In vivo Laser axotomia em C. elegans

O objetivo geral deste procedimento é cortar com precisão os neurônios do CL com um laser in vivo. Isso é realizado montando o sistema de taxotomia e focando, alinhando e ajustando com exatidão a potência do laser. Quando os vermes são imobilizados em uma lâmina de microscópio, seus neurônios podem ser cortados com controle espacial e temporal preciso.

A extensão em que os neurônios seccionados se regeneram é então medida por meio da pontuação de cones de crescimento e/ou pelo rastreamento dos comprimentos dos neuritos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o laser de femtossegundo, é que o laser de pulso pontual micro é um sistema economicamente viável, fácil de configurar e manter, e prontamente adaptável para uma ampla variedade de aplicações, embora normalmente apliquemos este método para estudar a regeneração dos neurônios motores GABA. O sistema também pode ser usado para ablar outros tipos celulares, como músculo da pele ou sinapses neuronais específicas.

Este método requer um sistema a laser de micro ponto. O laser é montado na porta de fluorescência epidual de um microscópio composto e inclui um único dicroico compatível com o fluoróforo nas células a serem cortadas, um gerador de pulsos e um pedal para operar o laser. No mínimo, o microscópio deve ser equipado com uma objetiva de óleo de 100 vezes e 1,4 NA e uma objetiva de quatro vezes.

Deve possuir uma platina motorizada com operação por joystick e ser montada sobre uma mesa pneumática para iluminação. Uma fonte de luz com guia de luz e um mecanismo de obturador é conectada ao laser de micro ponto. O mecanismo de obturador é útil para reduzir a intensidade de iluminação independentemente do laser.

Uma câmera conectada a um computador exige uma taxa de quadros de pelo menos 16 hertz e deve funcionar bem em condições de pouca luz. O computador requer um software de imagem, como o Nikon Elements, para visualizar os neurônios, controlar a câmera e manipular a platina motorizada. Quando totalmente montado, o usuário pode focar o microscópio com uma mão, mover a platina com a outra, ativar o laser com o pedal do pé e ter uma visão clara da imagem na tela.

Cortar neurônios em um organismo do tamanho de um grão de areia pode ser desafiador. Para realizar isso, o laser deve ser fortemente focalizado nas três dimensões. Comece focalizando o plano Z.

Insira o filtro de densidade neutra ND 16 para atenuar o laser durante o foco, permitindo um ajuste mais preciso, inserindo tanto o ND 16 quanto os quatro filtros fluorescentes. Em seguida, configure o laser de ponto micro para um único pulso com a chave de seleção, e depois mova a roda de filtros para o filtro de passagem longa apropriado. Agora, coloque uma lâmina espelhada na platina e foque nos orifícios presentes nela utilizando a objetiva de quatro vezes e luz transmitida.

Uma vez focado, adicione uma gota de óleo de imersão à lâmina e refocuse nos orifícios com a objetiva de 100 vezes. Em seguida, use a alavanca de comutação do caminho óptico para abrir o obturador da câmera e abrir o obturador do laser. Se for difícil obter um foco preciso, reduza a intensidade da luz transmitida para que as bordas do orifício fiquem nítidas.

Para testar o foco, use o pedal para disparar o laser. Se o plano Z estiver corretamente focado, um pequeno orifício deverá aparecer no espelho. Agora, foque o microscópio ligeiramente acima do plano da lâmina espelhada e dispare o laser novamente.

Isso deve fazer um orifício ainda menor do que o primeiro disparo ou não deixar nenhuma marca. Os mesmos resultados devem ser observados ao focalizar abaixo da lâmina espelhada. No entanto, se um orifício maior for produzido, refocalize o laser com o anel de foco na cabeça de ablação.

Por fim, verifique se o orifício ainda está adequadamente alinhado com as retículas no ocular. Com uso consistente, raramente é necessário ajustar o foco no plano Z. Para focar o laser no plano XY, faça outro orifício no espelho e, em seguida, acesse o software no Nikon Elements.

Inicie o modo de captura ao vivo no menu de aquisição. Na barra de ferramentas de medição, selecione o editor de ROI, escolha a ferramenta de dupla cruz e arraste as linhas de mira para alinhá-las com o centro do novo orifício. Clique em salvar ROI e, em seguida, saia do editor para retomar a captura ao vivo.

Para manipular a platina com o mouse, ative a configuração do mouse XY. Agora o laser está focado. Reponha os filtros de densidade neutra em sua posição original e configure os pulsos do laser de um a 10 para uso futuro.

Primeiro, prepare uma solução de 3% de aros fundido em solução M nove e transfira aproximadamente cinco mililitros para um tubo de 50 mililitros. Coloque o tubo em banho-maria a 55 a 65 graus Celsius e armazene o restante para uso futuro. Agora, utilize duas lâminas cobertas com rotulagem.

Fixe com fita um par de lâminas limpas e uma gota de agarose para fazer uma almofada onde os vermes possam ser colocados. Após 30 segundos, quando a agarose tiver solidificado, pipete três a cinco microlitros de microesferas de poliestireno de 0,05 a 0,1 micrômetro sobre a almofada dentro de 10 minutos e organize rapidamente cinco a dez vermes transgênicos sobre as microesferas com uma alça de platina, de modo que seus neurônios marcados possam ser facilmente visualizados. Para evitar danificar os vermes, posicione cuidadosamente uma lamínula padrão sobre os vermes.

Movendo-o ao redor. A lâmina com o verme está agora pronta para a realização de taxonomias. Usando a ocular, localize os vermes com aumento de quatro vezes, refocalize com a objetiva de 100 vezes, desligue a luz transmitida, ligue a fluorescência e comute o caminho óptico para a câmera.

Use o mouse para centralizar o neurônio sobre as miras. Agora dispare o laser com o pedal. A quantidade correta de potência do laser seccionará o neurônio em um ou dois pulsos.

Uma potência de laser excessiva causará danos periféricos ou perfurará um buraco no verme; para ajustar a potência do laser, mova a placa atenuadora. Se o laser ficar fraco, a posição da placa atenuadora pode ser ajustada para manter o corte. No entanto, isso provavelmente indica que o Kumar em quatro 40 na célula D do laser precisa ser substituído quando realizado corretamente.

A taxotomia a laser produz uma pequena ruptura no neurônio. Em certos casos, uma pequena cicatriz pode se formar ao redor do local da lesão. Na prática, de um a três neurônios são cortados por animal, mas não há limite teórico.

Quando terminar, recupere os vermes removendo a lamínula com um movimento direto para cima, tomando cuidado para que os vermes permaneçam sobre o disco de ágar-rosa. Não deslize a lamínula. Use pinça de ponta fina para recortar o disco ao redor dos vermes.

Coloque o pad em uma placa NGM recém-semeada contendo OP50 e libere os vermes com 10 microlitros de M nove estéril. Entre oito e 48 horas após a regeneração por exotomia, pode-se avaliar esse processo remontando os vermes saudáveis em três a cinco microlitros de microesferas de poliestireno e visualizando seus neurônios em neurônios seccionados. Um coto neuronal distal ao local do corte permanecerá. Inicialmente, tanto os cotos distal quanto proximal retrair-se-ão após o corte, mas espera-se que a regeneração ocorra a partir do coto proximal.

A regeneração pode ser avaliada pela formação de um cone de crescimento. Alternativamente, o comprimento dos neuritos pode ser traçado e comparado; normalmente, entre 60 a 70% dos neurônios GABA formam cones de crescimento dentro de 24 horas após o corte. Se o laser não estiver cortando corretamente, isso provavelmente ocorre porque o laser está desfocado ou porque o corante na célula de corante precisa ser substituído.

Além disso, se você notar que os vermes estão se movimentando, isso provavelmente ocorre porque o suporte de ágar está muito úmido. Verificamos que é necessário deixar os suportes descansando por aproximadamente 30 segundos antes de colocar os vermes sobre eles para evitar esse problema. Além disso, você pode tentar usar microesferas de tamanho menor para imobilizar os vermes.

Por fim, se você observar que os axônios apresentam aparência de contas, é provável que isso ocorra porque o suporte de agar está muito seco. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como configurar o sistema a laser de micro ponto. Montar vermes para taxotomia, cortar neurônios individuais e avaliar a regeneração subsequente.