Name: Invasão das células humanas por um agente patogénico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprenda a medir a invasão de células endoteliais humanas por Staphylococcus aureus usando gentamicina e lise celular. Este método permite quantificar a capacidade invasiva de cepas bacterianas e identificar proteínas envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.

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Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust (WT 0.795.880).

O protocolo a seguir irá descrever o estudo da invasão de células endoteliais por S. aureus, mas teoricamente pode ser usado para estudar invasão celular por qualquer bactéria cultivável. Estágios específicos para S. células endoteliais aureus e são indicados. 1. Preparação de bactérias <ol><li> Cultura S. cepas de Staphylococcus de 16/04 h (dependendo da fase de crescimento necessário) em 10 Cérebro-caldo Infusão ml (BHI) a 37 ° C no ar com agitação a 200 rpm. Estas condições de crescimento são específicos para S. aureus e pode precisar ser adaptado para outras bactérias. </li><li> Lavar as bactérias três vezes em meio Modified Dulbecco Águia (DMEM; Invitrogen) por rodadas alternadas de centrifugação a temperatura ambiente (5.000 x g, 10 min), a remoção do sobrenadante da cultura e ressuspensão do pellet bacteriano em um volume equivalente de DMEM. Medir a densidade óptica da suspensão resultante de bactérias que podem ser ajustados conforme a necessidade. Para S. aureus, nós preparamos uma suspensão na OD = 1 600, o que corresponde a ~ 10 9 ufc ml -1. </li></ol> 2. Cultura de células endoteliais <ol><li> Cultura da linhagem de células endoteliais EA.hy926 1 em DMEM suplementado com soro fetal bovino (FBS, 10%) e L-glutamina (2 mM) a 37 ° C em 5% CO 2. Alternativamente, agrupados células primárias de veias umbilicais humanas endoteliais (HUVECs) pode ser comprado de Lonza (Basel, Suíça) e cultivadas em meio basal endotelial suplementado com 2% de SFB, extrato de cérebro de bovinos (incluindo a heparina), fator de crescimento endotelial humana e hidrocortisona a 37 ° C em 5% de CO 2 de acordo com as instruções do fabricante (Lonza). Estas condições de crescimento são específicos para estas células e pode precisar ser adaptado para outros tipos de células host. </li><li> Cultivar células endoteliais em frascos de T75 para completar confluência, verificada por olho. </li><li> Prepare as placas de 24 poços para a inserção das lamelas. Pinças finas (chama esterilizado) são necessários para mover as lamelas, que têm uma superfície opaca e um brilhante. Lamínulas lugar nos poços da placa de 24 poços com a superfície opaca virada para cima para permitir a ligação celular. </li><li> Liberar as células do frasco T75 com 3 ml de tripsina-EDTA (0,25%) e adicionar a 10 ml do meio de cultura relevante. </li><li> Adicionar 500 mL de células em suspensão para placas de 24 poços contendo lamínulas de vidro Thermanox. Um frasco T75 confluentes de células desde células suficientes para duas placas de 24 poços, resultando em cerca de 5 × 10 5 células por poço (em 500 mL de médio). </li><li> Incubar as placas por 48 h, como descrito acima, e verificar 100% de células confluência por microscopia de luz invertida. </li><li> Dip-lavagem lamínulas em PBS e adicionar novas placas de 24 poços contendo 490 l contendo DMEM 10% FBS em cada poço. </li><li> Para examinar o papel de determinados processos metabólicos na invasão celular, os inibidores podem ser adicionados a culturas de células de 1 h antes da adição de bactérias e concentrações mantida durante o ensaio. Por exemplo, para determinar o papel do rearranjo de actina em S. aureus invasão das células endoteliais, 50 mM citocalasina D pode ser adicionada, ou para o papel de cavéolas, 5 mM metil-β-ciclodextrina pode ser adicionado. </li></ol> 3. Ensaio de invasão <ol><li> Adicionar 10 ml de bactérias lavada (resultando em cerca de 2 × 10 7 ufc ml -1 de S. aureus) a cada poço contendo uma lamela lavado com uma camada confluente de células endoteliais em 490 l contendo DMEM 10% FBS. </li><li> Incubar durante 15-90 minutos a 37 ° C em 5% CO 2. </li><li> Para medir o número total de bactérias associadas com as células (aderente e internalizadas), mergulhe-as lamelas lavar três vezes em PBS e adicione aos poços contendo 500 mL fresco Triton 0,5% X-100 em PBS. Para garantir as células totalmente lisar e liberar todas as bactérias internalizadas, pipetar o várias vezes, apontando a ponta da pipeta directamente na superfície da lamela. </li><li> Enumerar as bactérias por plaqueamento a suspensão líquida (ou diluições deste, sempre que necessário) sobre a superfície de placas de TSA. Desde TX-100 vai lisar muitas bactérias Gram-negativas, saponina pode ser usado em vez 2. </li><li> Para medir o número de bactérias internalizadas, remover o sobrenadante da cultura de cada bactéria unbound bem contendo e substituir com 500 mL DMEM/10% FBS suplementada com 200 mg ml -1 gentamicina. Rotineiramente usamos gentamicina, em vez de lysostaphin aqui como é mais barato e nos permite alternar entre experimentos usando diferentes tipos de bactérias (por exemplo, estafilococos e Lactococci) sem ter que mudar o protocolo experimental. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO 2 por 60 minutos para matar todas as bactérias extracelulares. </li><li> Lavar lamínulas 3 vezes em PBS,lisar e enumerar por plaqueamento em TSA, conforme descrito para o ensaio de adesão acima. </li><li> Em alguns casos, pode ser preferível visualmente contar o número de bactérias por microscopia de luz. Neste caso, e específicos para S. invasão celular aureus, use lysostaphin (10 mg ml -1), em vez de gentamicina para destruir fisicamente as bactérias extracelulares. </li><li> Incubar lamínulas por 20min a 37 ° C em CO 2 na solução lysostaphin, em seguida, lavar e consertar com Cytopath (Cellpath). </li><li> Flood as lamelas com cristal violeta (0,5%, w / v) para 5min. </li><li> Dip-enxágüe em água, ar seco e montagem em lâminas de vidro. O número de bactérias por mm 2 de células endoteliais confluentes podem ser quantificados utilizando microscopia de luz. </li></ol> 4. Resultados representativos: Expressão de proteínas de ligação a fibronectina (FnBPA e FnBPB) sobre a superfície da S. aureus confere a capacidade de invadir células endoteliais. Trabalho recente redefiniu o domínio de ligação de fibronectina FnBPA 3. Do tipo selvagem (WT) S. aureus 8.325,4 invade células endoteliais com alta eficiência, enquanto que uma cepa falta tanto FnBPA e B (Δ FNB) apresentaram níveis significativamente reduzida de internalização (Figura 1A). Complementação do mutante com um plasmídeo A FNB menos o domínio de ligação de fibronectina (pFnR0) não promover a invasão (Figura 1A). Por outro lado, a complementação do mutante com um plasmídeo FNB inteira Um gene (pFnBA4) restaurado invasão a níveis WT (Figura 1A). O papel do FnBPA na invasão de células endoteliais também pode ser demonstrada através dos expressão heteróloga Lactococcus lactis host. Expressão de plasmídeo codificado FnBPA em L. lactis (pRM9 9) não aumentar significativamente a adesão às células endoteliais em comparação com as bactérias não expressar FnBPA (CTL) (bares abertos, Figura 1B). Por outro lado, expressando-FnBPA L. lactis invadiram células endoteliais em níveis significativamente mais altos do que a cepa não expressar (bares fechados, Figura 1B). Experimentos foram realizados quatro vezes em duplicado e os média ± desvio padrão é apresentada. * Representam dados que são estatisticamente diferentes (p = &lt;0,05) da WT ou valores CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Invasão de EA. Hy926 células endoteliais por S. aureus (A) ou L. lactis (B).

<ol><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li>
<li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li>
<li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li>
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<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun.%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li>
<li>Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li>
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<li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li>
<li>Eiff, C. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small+colony+variants%3A+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li>
<li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> O ensaio descrevemos baseia-se no ensaio de proteção a gentamicina, que tem sido amplamente utilizada para estudar a invasão das células do hospedeiro por bactérias. Observações da incapacidade dos antibióticos gentamicina e outros para matar as bactérias intracelulares foram utilizados nos primeiros estudos sobre a invasão das células do hospedeiro por bactérias 4-8. O uso de 24, 48 ou mesmo placas de 96 poços permite a geração de grandes quantidades de quantitativos, dados reprodutíveis em um curto período de tempo e de custo relativamente baixo. O ensaio também é atraente, porque não requer equipamento especializado, ele pode ser adaptado para trabalhar com várias bactérias e células, e pode ser usado para estudar o papel dos processos celulares tanto bacterianas e de acolhimento na invasão 9. De fato, desde os primeiros experimentos, o ensaio de proteção gentamicina tem sido amplamente empregada para medir a invasão da célula hospedeira por uma gama de bactérias diferentes, ou mesmo combinações de bactérias 10,11. Embora os princípios fundamentais são os mesmos, muitas variações sutis no método tem sido relatado. Neste artigo descrevemos a nossa versão e indicou onde as modificações podem ser necessários para outras bactérias ou células do hospedeiro. Ao projetar um experimento para medir a invasão da célula hospedeira usando essa abordagem, há uma série de pontos importantes a considerar: Sensibilidade bacteriana à gentamicina. Isto pode parecer óbvio, mas é importante garantir que a bactéria em estudo é suscetível a gentamicina, na concentração, temperatura e ao longo da duração do tempo a ser utilizado. No caso de insensibilidade, pode ser possível a utilização de outros antibióticos 5. Uma abordagem alternativa pode ser a utilização de enzimas líticas (lysostaphin, mutanolysin, lisozima) 12. Incubação e inóculo. Ao executar este teste pela primeira vez é importante para estabelecer o período de incubação ideal e inóculo bacteriano a ser utilizado. Portanto, experimentos iniciais deve examinar tanto a adesão e invasão ao longo do tempo (5 min para até 6 h). Também é importante avaliar como a invasão é afetado pela multiplicidade de infecção (MOI, o número de bactérias por célula). Em geral, é melhor usar o menor número possível de bactérias como isso irá reduzir os danos às células em cultura. Importantes diferenças entre cepas podem ser perdidas se os períodos de incubação prolongado ou inóculos grandes são usadas 9,13. Danos celulares. É importante lavar as bactérias antes da utilização. No entanto, os danos celulares não se restringe à produção de toxinas. Invasão bacteriana, indução de apoptose e interrupção das funções normais celulares podem causar danos celulares. Isso pode levar a penetração de gentamicina na célula, matando as bactérias internalizadas e dando a impressão de que a invasão não ocorreu 14. Condições de incubação. A temperatura ea composição do meio de cultura pode ter um impacto significativo sobre a invasão. Por exemplo, a invasão de células HeLa por Streptococcus pyogenes é dependente da presença de fibronectina solúvel, que é normalmente presentes no soro 15. Outra consideração é o crescimento bacteriano no meio de cultura durante o curso do experimento. Cultura e quantificação de bactérias intracelulares. Embora TX-100 não pode matar as bactérias intracelulares, pode inibir o seu crescimento. Como tal, é importante verificar a replicação bacteriana em meios sólidos na presença do detergente. Onde afetados, pode ser possível a utilização de menores concentrações do detergente ou para usar uma alternativa, como saponina. Um benefício do ensaio de proteção gentamicina sobre a coloração violeta cristal e ensaio de microscopia é que é menos trabalhoso, e permite a detecção e diferenciação de sub-populações de bactérias internalizadas. Por exemplo, S. aureus pode produzir tanto um tipo de colônia normal (NCT) ou a variante pequena colônia (SCV) 16, que não seriam distinguíveis por microscopia de células bacterianas individuais. Um benefício da coloração violeta cristal e ensaio de microscopia sobre o ensaio de proteção gentamicina é a aglutinação de células podem ser contabilizadas e que as bactérias intracelulares que digitar um &#39;viável, mas não cultivável &quot;estado será detectado 17. Examinar o papel dos processos da célula hospedeira na invasão bacteriana. Muitos estudos têm empregado inibidores da função da célula hospedeira tais como citocalasina D, que interfere com rearranjo de actina. Tais estudos também podem incluir anticorpos que alvejam receptores de superfície celular e knockdown siRNA de genes específicos 18. É de vital importância para assegurar que estes tratamentos não afetam a viabilidade ou a fixação de células em cultura ou ter efeitos tóxicos sobre bactérias. Futuras direções: &gt; ONTEÚDO &quot;Porque este ensaio é normalmente realizado em multi-bem placas de cultura de células, é teoricamente possível adaptá-lo a uma operação de rastreio de alto rendimento, que pode envolver o exame de bibliotecas de potenciais inibidores da função das células, anti-infecciosos ou antibióticos projetado para atacar bactérias intracelulares. Alternativamente, essa abordagem pode ser usada para a tela mutante bibliotecas para identificar genes envolvidos na adesão, invasão e sobrevivência intracelular. Em alguns casos, pode ser desejável incluir forças de cisalhamento (fluxo) no sistema modelo, por exemplo, quando a modelagem do endotélio, para mais perto imitar o no ambiente vivo. avanços atuais na concepção e fabrico de células de fluxo e sistemas de cultura de células microfluídicos oferecem a possibilidade de empregar o ensaio de proteção gentamicina na patógeno-hospedeiro modelos que incorporam as forças de cisalhamento. Em resumo, o protocolo aqui descrito é baseado em abordagens similares utilizados por muitos anos. É amplamente aplicável a muitos tipos de células cultivadas e espécies de bactérias e pode gerar grandes quantidades de dados rapidamente ea um custo relativamente pequeno.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Infusão cérebro-coracão</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;soro bovino tal</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Meio basal endotelial</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de cérebro bovino (incluindo heparina)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento endotelial humano</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Lisostafina</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de Thermanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Citopatia</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>frascos T75</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Citoalasina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-β-ciclodextrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

invasão das células humanas por um agente patogénico

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Aqui vamos descrever a forma como nós estudamos a invasão de células endoteliais humanas por Staphylococcus aureus bacteriana patogênica. O protocolo geral pode ser aplicada ao estudo da invasão celular por praticamente qualquer bactéria cultivável. Os estágios em que aspectos específicos de invasão pode ser estudado, como o papel do rearranjo de actina ou cavéolas, será destacado. Células hospedeiras são cultivadas em frascos e quando estiver pronto para o uso estão semeados em placas de 24 poços contendo lamínulas Thermanox. Usando lamínulas permite posterior remoção das células dos poços para reduzir a interferência de proteínas do soro depositado para os lados dos poços (a que S. aureus seria anexar). As bactérias são cultivadas com a densidade necessária e lavada para remover qualquer proteínas secretadas (toxinas, por exemplo). Lamínulas com camadas confluentes de células endoteliais são transferidos para nova placas de 24 poços contendo meio de cultura fresco antes da adição de bactérias. Bactérias e células são então incubadas juntas para a quantidade necessária de vez em 5% CO 2 a 37 ° C. Para S. aureus este é tipicamente entre 15-90 minutos. Lamínulas Thermanox são removidos de cada bem e dip-lavados em PBS para remover bactérias solto. Se o total bactérias associadas (aderente e internalizadas) devem ser quantificados, lamínulas são então colocados em um poço fresco contendo 0,5% Triton X-100 em PBS. Pipetagem suave leva à completa lise das células e bactérias são enumerados por diluição seriada e plaqueamento em ágar. Se o número de bactérias que invadiram as células é necessário, lamínulas são adicionados aos poços contendo 500 mL meio de cultura de tecidos suplementado com gentamicina e incubação continuou por 1 h, que vai matar todas as bactérias externas. Lamínulas pode então ser lavada, as células lisadas e bactérias enumeradas por plaqueamento em ágar, conforme descrito acima. Se o experimento requer visualização direta, lamelas podem ser fixadas e coradas para microscopia de luz, fluorescência confocal ou ou preparados para microscopia eletrônica.

Um protocolo geral para o estudo da invasão das células do hospedeiro por um agente patogénico, com foco na<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; E células endoteliais humanas.

Invasão das células humanas por um agente patogénico

Aqui descreveremos como estudamos a invasão de células endoteliais humanas pelo patógeno bacteriano Staphylococcus aureus. O protocolo geral pode ser...

O objetivo geral deste experimento é medir a capacidade de cepas bacterianas invadirem células hospedeiras. Células hospedeiras em cultura são transferidas para lamínulas de vidro em uma placa de 24 poços e incubadas até atingirem confluência. Em seguida, as lamínulas são lavadas e transferidas para uma nova placa.Bactérias coletadas de um cultivo padrão em caldo são lavadas por centrifugação e então adicionadas ao cultivo de células hospedeiras. Após a invasão, as bactérias extracelulares são eliminadas usando gentamicina e as lamínulas são lavadas e transferidas para uma nova placa. Por fim, as células hospedeiras são lisadas e os lisados são semeados em placas de ágar para determinar o número de bactérias intracelulares.No final, podem ser obtidos resultados que demonstram a capacidade invasiva de bactérias específicas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da patogênese microbiana, como a forma pela qual a invasão bacteriana das células hospedeiras causa doenças. Também pode facilitar a identificação e caracterização de proteínas bacterianas envolvidas nas interações entre patógenos e hospedeiros.Este procedimento será demonstrado pelo Dr. Andrew Edwards, pós-doutorando de um laboratório. Para este ensaio, utilizamos células endoteliais humanas EAHY 926 cultivadas em frascos T75 a 37 graus Celsius. Colete as células assim que atinjam cerca de 95% de confluência.Lave as células com 10 mililitros de PBS para remover o meio de crescimento. Detaque as células incubando-as em solução de tripsina-EDTA por cinco minutos. Em seguida, transfira para um tubo cônico.Em seguida, centrifugue as células e o ressuspensão, e as suspenda em cerca de 25 mililitros de meio DMEM completo ou numa concentração de 1 milhão de células por mililitro, utilizando pinças estéreis. Coloque um lamínula térmico em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Certifique-se de posicionar o lado opaco do lamínula, no qual as células podem aderir, voltado para cima.Em seguida, adicione 500 microlitros de células a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por 48 horas ou até que as células tenham atingido confluência. Após a incubação, use pinças limpas para remover cuidadosamente cada lamínula e mergulhe-as em DMEM para remover proteínas secretadas solúveis. Transfira as lamínulas lavadas para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo 490 microlitros por poço de DMEM completo.Tendo o cuidado de manter a orientação das lamínas para que as células fiquem voltadas para cima. Prepare um cultivo de 10 mililitros de Staphylococcus aureus em caldo de infusão cerebral cardíaca. Transfira o cultivo bacteriano para um tubo cônico e centrifugue as bactérias a 5.000 × g durante 10 minutos.Uma vez que as células tenham sido pelotas, remova o sobrenadante e o Reese. Resuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM estéril para lavar as células, centrifugue as células mais uma vez e repita a lavagem três vezes. Resuspenda as bactérias em DMEM e meça a densidade óptica da suspensão.Ajuste a concentração para obter uma DO 600 de 1,0, o que corresponde a aproximadamente 10 elevado a nove unidades formadoras de colônias por mililitro. Uma vez que a suspensão bacteriana esteja pronta, adicione 10 microlitros de bactérias a cada poço da placa de 24 poços contendo lamínulas.Incube a placa a 37 graus Celsius por 15 a 90 minutos para permitir que as bactérias se liguem a e invadam as células. Após essa incubação, aspire o sobrenadante de cada poço contendo as bactérias não ligadas e substitua por DMEM com 10% de FBS, suplementado com gentamicina. Incube a placa a 37 graus Celsius por 60 minutos para eliminar as bactérias extracelulares.Após esta imersão de incubação, lave cada lamínula em DMEM três vezes para remover o antibiótico. Em seguida, transfira-as para uma nova placa de 24 poços contendo 500 microlitros de Triton X-100 0,5% em PBS por poço.Como anteriormente, tenha cuidado para manter o lado do lamínula com as células virado para cima; enxágue vigorosamente cada lamínula com a solução de Triton, pipetando o líquido para cima e para baixo diretamente sobre o lamínula, de modo a garantir que todas as células sejam lisadas e as bactérias intracelulares liberadas. Realize diluições seriadas do lisado para quantificar o número de bactérias infectantes. Colete o lisado e plaque diluições seriadas em placas de TSA.Unidades formadoras de colônias podem ser determinadas nestas placas após 24 horas de incubação a 37 graus Celsius. Este gráfico mostra o número de staphylococcus aureus selvagem ou deficientes na proteína de ligação à fibrina invadindo células endoteliais humanas em comparação com bactérias selvagens. Staphylococcus aureus deficientes em proteína de ligação à fibronectina apresentam significativa redução na capacidade de invadir células endoteliais.A complementação do mutante com um plasmídeo que codifica a proteína de ligação à fibronectina A, sem o domínio de ligação à fibronectina, não promoveu invasão. Em contraste, a complementação do mutante com um plasmídeo que codifica a proteína completa de ligação à fibronectina restaurou a invasão aos níveis do tipo selvagem. Neste experimento, demonstrou-se que *Lactococcus lactis* expressando a proteína de ligação à fibronectina é capaz de invadir células hospedeiras.Enquanto as bactérias que não expressavam a proteína não tinham a capacidade de aderir às células, a adesão foi a mesma para ambas as cepas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até três horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar bactérias e células hospedeiras para estudar a invasão celular.Você também deve ser capaz de identificar as etapas em que perguntas adicionais podem ser feitas para aumentar sua compreensão desse aspecto da doença.

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Research

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