Name: Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster através de injeção de insulina e extração de hemolinfa. Este método utiliza espectrometria para avaliar o clearance de glicose e auxilia no estudo de distúrbios metabólicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por concessões do NIA para YW.CF (AG21068, AG31086).

1. Preparação da solução de insulina <ol><li> Preparar a solução de insulina bovina fresca pela dissolução de insulina em PBS para atingir a concentração de 0,01 mg / ml. Tanto a insulina / PBS e soluções de controle PBS deve ser mantido no gelo durante todo o procedimento de injeção. Estas soluções devem ser preparadas com 0,5% (v / v) FD &amp; C no Blue. Um corante alimentar. </li></ol> 2. Preparação da agulha e injeção de Set-up <ol><li> Prepare agulhas capilar de vidro usando uma micropipeta puller.The seguintes configurações extrator produzir agulhas de qualidade suficiente para injecção: Calor, 345; Pull, 210; velocidade, 100; Time, 200 (100ms). Agulhas acabada de tirar deve ser anulado pela pressionar a ponta através de um tecido Kimwipe. Este processo remove embotamento da ponta alongada de alta resistência e produz uma ponta stouter com um diâmetro maior dos poros. </li><li> Lugar agulhas blunted ponta-up em um tubo de microcentrífuga contendo a insulina / PBS PBS solução ou sozinho. Capilar ação resulta em back-preenchimento de cada agulha. Observe a ponta da agulha sob um estereomicroscópio para garantir que nenhuma bolha de ar detritos ou aparecem na ponta. Descartar qualquer agulhas que não preencher de forma limpa. </li><li> Inserir agulhas cheias no suporte manual da agulha microinjetor e posicione o suporte da agulha com um micromanipulador de modo que a ponta da agulha é visível através de um estereomicroscópio. Aplique uma pressão positiva sobre a coluna de fluido na agulha girando o botão micrômetro manual de microinjetor ligado ao êmbolo da seringa microinjetor. </li><li> Verifique se pressão suficiente para o deslocamento de fluidos foi aplicada por tocar um Kimwipe para a ponta da agulha e confirmando o fluxo de fluido. </li><li> Uma vez que a agulha foi preparado para injeção, apor um gráfico de calibração para o eixo da agulha com fita adesiva transparente, e trazer a ponta da agulha em foco através de um microscópio estereoscópico com 20X de ampliação. </li></ol> 3. Fly Preparação <ol><li> Dez dias de idade moscas fêmeas são usados ​​para experimentos de injeção. Coletar moscas dentro de 24 h da eclosão. Anestesiar voa com CO 2 umidificado em uma almofada de gás, classificar para fora homens e moscas lugar feminino em frascos contendo dieta padrão ou tratamento. Manter as moscas fêmeas em dietas experimentais durante 10 dias. </li><li> No décimo dia após a eclosão e separação para dietas experimentais, a transferência de moscas de seu alimento contendo frascos para frascos contendo um plugue de 5 ml de agar 2% e privá-los por 12-16 h. </li><li> Transferência de moscas fome para frascos contendo filtros de glicose a 10% embebido por 1 hora antes da injeção de insulina. </li><li> Brevemente anestesiar as moscas com CO 2 umidificado após a ingestão de glicose e, em seguida imobilizá-los frio no gelo. </li></ol> 4. Procedimento de injeção <ol><li> Gentilmente segure uma mosca frio imobilizado com uma pinça fina e segurá-la perto da ponta da agulha para que a dica é adjacente à região anterior do lado esquerdo do tórax da mosca. Trazer tanto a ponta da agulha e do tórax da mosca em foco sob o estereomicroscópio. </li><li> Suavemente mova a voar em direção a ponta da agulha de modo que a ponta da agulha toca o centro da protuberância da região prescutum esquerdo do tórax da mosca (Fig. 1). Uma vez que a mosca é corretamente orientados e alinhados com a ponta da agulha, continuar a promover a voar para a agulha de modo que a agulha espeta o centro do prescutum. </li><li> Aplicar pressão positiva, conforme necessário, avançando o êmbolo da seringa com o botão do micromanipulador microinjetor de até 0,1 mL de fluido foi injetado na mosca. O fluxo de fluido em hemocele da mosca dará uma cor azul para o lado esquerdo do tórax anterior. Ocasionalmente é preciso retirar e avançar várias vezes para retirar qualquer bloqueio ponta da agulha e permitir o fluxo de fluido. </li><li> Permitir que voa injetado para recuperar em frascos de agar 2% para os pontos de tempo designados antes da extração hemolinfa. </li></ol> 5. Coleta de hemolinfa <ol><li> Brevemente anestesiar voa com CO 2 no umidificado desejado pontos após a injecção tempo e posição de cada lado da dorsal fly-down em fita dupla face afixada à superfície de um bloco de CO 2. Organizar voa no mesmo linhas com cápsulas cabeça alinhada. Pode-se usar uma vara de madeira recortada aplicador para pressionar as asas para a fita adesiva e garantir a imobilização. </li><li> Uma vez que as moscas são fixos para a fita, segure proboscis cada mosca com uma pinça fina e puxe-o cuidadosamente para a região ventral e posterior da mosca de modo que a frente da cápsula cefálica é visível através do microscópio estéreo. </li><li> Com a outra mão e, segurando a tromba na posição, fure o centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal usando uma agulha de tungstênio afiadas (Fig. 2). É preciso ter cuidado para não inserir a agulha muito longe, pois é fácil dar um soco na ponta da agulha através do outro lado da cápsula cefálica e, posteriormente, perder control do fluxo de hemolinfa. Punção todas as moscas em um grupo de injeção antes de coletar hemolinfa. </li><li> Uma vez que a cápsula cefálica foi perfurado, use uma vara de madeira para aplicador aparadas aplique uma pressão suave abdômen da mosca. Pode ser útil para rolar a voar por cima de modo que repousa sobre o seu lado ventral como você aplicar pressão. Este procedimento irá produzir uma gota de hemolinfa a partir do sítio de punção cabeça cápsula. </li><li> Toque em uma extremidade de um tubo 1μl microcapilar para a gota de hemolinfa emergindo do local da punção cabeça cápsula. A hemolinfa entra no tubo através de uma acção capilar. Determinar e registrar a quantidade de hemolinfa coletadas, verificando a coluna de fluido no interior do tubo microcapilar contra um gráfico de volume graduado. </li></ol> 6. Determinação de glicose hemolinfa <ol><li> Eject amostras hemolinfa em poços contendo 100 ul do Infinito Reagente glicose. Manter placa no gelo durante o carregamento de amostras de hemolinfa. </li><li> Estabelecer uma curva padrão de carga separadamente cada 1 ml das soluções de reserva de glicose a 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM e 3.125mM. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C por 10 minutos. </li><li> Detectar absorvância a 340 nm. </li><li> Conta do volume de hemolinfa coletadas e determinar a concentração de glicose da amostra com base na curva padrão com concentrações de glicose conhecido. </li></ol> 7. Resultados representante Uma resposta típica de tolerância à insulina é detectado em insulina injetada moscas, onde uma queda nos níveis circulantes de glicose é detectado 15 minutos após a injecção. Em contraste, essa resposta não é visto em moscas PBS injetado (Fig. 3). Esta resposta na eliminação de glicose periférica continua em insulina injetada-moscas até 30 minutos após a injecção. Rotineiramente extrair 0,2-0,5 mL de hemolinfa por 4-5 moscas em cada grupo de injeção. Três grupos de injeção estão incluídos em cada experimento. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lado esquerdo do tórax, mostrando Drosophila local da agulha de inserção (Modificado de Demerec, 1950) 7. Inserir a agulha através do centro da prescutum na região, anterior dorsal do lado esquerdo do tórax. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Vista frontal de Drosophila cabeça mostrando o local da punção por extração de hemolinfa (Modificado de Demerec, 1950) 7. Punção da cápsula cabeça com uma sonda de tungstênio finamente afiada no centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A resposta de tolerância à insulina típica detectada em adultos controle de moscas. Moscas controle w 1118 foram injetados com insulina bovina (1 ng em PBS) ou PBS apenas. Moscas em grupos replicar foram então autorizados a recuperar de 0, 15 ou 30 minutos e os níveis de glicose circulante foram medidos.

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica descrita neste relatório é potencialmente útil em qualquer estudo que investiga os processos fisiológicos, resultando em alterações detectáveis ​​em Drosophila composição hemolinfa. Ao combinar a injeção e coleta de hemolinfa desta forma, é possível verificar os efeitos imediatos fisiologicamente relevantes de um determinado tratamento experimental ou manipulação. A principal vantagem desta &quot;sangria&quot; técnica na coleta de hemolinfa em relação às técnicas anteriores envolvendo decapitação <sup...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> Infinito Reagente glicose </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> Manual microinjetor </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td></tr><tr><td> P-87 Flamming / Brown micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td></tr><tr><td> Único vidro de borosilicato barril capilar </td><td> Sistemas de AM </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C Azul No. 1 </td><td> McCormick &amp; Company </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml tubos microcapilar </td><td> Drummond </td><td></td></tr><tr><td> Três eixos micromanipulador manual e base de </td><td> Precision Instruments mundo </td><td></td></tr></tbody></table>

injeção de insulina e extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos drosophila melanogaster</em

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conservado nutrientes mecanismos de detecção existem entre mamíferos e mosca das frutas, onde os peptídeos semelhante à insulina e glucagon mamíferos, respectivamente a função de manter a homeostase da glicose durante o desenvolvimento 1,2 estágios larval. Estudos sobre moscas em grande parte pós-mitóticas adultos revelaram perturbação da homeostase da glicose como o resultado da ablação genética de insulin-like peptide (ILP), produzindo células (IPCs) 3. Assim, as moscas de fruta adultos são uma grande promessa como um sistema modelo adequado genética para doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para aprofundar o sistema de mosca da fruta, comparável ensaios fisiológicos usados ​​para medir a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina em mamíferos deve ser estabelecida. Para este fim, temos recentemente descrito um procedimento novo para medir a resposta de tolerância oral à glicose na mosca adulta e demonstraram a importância de IPCs adulto na manutenção da homeostase da glicose 4,5. Aqui, temos um procedimento modificado descrito anteriormente para a injeção de insulina 6 e isso combinado com um novo método de extração hemolinfa para medir a sensibilidade periférica à insulina na mosca adulta. Excepcionalmente, o nosso protocolo permite medições fisiológicas direta da capacidade da mosca adulta de dispor de uma carga de glicose periférica após a injeção de insulina, uma metodologia que viabiliza a caracterizar mutantes sinalizadora de insulina e intervenções potenciais que afetam a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina na mosca adulta.

Sinalização da insulina conservada caminhos encontrados na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fazer este organismo uma ferramenta potencial para a modelagem de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para este fim, é fundamental para estabelecer ensaios fisiológicos para medir efetivamente a ação da insulina sistêmica na eliminação de glicose periférica na mosca adulta.

Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster</em

Mecanismos conservados de detecção de nutrientes existem entre mamíferos e a mosca-das-frutas, nos quais peptídeos semelhantes à insulina e ao glucagon de mamíferos, respectivamente, funcionam...

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos da insulina injetada sobre os níveis de glicose no hemolinfa de drosófilas adultas de *Drosophila melanogaster*. Isso é realizado primeiramente permitindo que moscas em jejum ingiram uma solução concentrada de glicose. O segundo passo do procedimento consiste em injetar insulina em moscas previamente alimentadas com glicose.O terceiro passo do procedimento é coletar uma amostra de hemolinfa não contaminada. O passo final do procedimento é determinar a concentração de glicose na hemolinfa. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram que a insulina exógena facilita a eliminação da glicose em Esof la Melan gaster por meio da espectrometria.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a sangria por decapitação de adultos, é que este procedimento minimiza o conteúdo intestinal. Contaminação da amostra de hemolinfa Colete as moscas dentro de 24 horas após oclusão, anestesiando-as com dióxido de carbono umidificado. Separe as moscas fêmeas e coloque-as em frascos contendo dieta padrão.Deixe as moscas envelhecerem por 10 dias. Após 10 dias, transfira as moscas para frascos contendo um tampão

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Este vídeo descreve como realizar uma injeção de moscas adultas vivas e inclui um protocolo de exemplo no qual partículas marcadas e azul de tripano são injetadas no abdômen da mosca para testar a fagocitose.

Injeção de moscas adultas de Drosophila: um método de administração de compostos ou rótulos

A hemolinfa da Drosophila serve como sangue e fluido intersticial, circulando por todo o corpo durante os estágios larva e adulto. Este vídeo descreve um protocolo de coleta de hemolinfa larval para quantificar as células circulantes.

Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

Este artigo descreve um método para a medição da oxidação de combustível em Drosophila melanogaster, no qual vestígios de substratos metabólicos radiomarcados específicos são alimentados às moscas. O CO2 radiomarcado exalado que é produzido a partir da oxidação do combustível é coletado e medido.

Medição da produção de dióxido de carbono da Radiolabeled Substratos em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O ensaio CApillary FEeder (CAFE) é um método simples, econômico e altamente confiável para investigar os mecanismos subjacentes à ingestão de alimentos. Usado com o organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, ele fornece um meio poderoso de obter novos insights sobre os mecanismos regulatórios da ingestão de alimentos.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

Este artigo descreve um protocolo para a ex vivo cálcio imagem latente do cérebro drosófila . Neste método, compostos naturais ou sintéticos podem ser aplicados para o buffer para testar sua capacidade de ativar neurônios particulares do cérebro.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

A integridade da barreira hematoencefálica é fundamental para a função do sistema nervoso. Na Drosophila melanogaster, a barreira hematoencefálica é formada por células gliais durante a embriogênese tardia. Este protocolo descreve métodos para o ensaio para a formação e a manutenção da barreira do sangue-cérebro em embriões do melanogaster do D. e em larvas do terceiro instar.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.

Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas

Aprenda a medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster através de injeção de insulina e extração de hemolinfa. Este método utiliza espectrometria para avaliar o clearance de glicose e auxilia no estudo de distúrbios metabólicos.

Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster

Explorar mais vídeos