ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar um novo e rápido método de amplificação de sinal para detectar e caracterizar os subtipos virais de influenza no chip de gripe, plataforma de microarray de baixa densidade. Isso é obtido incorporando DTPs biotiniladas e usando primers com uma extremidade de cinco fosfol primos para amplificar o segmento do gene da matriz e um segmento de gene não estrutural de extratos de RNA da gripe. A PCR é seguida por digestão enzimática e fragmentação para gerar produto viral biotinilado e amplificado de fita simples curta, que é então hibridizado com a matriz após a hibridização.

A detecção de raposas usa fotopolimerização para cultivar grandes pontos de polímero onde ocorre a hibridização, e padrões de hibridização diferencial são usados para detectar subtipos virais de influenza. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a detecção de fluorescência padrão, é que ela é bastante barata e fornece um resultado rápido visível a olho nu com sensibilidade analítica semelhante à fluorescência. Embora esse método possa fornecer informações sobre a caracterização dos vírus da gripe usando o chip da gripe, porque é um método de detecção universal.

O Ampl Fox também pode ser aplicado a uma ampla variedade de outros sistemas, como outros microarrays de baixa densidade baseados em DNA e proteínas. Em teoria, qualquer produto biotinilado deve poder ser detectado usando amox. Demonstrando o procedimento estarão Amber Taylor, cientista associada, e Kevin Moulton, assistente de pesquisa aqui na Endeavor, que foram fundamentais no desenvolvimento do instrumento Fox e da química de detecção nos últimos anos.

Extraia o RNA viral de 200 microlitros de isolado viral usando um kit de extração de RNA viral e o protocolo do fabricante. Eluir 60 microlitros do volume final e armazenar extratos a menos 70 graus Celsius ou menos para uso posterior. Em seguida, prepare a mixagem master R-T-P-C-R no ICE de acordo com o protocolo do fabricante.

Usando uma mistura DNTP BIOTINILADA, adicione a mistura de primer de chip de gripe, que contém as concentrações mostradas na mistura principal. Um primer de cada conjunto deve conter um grupo fosfolal de cinco primos para facilitar a digestão enzimática. O conjunto de primers para gripe produz um produto de par de bases 1032 e o conjunto de primers para gripe B produz um produto de par de bases 811.

Um breve vórtice e distribua 18 microlitros da mistura principal em tubos de PCR de paredes finas. Em seguida, adicione dois microlitros de molde de RNA a cada tubo de reação. Transfira os tubos de PCR para um termociclador e use um perfil de ciclismo com uma temperatura apropriada de ajoelhamento.

O perfil de ciclagem usado neste ensaio é mostrado aqui. Prepare a mistura de digestão enzimática combinando 2,2 microlitros do tampão de reação enzimática, 0,8 microlitros de água livre de nuclease e 1,0 microlitros de enzima exonuclease lambda por reação de PCR. Remova as amostras do termociclador e adicione quatro microlitros a cada tubo de PCR.

Retorne as amostras para o termociclador e programe o termociclador conforme mostrado para 37 graus Celsius por 15 minutos, seguido de 95 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique poços de hibridização de uso único ao redor dos microarrays a serem hibridizados. Em seguida, lave as lâminas em 110 mililitros de água purificada em um agitador orbital por cinco minutos.

Seque as lâminas tocando suavemente um lenço de papel na borda do poço. Combine 22 microlitros de tampão de hibridização de dois x com cada um dos produtos de DNA de fita simples fragmentados misturados brevemente e pipete 40 microlitros nos poços de microarray. Deixe as lâminas hibridizarem por uma hora em uma câmara de umidade após a hibridização, remova as lâminas da câmara de umidade e enxágue brevemente cada lâmina com dois mililitros de tampão de lavagem D.Coloque as lâminas em um rack de lâminas.

Em seguida, adicione 110 mililitros de tampões de lavagem A e B para separar os recipientes usando um agitador orbital. Lave o suporte deslizante no buffer A a 60 a 90 RPM, a velocidade usada para todas as lavagens subsequentes por um minuto. Em seguida, remova o suporte deslizante do tampão de lavagem A e enxágue brevemente com o tampão de lavagem D.Transfira o suporte deslizante para o tampão de lavagem B e lave no agitador orbital por cinco minutos.

Após a lavagem, seque suavemente as matrizes em cada lâmina com um lenço de papel e coloque as lâminas secas na câmara de umidade. Em preparação para as etapas de detecção métrica de cores de raposa, combine 10 microlitros de amplitude, 20, microlitros de tampão de amplitude de dois x e 10 microlitros de água purificada para cada matriz a ser processada, transfira 40 microlitros de mistura de rótulos para cada matriz e permita que a reação de rotulagem prossiga em uma câmara de umidade fechada Por cinco minutos Durante a hibridização, prepare 110 mililitros de tampão de lavagem C em um recipiente. Após a rotulagem, enxágue imediatamente cada matriz com tampão de lavagem D. Coloque cada lâmina no rack de slides e lave e lave o buffer C no agitador orbital por cinco minutos após a lavagem do mar do buffer, mergulhe brevemente o rack de slides três vezes em um recipiente com água purificada.

Para remover resíduos de sal, seque as matrizes conforme mostrado anteriormente. Armazene as matrizes em uma caixa de slides escura até a ativação da foto e da imagem, que deve ser concluída em 24 horas. Em seguida, ligue o leitor Amli Fox e certifique-se de que o Amli view software está pronto para ativação de fotos antes da detecção de amostras de matriz.

Primeiro, determine o tempo ideal de fotoativação para todas as amostras seguindo um breve procedimento de calibração. Uma vez por uso diário, aqueça a solução Amplify à temperatura ambiente e vortex brevemente para misturar a pipeta de três microlitros do intensificador amplificado no ampfrasco amplificado e vórtice completamente. Por 10 segundos, aplique uniformemente 40 microlitros de solução Amplify em apenas uma lâmina de cada vez, garantindo que não haja bolhas.

Insira o slide de microarray no compartimento de ativação de fotos do Amplify Reader. Inicie a ativação da foto selecionando, inicie no PL view software usando o tempo de ativação da foto determinado no processo de calibração. Depois de concluído, enxágue o microarray com dois mililitros de água purificada para remover o excesso de amplificação clara A formação de polímeros agora ocorreu em pontos contendo DNA alvo, mas é melhor visualizada.

Após a coloração, deixe as manchas de polímero secarem por dois minutos. Em seguida, distribua duas gotas de amplamente vermelho na matriz e deixe a coloração prosseguir por dois minutos Após a coloração, enxágue rapidamente a lâmina com água purificada e seque conforme mostrado anteriormente, insira a lâmina no compartimento de imagens do leitor Amli Fox para coletar uma imagem usando o software amli para processar os resultados. A imagem à esquerda mostra a detecção de um romance de 2009 H one N one espécime de Amli Fox.

Embora a imagem à direita use fluorescência tradicional gerada por um scanner de microarray de fluorescência confocal, o mesmo padrão geral de detecção pode ser facilmente visto para ambos os métodos. No entanto, o resultado da raposa Amli é visível a olho nu. Essas imagens mostram resultados de chips de gripe de origem humana, H três N duas origens humanas, H um N um, origem suína, H um N um e uma matriz de raposa negativa sem influenza detectável.

As sequências dois e três delineadas em azul produzem sinal para toda a gripe. A subtipos mostrados, mas as sequências delineadas em vermelho no canto inferior direito produzem apenas sinal para a origem suína, H um N um espécime. A amostra negativa mostra sinal em uma sequência de controle interno delineada em verde, indicando nenhuma inibição ou falha da reação RTPCR.

Uma vez dominado, todo o processo, desde a extração do frasco até a detecção de amox e a interpretação do resultado final, pode ser realizado em aproximadamente seis horas. A parte de detecção Ampl Fox do procedimento, incluindo a calibração do instrumento, pode ser concluída em aproximadamente 30 minutos após este procedimento. Outros métodos, como sequenciamento parcial ou completo do genoma, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Este ensaio de influenza destina-se a ser uma triagem inicial, particularmente para amostras que resultam em um padrão de hibridização único. Como a detecção é um ensaio geral, esperamos que os pesquisadores encontrem novas e interessantes aplicações de microarrays de baixa densidade para as quais a detecção possa agregar valor.