In vivo Laser axotomia em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é cortar com precisão os neurônios de CL novamente com um laser in vivo. Isso é feito montando o sistema de taxotomia e focalizando, alinhando e ajustando com precisão a potência do laser. Quando os vermes são imobilizados em uma lâmina de microscópio, seus neurônios podem ser cortados com controle espacial e temporal preciso.

A extensão em que os neurônios cortados se regeneram é então medida pela pontuação dos cones de crescimento e/ou pelo rastreamento dos comprimentos dos neuritos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o laser de femtossegundo, é que o laser de pulso de microponto é um sistema econômico, fácil de configurar e manter e prontamente adaptável para uma ampla variedade de aplicações, embora normalmente apliquemos esse método para estudar a regeneração dos neurônios motores GABA. O sistema também pode ser usado para ablação de outros tipos de células, como pele, músculo ou sinapse neuronal específica.

Este método requer um sistema de laser de microponto. O laser é montado na porta de epifluorescência de um microscópio composto e inclui um único dicróico que corresponde ao fluoróforo nas células a serem cortadas, um gerador de pulso e um pedal para operar o laser. No mínimo, o microscópio deve ser equipado com uma objetiva de óleo 100 vezes 1,4 NA e uma objetiva quatro vezes.

Ter um estágio motorizado com operação por joystick e ser montado em uma mesa de ar para iluminação. Uma fonte de luz com guia de luz e um mecanismo de obturador é conectada ao laser de microponto. O mecanismo do obturador é útil para reduzir a intensidade da iluminação independentemente do laser.

Uma câmera conectada a um computador requer uma taxa de quadros de pelo menos 16 hertz e deve operar bem com luz reduzida. O computador requer software de imagem, como elementos da Nikon, para visualizar os neurônios, acionar a câmera e manipular o estágio motorizado. Quando totalmente montado, o usuário pode focar o microscópio com uma mão, mover a platina com a outra, ativar o laser com o pedal e ter uma visão clara da imagem na tela.

Cortar neurônios em um organismo do tamanho de um grão de areia pode ser um desafio. Para conseguir isso, o laser deve ser bem focado em todas as três dimensões. Comece focalizando o plano Z.

Empurre o filtro de densidade neutra ND 16 para atenuar o laser enquanto foca para uma focagem mais fina, empurrando os quatro filtros fluorescentes ND 16 e ND. Em seguida, defina o laser de microponto para um pulso com o interruptor girando para selecionar e, em seguida, mova a roda do filtro para o filtro de barreira de passagem longa apropriado. Agora coloque um slide espelhado no palco e concentre-se nos orifícios dentro dele usando a objetiva de quatro vezes e a luz transmitida.

Uma vez focado, adicione uma gota de óleo de imersão ao slide e concentre-se novamente nos orifícios com a objetiva de 100 vezes. Em seguida, use a alavanca de comutação de caminho óptico para abrir o obturador da câmera e abrir o obturador do laser. Se for preciso, o foco é difícil, reduza a intensidade da luz transmitida para que as bordas do orifício fiquem nítidas.

Para testar o foco, use o pedal para disparar o laser. Se o plano Z estiver focado corretamente, um pequeno orifício deve aparecer no espelho. Agora foque o microscópio ligeiramente acima do plano da lâmina espelhada e dispare o laser. Outra vez.

Isso deve fazer um buraco ainda menor do que o primeiro tiro ou não deixar nenhuma marca. Os mesmos resultados devem ser vistos ao focar abaixo do slide espelhado. No entanto, se um orifício maior for produzido, refoque o laser com o anel de foco na cabeça de ablação.

Por fim, verifique se o orifício ainda está alinhado corretamente com a mira na ocular. Com o uso consistente, o foco do plano Z raramente precisa ser ajustado. Para focar o laser no plano XY, faça outro furo no espelho e acesse o software nos elementos da Nikon.

Inicie o modo de captura ao vivo no menu de aquisição. Na barra de ferramentas de medida, selecione Editor de ROI, selecione a ferramenta de cruz dupla e arraste a cruz para alinhá-la com o centro do novo furo. Clique em salvar ROI e saia do editor para retomar a captura ao vivo.

Para manipular o palco com o mouse, ative a configuração XY do mouse. Agora o laser está focado. Redefina os filtros de densidade neutra para sua posição original e defina os pulsos de laser de um a 10 para uso futuro.

Primeiro, prepare uma solução de 3% de aros fundido em M nove e coloque aproximadamente cinco mililitros em um tubo de 50 mililitros. Coloque o tubo em banho-maria de 55 a 65 graus Celsius e guarde o restante para uso futuro. Agora use dois slides cobertos de rotulagem.

Cole um par de lâminas limpas e uma gota de agarose para fazer uma almofada onde as minhocas possam ser colocadas. Após 30 segundos, o aros terá congelado de três a cinco microlitros de esferas de poliestireno de 0,05 a 0,1 micrômetro na almofada em 10 minutos e organizará rapidamente de cinco a 10 vermes transgênicos nas contas com uma palheta de platina, para que seus neurônios marcados sejam facilmente visualizados. Para evitar danificar as minhocas, coloque cuidadosamente uma lamínula padrão nas minhocas.

Deslizando-o. A lâmina de minhoca agora está preparada para executar taxonomias. Usando a ocular, localize os vermes sob quatro vezes o foco de energia com a objetiva de 100 vezes, desligue a luz transmitida, ligue a fluorescência e mude o caminho óptico para a câmera.

Use o mouse para centralizar o neurônio na mira. Agora dispare o laser com o pedal. A quantidade certa de potência do laser cortará o neurônio em um ou dois pulsos.

Muita potência do laser causará danos periféricos ou abrirá um buraco no sem-fim para ajustar a potência do laser, mover a placa atenuadora. Se o laser ficar fraco, a posição da placa atenuadora pode ser ajustada para continuar cortando. No entanto, isso é provavelmente uma indicação de que o Kumar em quatro 40 na célula D do laser precisa ser substituído quando executado corretamente.

A taxotomia a laser produz uma pequena quebra no neurônio. Em certos casos, uma pequena cicatriz pode se formar ao redor do local da lesão. Praticamente entre um e três neurônios são cortados por animal, mas não há limite teórico.

Quando terminar, recupere as minhocas retirando a lamínula em um movimento direto para cima, tomando cuidado para que as minhocas permaneçam na almofada de rosa agrícola. Não deslize a lamínula da tampa para fora. Use uma pinça de ponta fina para cortar a almofada ao redor das minhocas.

Coloque a almofada em uma placa NGM recém-semeada contendo OP 50 e liberte os vermes com 10 microlitros de M nine estéril. Entre oito e 48 horas após a regeneração da exotomia pode ser avaliada para fazer isso, remonte os vermes saudáveis em três a cinco microlitros de esferas de poliestireno e visualize seus neurônios em neurônios cortados. Um coto neuronal distal ao local do corte permanecerá Ambos os cotos distal e proximal se retraem inicialmente após serem cortados, mas a regeneração é esperada a partir do coto proximal.

A regeneração pode ser pontuada para a formação de um cone de crescimento. Alternativamente, o comprimento do neurite pode ser rastreado e comparado normalmente entre 60 a 70% dos neurônios GABA formam favos de crescimento dentro de 24 horas após o corte. Se o laser não estiver cortando corretamente, é provável que o laser esteja fora de foco ou porque o corante na célula do corante precisa ser substituído.

Além disso, se você achar que os vermes estão se movendo, provavelmente é porque a almofada agros está muito úmida. Descobrimos que as almofadas precisam ser deixadas por aproximadamente 30 segundos antes que os vermes sejam colocados nelas para contornar esse problema. Além disso, você pode tentar usar microesferas de tamanho menor para imobilizar os vermes.

Finalmente, se você achar que os axônios têm uma aparência frisada, é provável que a almofada agros esteja muito seca. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o sistema de laser de microponto. Monte vermes para taxotomia, corte neurônios individuais e avalie a regeneração subsequente.