Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

Estudar as relações de fluxo da pressão pulmonar pulsátil. Este protocolo explica como isolar, ventilar e perfundir pulmões de camundongos. A traqueia é exposta cirurgicamente para ventilação.

Em seguida, o coração e os pulmões são isolados para que a artéria pulmonar e o átrio esquerdo possam ser canulados. O sistema pulmonar é então perfundido. Os experimentos são realizados alterando o fluxo, magnitude, forma de onda e/ou frequência da artéria pulmonar.

As formas resultantes da onda de pressão da artéria pulmonar e do átrio esquerdo são registradas e demonstram as relações de fluxo de pressão pulmonar pulsátil. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como preparações in vivo, é que as mudanças nas relações de fluxo de pressão. As relações de fluxo de pressão pulsátil podem ser obtidas na ausência de alterações no estado do volume, tônus do sistema nervoso simpático, atividade e efeitos da anestesia.

Além disso, a maioria das preparações pulmonares isoladas mede apenas relações de fluxo de pressão constante, enquanto nossa técnica permite que as relações de fluxo de pressão pulsátil sejam determinadas. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia pulmonar, como como a doença vascular pulmonar afeta a hemodinâmica pulmonar pulsátil ou como o enrijecimento da grande artéria pulmonar afeta a pós-carga do ventrículo direito? A demonstração visual desse método é fundamental, pois é difícil expor o coração e os pulmões e prender a cânula na artéria pulmonar.

O excesso de pressão da instrumentação pode causar edema nos pulmões e a colocação inadequada da cânula pode perfurar a artéria pulmonar. Antes de iniciar o experimento, é necessário preparar o sistema IL um usado para ventilar e perfundir o pulmão isolado. A tubulação deve ser conectada aos transdutores de pressão.

O bomba solitária e medidor de vazão completamente Lave o sistema com água destilada aquecida a 37 graus Celsius e remova quaisquer bolhas na tubulação. Em seguida, prepare a tubulação da bomba de tecnologia Endur com 1% de PBS. Agora zero.

A pressão para cada transdutor P 75 fechando primeiro sua válvula para o sistema IL one e abrindo sua válvula para a atmosfera. Em seguida, use o plugue SIS amplifier para zerar automaticamente a pressão antes de preparar o animal umidificar a configuração IO one embebendo a peça porosa de cerâmica em água destilada. Depois de anestesiar o mouse, estabilize-o para a cirurgia prendendo suas patas dianteiras no quadro de cortiça.

Agora borrife o peito com álcool 95%. Use uma pinça reta para agarrar a pele do pescoço e corte uma abertura de um centímetro com a tesoura reta. Uma vez que a parte interna do pescoço esteja exposta, corte o tecido glandular branco nos músculos superficiais enquanto procura o esôfago e a traqueia.

Isole o esôfago e a traqueia do tecido de ambos os lados e posteriormente e amarre uma sutura solta ao redor da traqueia. Para canular a traqueia, corte cuidadosamente um pequeno V em um lado dela com a tesoura pequena. Agora leve o mouse para o sistema IL um usando uma pinça romba.

Pegue a cânula traqueal e deslize-a para dentro da traqueia. Prenda a cânula com uma sutura. Comece a ventilação com ar ambiente primeiro, borrife o peito com álcool e remova a pele usando uma pinça reta e uma tesoura reta.

Corte a pele para cima ao longo do esterno. Levante a pele de cada lado e corte ao longo da linha das costelas inferiores. Agora segure o processo xifóide com uma pinça e use uma tesoura de ponta esférica para fazer um orifício no diafragma onde ele encontra a parte inferior do esterno.

Pegue o diafragma e corte-o das costelas. Usando uma tesoura com ponta esférica, segure o processo xifóide novamente e use a tesoura com ponta esférica para cortar cuidadosamente o esterno através das costelas sem danificar os pulmões, coração ou vasos sanguíneos. Para expor o coração, pegue as costelas esquerdas e corte suas pontas.

Agora injete lentamente no ventrículo direito 0,1 mililitros de heparina Após a injeção, corte o resto das costelas. Use a parte de trás ou a extremidade arredondada da pinça para empurrar suavemente os pulmões para longe da costela enquanto corta as costelas ao microscópio. Remova o tecido glandular da gordura na parte superior do coração.

Use a pinça para retirar os lenços e apará-los. Com a tesoura de mola para colocar uma sutura ao redor da aorta e da artéria pulmonar, bata suavemente no coração com uma pinça embotada. Deve haver pouca resistência.

Agora amarre uma sutura solta com o arremesso duplo. Em seguida, corte a parte inferior do abdômen. Use uma tesoura angular para cortar as costelas e a coluna.

Isso fará com que uma quantidade significativa de sangue flua. Use um cotonete para estancar o fluxo. Assim que o fluxo sanguíneo for interrompido, prepare o sistema IL com quatro mililitros de RPMI de uma seringa cheia de 10 mililitros de RPMI.

É bom verificar se a tubulação não contém bolhas. Agora canule o ventrículo direito cortando um pequeno entalhe perto do ápice e inserindo a cânula Mire para baixo à direita para alcançar a artéria pulmonar. A ponta da sonda deve ser visível através da parede quase transparente da artéria pulmonar.

Em seguida, aperte a sutura ao redor da cânula, aorta e artéria pulmonar para canular o ventrículo esquerdo. Corte um entalhe no ápice e insira a cânula apontando para cima no átrio esquerdo. Pode ser necessária uma leve pressão para encontrar a válvula, mas, uma vez encontrada, a cânula deslizará e ficará segura sem sutura.

Infunda manualmente o RPMI da seringa de 10 mililitros a 0,3 mililitros por minuto até ver o fluxo na tubulação de saída. Se não houver fluxo na tubulação de saída, reposicione a cânula do ventrículo esquerdo. No entanto, se não houver fluxo nos pulmões, aborte o experimento porque a artéria pulmonar provavelmente tem um vazamento.

Agora que o coração está totalmente canulado, conecte a seringa de 60 mililitros ao sistema IL one. Usando a bomba de fluxo constante e infundir o RPMI Perfuse oito a uma taxa de um mililitro por minuto. Verifique se há vazamento durante a perfusão inicial.

Perfunda gradualmente os pulmões por mais dois minutos, durante os quais os pulmões ficarão brancos. Para estudos de fluxo pulsátil. Primeiro ajuste o deslocamento do pistão da bomba solitária nos níveis desejados.

Em seguida, defina a taxa de fluxo constante. Agora abra a válvula da bomba osli e comece a registrar os dados antes de executar o perfil de fluxo osli. Quando terminar, abra o arquivo de saída de dados e plote o fluxo experimental com base nos fluxos experimentais do teste inicial.

Ajuste o deslocamento do pistão da bomba oscilatória em cada frequência para que Q max seja o desejado. Mantenha a ventilação a uma pressão constante Durante a coleta de dados para testes de fluxo constante, feche a válvula da bomba solitária e ajuste a taxa de fluxo constante para o nível desejado. Comece a registrar dados e percorra o protocolo de fluxo constante.

Coleta de dados por pelo menos 10 segundos em cada taxa de fluxo entre as tentativas. Redefina a taxa de fluxo para 0,5 mililitros por minuto. Certifique-se de manter a ventilação a uma pressão constante durante a coleta de dados.

Se forem desejados testes de pressão atrial esquerda zero, remova a tubulação de saída durante a realização dos testes. Observe atentamente o RPMI na tubulação das vias aéreas. O RPMI não deve atingir os transdutores de pressão das vias aéreas ou eles serão danificados.

Aqui estão os resultados da perfusão de fluxo constante com fluxo Q na linha superior e pressões resultantes da artéria pulmonar e do átrio esquerdo na segunda linha sob uma variedade de condições. Nos dois primeiros painéis, a pressão do átrio esquerdo aumentou e diminuiu com Q porque a tubulação de saída estava no lugar, o primeiro painel mostra a pressão do ar na extremidade, pressão inspiratória e o segundo mostra a pressão do ar na pressão expiratória final. Em seguida, a tubulação foi removida para que a pressão do átrio esquerdo fosse constante e independente de Q. Em seguida, a altura da tubulação de saída foi ajustada manualmente para que a pressão do átrio esquerdo fosse maior.

Mas, independentemente de Q novamente, o primeiro painel mostra a pressão do ar no final, a pressão inspiratória e o segundo mostra a pressão do ar no final. Pressão expiratória. As relações de fluxo de pressão da artéria pulmonar constantes resultantes para cada caso podem ser obtidas plotando pressão versus fluxo.

Aqui estão os resultados da perfusão de fluxo pulsátil com fluxo Q no painel superior e as pressões da artéria pulmonar, átrio esquerdo e ar resultantes. No painel inferior. A partir dessas relações de fluxo de pressão pulmonar pulsátil, pode-se calcular a impedância vascular pulmonar, que reflete a pós-carga total do ventrículo direito.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 a 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante levar o seu tempo e relaxar para que suas mãos fiquem firmes. Uma vez que os pulmões estejam adequadamente perfundidos, a parte difícil acabou.

Após esse procedimento, outras técnicas podem ser realizadas, como histologia ou ensaios bioquímicos no tecido pulmonar, para responder a perguntas adicionais, como quais mecanismos moleculares são responsáveis pelas mudanças observadas nas relações de fluxo de pressão pulsátil pulmonar. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da fisiologia pulmonar explorarem o papel de genes e proteínas específicos no desenvolvimento e progressão da doença vascular pulmonar usando camundongos geneticamente modificados.