensaios de proteínas ou mRNA.

Agora transfira um fragmento de cérebro para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e adicione três vezes o volume do tecido em meio de dissecação gelado. Usando uma pipeta, dissocie suavemente o tecido até que todos os fragmentos fiquem desagregados. Para suspender completamente as células, filtre-as através de uma peneira celular de 40 micrometros.

Agora, centrifugue a suspensão celular e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de cultura fresco e aquecido. Usando um hemocitômetro, conte o número de células e calcule o volume correspondente a 2 milhões de células. Em seguida, transfira cada volume de 2 milhões de células para um frasco de cultura de 25 centímetros quadrados.

Preparado com cinco mililitros de meio de cultura morno. Mantenha as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante uma semana. Troque metade do meio uma vez por semana para culturas mais longas. Após uma a duas semanas em cultura, neuroesferas geralmente se formam com um diâmetro de CNT entre 200 e 400 mícrons.

Para dissociar as neuroesferas em células isoladas, incubar as células com EDTA em meio de Hank por 15 minutos. Para preparar as células suspensas para subcultivo, centrifugá-las, lavar com Hank e repô-las em meio de cultura quente.

Para iniciar a diferenciação, plaque as células dissociadas em lamínulas revestidas com poli-L-lisina e laminina a uma densidade de 100.000 células por lamínula e incube por 30 minutos. As células podem ser facilmente diferenciadas em oligodendrócitos, neurônios ou astrócitos.

Para a diferenciação neuronal, mantenha as células em meio com B 27 por sete dias. Para o cultivo de diferenciação em astrócitos, mantenha as células em meio com FBS por sete dias. Para a diferenciação em oligodendrócitos, mantenha as células em meio modificado com fatores de crescimento por dois dias e, após dois dias, utilize o mesmo meio modificado sem os fatores de crescimento por mais cinco dias para manter as células-tronco.

Após a centrifugação das suspensões de células dissociadas, ressuspenda as células em meio de congelamento na concentração de 10 milhões de células por frasco. Por mililitro, congele lentamente as células a menos 20 graus Celsius antes de armazená-las a menos 80 graus Celsius para conservação de longo prazo. Transfira-as para nitrogênio líquido.

Posteriormente, as células são descongeladas rapidamente em banho-maria a 37 graus Celsius e ressuspendidas. Em D-M-E-M-F 12 aquecido mais 10% de soro para uma lavagem. As células aquecidas são então centrifugadas, o sobrenadante é aspirado e as células são ressuspendidas no meio de cultura aquecido.

Células-tronco neurais médias de um feto normal. Na idade gestacional de 18 semanas, foram cultivadas para formar neuroesferas, que foram transfectadas com GFP. As neuroesferas foram diferenciadas para produzir vários tipos celulares, que então foram fixados e corados com marcadores celulares e rumina.

A multipotencialidade é observada com a expressão de marcadores indicativos de neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar, expandir e manipular células-tronco neurais humanas a partir de tecido cortical frontal descartado. Essas regiões oferecem uma oportunidade única para estudar as doenças do ambiente cortical humano e testar a eficácia potencial de agentes farmacoterapêuticos.