Name: Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Aprenda a medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster através de injeção de insulina e extração de hemolinfa. Este método utiliza espectrometria para avaliar o clearance de glicose e auxilia no estudo de distúrbios metabólicos.

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Este trabalho foi financiado por concessões do NIA para YW.CF (AG21068, AG31086).

1. Preparação da solução de insulina <ol><li> Preparar a solução de insulina bovina fresca pela dissolução de insulina em PBS para atingir a concentração de 0,01 mg / ml. Tanto a insulina / PBS e soluções de controle PBS deve ser mantido no gelo durante todo o procedimento de injeção. Estas soluções devem ser preparadas com 0,5% (v / v) FD &amp; C no Blue. Um corante alimentar. </li></ol> 2. Preparação da agulha e injeção de Set-up <ol><li> Prepare agulhas capilar de vidro usando uma micropipeta puller.The seguintes configurações extrator produzir agulhas de qualidade suficiente para injecção: Calor, 345; Pull, 210; velocidade, 100; Time, 200 (100ms). Agulhas acabada de tirar deve ser anulado pela pressionar a ponta através de um tecido Kimwipe. Este processo remove embotamento da ponta alongada de alta resistência e produz uma ponta stouter com um diâmetro maior dos poros. </li><li> Lugar agulhas blunted ponta-up em um tubo de microcentrífuga contendo a insulina / PBS PBS solução ou sozinho. Capilar ação resulta em back-preenchimento de cada agulha. Observe a ponta da agulha sob um estereomicroscópio para garantir que nenhuma bolha de ar detritos ou aparecem na ponta. Descartar qualquer agulhas que não preencher de forma limpa. </li><li> Inserir agulhas cheias no suporte manual da agulha microinjetor e posicione o suporte da agulha com um micromanipulador de modo que a ponta da agulha é visível através de um estereomicroscópio. Aplique uma pressão positiva sobre a coluna de fluido na agulha girando o botão micrômetro manual de microinjetor ligado ao êmbolo da seringa microinjetor. </li><li> Verifique se pressão suficiente para o deslocamento de fluidos foi aplicada por tocar um Kimwipe para a ponta da agulha e confirmando o fluxo de fluido. </li><li> Uma vez que a agulha foi preparado para injeção, apor um gráfico de calibração para o eixo da agulha com fita adesiva transparente, e trazer a ponta da agulha em foco através de um microscópio estereoscópico com 20X de ampliação. </li></ol> 3. Fly Preparação <ol><li> Dez dias de idade moscas fêmeas são usados ​​para experimentos de injeção. Coletar moscas dentro de 24 h da eclosão. Anestesiar voa com CO 2 umidificado em uma almofada de gás, classificar para fora homens e moscas lugar feminino em frascos contendo dieta padrão ou tratamento. Manter as moscas fêmeas em dietas experimentais durante 10 dias. </li><li> No décimo dia após a eclosão e separação para dietas experimentais, a transferência de moscas de seu alimento contendo frascos para frascos contendo um plugue de 5 ml de agar 2% e privá-los por 12-16 h. </li><li> Transferência de moscas fome para frascos contendo filtros de glicose a 10% embebido por 1 hora antes da injeção de insulina. </li><li> Brevemente anestesiar as moscas com CO 2 umidificado após a ingestão de glicose e, em seguida imobilizá-los frio no gelo. </li></ol> 4. Procedimento de injeção <ol><li> Gentilmente segure uma mosca frio imobilizado com uma pinça fina e segurá-la perto da ponta da agulha para que a dica é adjacente à região anterior do lado esquerdo do tórax da mosca. Trazer tanto a ponta da agulha e do tórax da mosca em foco sob o estereomicroscópio. </li><li> Suavemente mova a voar em direção a ponta da agulha de modo que a ponta da agulha toca o centro da protuberância da região prescutum esquerdo do tórax da mosca (Fig. 1). Uma vez que a mosca é corretamente orientados e alinhados com a ponta da agulha, continuar a promover a voar para a agulha de modo que a agulha espeta o centro do prescutum. </li><li> Aplicar pressão positiva, conforme necessário, avançando o êmbolo da seringa com o botão do micromanipulador microinjetor de até 0,1 mL de fluido foi injetado na mosca. O fluxo de fluido em hemocele da mosca dará uma cor azul para o lado esquerdo do tórax anterior. Ocasionalmente é preciso retirar e avançar várias vezes para retirar qualquer bloqueio ponta da agulha e permitir o fluxo de fluido. </li><li> Permitir que voa injetado para recuperar em frascos de agar 2% para os pontos de tempo designados antes da extração hemolinfa. </li></ol> 5. Coleta de hemolinfa <ol><li> Brevemente anestesiar voa com CO 2 no umidificado desejado pontos após a injecção tempo e posição de cada lado da dorsal fly-down em fita dupla face afixada à superfície de um bloco de CO 2. Organizar voa no mesmo linhas com cápsulas cabeça alinhada. Pode-se usar uma vara de madeira recortada aplicador para pressionar as asas para a fita adesiva e garantir a imobilização. </li><li> Uma vez que as moscas são fixos para a fita, segure proboscis cada mosca com uma pinça fina e puxe-o cuidadosamente para a região ventral e posterior da mosca de modo que a frente da cápsula cefálica é visível através do microscópio estéreo. </li><li> Com a outra mão e, segurando a tromba na posição, fure o centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal usando uma agulha de tungstênio afiadas (Fig. 2). É preciso ter cuidado para não inserir a agulha muito longe, pois é fácil dar um soco na ponta da agulha através do outro lado da cápsula cefálica e, posteriormente, perder control do fluxo de hemolinfa. Punção todas as moscas em um grupo de injeção antes de coletar hemolinfa. </li><li> Uma vez que a cápsula cefálica foi perfurado, use uma vara de madeira para aplicador aparadas aplique uma pressão suave abdômen da mosca. Pode ser útil para rolar a voar por cima de modo que repousa sobre o seu lado ventral como você aplicar pressão. Este procedimento irá produzir uma gota de hemolinfa a partir do sítio de punção cabeça cápsula. </li><li> Toque em uma extremidade de um tubo 1μl microcapilar para a gota de hemolinfa emergindo do local da punção cabeça cápsula. A hemolinfa entra no tubo através de uma acção capilar. Determinar e registrar a quantidade de hemolinfa coletadas, verificando a coluna de fluido no interior do tubo microcapilar contra um gráfico de volume graduado. </li></ol> 6. Determinação de glicose hemolinfa <ol><li> Eject amostras hemolinfa em poços contendo 100 ul do Infinito Reagente glicose. Manter placa no gelo durante o carregamento de amostras de hemolinfa. </li><li> Estabelecer uma curva padrão de carga separadamente cada 1 ml das soluções de reserva de glicose a 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM e 3.125mM. </li><li> Incubar as amostras a 37 ° C por 10 minutos. </li><li> Detectar absorvância a 340 nm. </li><li> Conta do volume de hemolinfa coletadas e determinar a concentração de glicose da amostra com base na curva padrão com concentrações de glicose conhecido. </li></ol> 7. Resultados representante Uma resposta típica de tolerância à insulina é detectado em insulina injetada moscas, onde uma queda nos níveis circulantes de glicose é detectado 15 minutos após a injecção. Em contraste, essa resposta não é visto em moscas PBS injetado (Fig. 3). Esta resposta na eliminação de glicose periférica continua em insulina injetada-moscas até 30 minutos após a injecção. Rotineiramente extrair 0,2-0,5 mL de hemolinfa por 4-5 moscas em cada grupo de injeção. Três grupos de injeção estão incluídos em cada experimento. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lado esquerdo do tórax, mostrando Drosophila local da agulha de inserção (Modificado de Demerec, 1950) 7. Inserir a agulha através do centro da prescutum na região, anterior dorsal do lado esquerdo do tórax. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Vista frontal de Drosophila cabeça mostrando o local da punção por extração de hemolinfa (Modificado de Demerec, 1950) 7. Punção da cápsula cabeça com uma sonda de tungstênio finamente afiada no centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A resposta de tolerância à insulina típica detectada em adultos controle de moscas. Moscas controle w 1118 foram injetados com insulina bovina (1 ng em PBS) ou PBS apenas. Moscas em grupos replicar foram então autorizados a recuperar de 0, 15 ou 30 minutos e os níveis de glicose circulante foram medidos.

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica descrita neste relatório é potencialmente útil em qualquer estudo que investiga os processos fisiológicos, resultando em alterações detectáveis ​​em Drosophila composição hemolinfa. Ao combinar a injeção e coleta de hemolinfa desta forma, é possível verificar os efeitos imediatos fisiologicamente relevantes de um determinado tratamento experimental ou manipulação. A principal vantagem desta &quot;sangria&quot; técnica na coleta de hemolinfa em relação às técnicas anteriores envolvendo decapitação <sup...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> Infinito Reagente glicose </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> Manual microinjetor </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td></tr><tr><td> P-87 Flamming / Brown micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td></tr><tr><td> Único vidro de borosilicato barril capilar </td><td> Sistemas de AM </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C Azul No. 1 </td><td> McCormick &amp; Company </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml tubos microcapilar </td><td> Drummond </td><td></td></tr><tr><td> Três eixos micromanipulador manual e base de </td><td> Precision Instruments mundo </td><td></td></tr></tbody></table>

injeção de insulina e extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos drosophila melanogaster</em

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conservado nutrientes mecanismos de detecção existem entre mamíferos e mosca das frutas, onde os peptídeos semelhante à insulina e glucagon mamíferos, respectivamente a função de manter a homeostase da glicose durante o desenvolvimento 1,2 estágios larval. Estudos sobre moscas em grande parte pós-mitóticas adultos revelaram perturbação da homeostase da glicose como o resultado da ablação genética de insulin-like peptide (ILP), produzindo células (IPCs) 3. Assim, as moscas de fruta adultos são uma grande promessa como um sistema modelo adequado genética para doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para aprofundar o sistema de mosca da fruta, comparável ensaios fisiológicos usados ​​para medir a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina em mamíferos deve ser estabelecida. Para este fim, temos recentemente descrito um procedimento novo para medir a resposta de tolerância oral à glicose na mosca adulta e demonstraram a importância de IPCs adulto na manutenção da homeostase da glicose 4,5. Aqui, temos um procedimento modificado descrito anteriormente para a injeção de insulina 6 e isso combinado com um novo método de extração hemolinfa para medir a sensibilidade periférica à insulina na mosca adulta. Excepcionalmente, o nosso protocolo permite medições fisiológicas direta da capacidade da mosca adulta de dispor de uma carga de glicose periférica após a injeção de insulina, uma metodologia que viabiliza a caracterizar mutantes sinalizadora de insulina e intervenções potenciais que afetam a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina na mosca adulta.

Sinalização da insulina conservada caminhos encontrados na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fazer este organismo uma ferramenta potencial para a modelagem de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para este fim, é fundamental para estabelecer ensaios fisiológicos para medir efetivamente a ação da insulina sistêmica na eliminação de glicose periférica na mosca adulta.

Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster</em

Mecanismos conservados de detecção de nutrientes existem entre mamíferos e a mosca-das-frutas, nos quais peptídeos semelhantes à insulina e ao glucagon de mamíferos, respectivamente, funcionam...

O objetivo geral deste procedimento é medir os efeitos da insulina injetada sobre os níveis de glicose no hemolinfa de drosófilas adultas de *Drosophila melanogaster*. Isso é realizado primeiramente permitindo que moscas em jejum ingiram uma solução concentrada de glicose. O segundo passo do procedimento consiste em injetar insulina em moscas previamente alimentadas com glicose.O terceiro passo do procedimento é coletar uma amostra de hemolinfa não contaminada. O passo final do procedimento é determinar a concentração de glicose na hemolinfa. Em última análise, podem-se obter resultados que demonstram que a insulina exógena facilita a eliminação da glicose em Esof la Melan gaster por meio da espectrometria.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a sangria por decapitação de adultos, é que este procedimento minimiza o conteúdo intestinal. Contaminação da amostra de hemolinfa Colete as moscas dentro de 24 horas após oclusão, anestesiando-as com dióxido de carbono umidificado. Separe as moscas fêmeas e coloque-as em frascos contendo dieta padrão.Deixe as moscas envelhecerem por 10 dias. Após 10 dias, transfira as moscas para frascos contendo um tampão de 5 mililitros de aros a 2% e as prive de alimento por 12 a 16 horas. Transfira as moscas em jejum para frascos contendo papel de filtro embebido em glicose a 10% por uma hora antes da injeção de insulina; para preparar a solução de insulina para injeção, dissolva insulina bovina em solução salina tamponada com fosfato até uma concentração final de 0,01 miligramas por mililitro.Prepare também uma solução controle contendo apenas PBS. Adicione corante alimentício azul às soluções de insulina e controle até uma concentração final de 0,5% e mantenha ambas as soluções em gelo durante todo o procedimento. Embotar as pontas das agulhas de vidro recém-puxadas pressionando-as através de um lenço de papel Kim.Para criar uma ponta resistente com um diâmetro de poro maior, coloque a ponta rombuda da agulha voltada para cima em um tubo de microcentrífuga contendo a solução de insulina ou a solução controle e permita que a ação capilar preencha o interior das agulhas. Verifique a presença de bolhas em cada agulha sob um microscópio estereoscópico e descarte aquelas que não foram preenchidas uniformemente. Insira as agulhas preenchidas no porta-agulhas do microinjetor manual e posicione o porta-agulhas com um micromanipulador para que a ponta da agulha seja visível através do microscópio estereoscópico.Aplicar pressão positiva na coluna de fluido na agulha girando o botão micrométrico acoplado ao êmbolo da seringa microinjetora. Tocar um lenço químico na ponta da agulha para verificar pressão suficiente para o fluxo de fluido. Uma vez que a agulha tenha sido preparada para injeção, fixe uma tabela de calibração ao corpo da agulha com fita transparente e coloque a ponta da agulha em foco através de um microscópio estereoscópico com ampliação de 20 x.Anestesie brevemente as moscas alimentadas com glicose com dióxido de carbono umidificado e coloque-as sobre uma almofada com gelo para manter a anestesia ao microscópio estereoscópico. Pegue uma mosca com um par de pinças finas e segure-a próxima à agulha, de modo que a ponta fique adjacente à região anterior do lado esquerdo da mosca. No tórax, coloque ao mesmo tempo a ponta da agulha e o tórax da mosca em foco.Mova suavemente a mosca em direção à ponta da agulha, de modo que a ponta toque o centro da protuberância da região presumida esquerda da mosca. Continue avançando o tórax da mosca sobre a agulha para que esta atravesse o centro do presum. Aplique pressão positiva avançando o êmbolo da seringa com o botão do micromanipulador do microinjetor até 0,1.Um microlitro da solução de insulina ou da solução controle foi injetado na mosca. A injeção conferirá uma coloração azul ao lado esquerdo do tórax anterior. Deixe as moscas injetadas se recuperarem em grupos replicados em placas com 2% de ágar por períodos de zero, 15 e 30 minutos antes da extração do hemolinfa e fixe um pedaço de fita dupla face no suporte de dióxido de carbono por esse tempo.Anestesie os drosófilas do grupo zero e organize-os sobre a fita com o lado dorsal voltado para baixo, em fileiras regulares, alinhando suas cápsulas cefálicas. Uma vez que as moscas estejam fixadas à fita, segure o probóscide de uma mosca com pinça fina e puxe-o suavemente em direção à região ventral e depois posterior, de modo que a parte frontal da cápsula cefálica fique visível. Enquanto mantém o probóscide na posição, perfure a cápsula cefálica acima da sutura lenal usando uma agulha de tungstênio afiada, tomando cuidado para não atravessar completamente a cabeça.Após perfurar todas as moscas, use um palito de madeira aparado para aplicar pressão suave sobre o abdômen da mosca. Isso produzirá uma pequena gota de hemolinfa no local da perfuração da cápsula cefálica. Toque a extremidade de um tubo capilar micro de um microlitro na gota de hemolinfa.Determine e registre a quantidade de hemolinfa coletada verificando a coluna de fluido no interior do tubo capilar contra um gráfico de volume graduado; utilizando um espectrofotômetro, detecte a absorbância em 340 nanômetros e determine a concentração de glicose. As moscas injetadas com a solução de insulina bovina apresentaram níveis reduzidos de glicose na hemolinfa nos pontos temporais de 15 e 30 minutos após a injeção, em relação às moscas injetadas com a solução controle. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar pequenos volumes de solução em drosófilas adultas, como extrair hemolinfa de drosófilas adultas e como determinar a concentração de glicose na hemolinfa de drosófilas adultas seguindo este procedimento.Outros experimentos, como a concentração de proteínas, sua determinação e a determinação da concentração de triglicerídeos em hemolinfa, podem ser realizados para responder perguntas como: como a insulina afeta aspectos relacionados ao metabolismo de nutrientes em drosófila adulta?

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