Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Este procedimento demonstra como medir a força da coesão intracelular em tecidos tridimensionais, como agregados. O primeiro passo é gerar agregados esféricos semelhantes a tecidos e transferi-los para uma placa de Petri contendo meio de cultura tecidual. Em seguida, agregados individuais são aspirados em uma pipeta de pasta e carregados na placa inferior de compressão da câmara do tensiômetro.

Em seguida, a placa superior de compressão é conectada a um fio de níquel-cromo, que a liga à balança eletrônica e estabelece um peso de linha de base zero denominado F zero. O experimento é iniciado elevando-se a placa inferior de compressão até que o agregado seja comprimido entre as placas inferior e superior, sendo encerrado quando os agregados atingem o equilíbrio de forma e força, ou FEQ. Os passos finais do procedimento consistem em capturar imagens, medir a geometria do agregado e a força de resistência, e inserir essas medidas na equação de Young LA Place.

No fim das contas, podem-se obter resultados que demonstram alterações na coesão tecidual e como essas poderiam influenciar a dispersão tumoral ou o posicionamento espacial entre diferentes populações celulares por meio de ensaios de espalhamento de agregados ou ensaios de separação celular, respectivamente. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas da biologia tumoral, desenvolvimento embrionário e engenharia de tecidos. Perguntas como: Como a coesão tumoral influencia a invasão maligna, a estratificação das camadas germinativas durante o gastrulado?

Ou como podemos realmente engenhar coesão para gerar estruturas semelhantes a órgãos funcionais in vitro? Manipulações experimentais envolvendo o cultivo de células vivas devem ser realizadas em condições assépticas dentro de uma câmara de fluxo laminar designada. Soluções estéreis e material de laboratório estéril devem ser utilizados durante todo o procedimento. Para iniciar este experimento, colete células aderentes com 90% de confluência.

Primeiro, aspire o meio de cultura e lave a camada celular duas vezes com PBS. Em seguida, aspire o PBS e pipete dois mililitros de tripsina a 0,05% com solução de EDTA sobre o monocamada. Coloque a placa no incubador de cultura tecidual a 37 graus Celsius e incube até que as células se desprendam.

Em seguida, retire a placa do incubador e interrompa a ization adicionando dois mililitros de meio completo. Utilize a pipeta de cinco mililitros para triar a mistura até que as células estejam completamente em suspensão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.

Pipete 40 microlitros de uma solução de DNA a 10 miligramas por mililitro na suspensão celular e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, vortexe brevemente a suspensão celular e, em seguida, centrifugue a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante e descarte-o. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo e repita a centrifugação para lavar.

Suspenda o pellet em um mililitro de meio completo, então realize uma contagem celular e, se necessário, ajuste a concentração da suspensão celular para um vezes. Centralize seis células por mililitro com meio completo usando uma pipeta. Adicione três mililitros da suspensão celular a um frasco redondo de 10 mililitros e incube em banho-maria agitado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas a 120 rotações por minuto, até que as células se recuperem da ionização, conforme indicado pelo aderimento celular umas às outras para formar pequenos agregados.

Em seguida, transfira as células para um tubo de centrífuga de fundo redondo de vidro e centrifugue a 200 vezes a gravidade durante quatro minutos para formar uma fina lâmina após a centrifugação. Afrouxe a tampa do tubo para permitir a troca gasosa e, então, coloque o tubo no incubador de cultura de tecidos. Incube por 24 horas, período após o qual a lâmina deverá tornar-se coerente.

Após 24 horas, agite suavemente o tubo de centrífuga para soltar a lâmina. Em seguida, despeje o conteúdo do tubo de cultura em uma pequena placa de cultura de tecidos estéril de vidro. Utilize escalpelos microcirúrgicos para cortar a lâmina celular em fragmentos de diversos tamanhos e, então, transfira os fragmentos para um frasco redondo de fundo chato de 10 mililitros contendo três mililitros de meio de cultura de tecidos.

Incube os fragmentos a 37 graus Celsius em banho-maria agitado a 120 rotações por minuto sob 5% de dióxido de carbono por dois a três dias ou até que se tornem esféricos. A formação de agregados também pode ser realizada utilizando o método da gota suspensa. De acordo com o protocolo previamente publicado, o conjunto do TENSIÔMETRO ou TST da superfície tecidual consiste na câmara principal do tensiômetro contendo a célula de compressão, um banho d'água para manter a temperatura da câmara, um microscópio estereoscópico com câmera CCD acoplada, uma balança eletrônica para carro com fonte de alimentação e um registrador gráfico.

A célula de compressão do TST é composta por duas câmaras, uma câmara externa e uma câmara interna. A câmara interna contém a placa superior de compressão revestida com poli(2-hidroxietil metacrilato) e a placa inferior de compressão. Primeiro, ajuste a bomba de circulação de água para 37 graus Celsius e certifique-se de que as tubulações estejam conectadas às portas da câmara externa.

Em seguida, parafuse o conjunto inferior, que é usado para elevar o agregado e iniciar a compressão na base da câmara interna. Depois, prepare um trecho de fio de níquel-cromo endireitado pela chama pendurando inicialmente um comprimento de 15 polegadas de fio em um suporte de ferrovia e prendendo um clipe de papel pequeno à extremidade. Em seguida, passe uma chama de bico de Bunsen para cima e para baixo ao longo do comprimento do fio até que ele brilhe em vermelho.

Use alicate de corte para cortar o fio esticado no comprimento apropriado. Em seguida, use duas lâminas de barbear para dobrar o fio aproximadamente um quarto de polegada a partir da extremidade, formando um pequeno gancho. Por fim, encha a câmara interna do TST com meio de cultura de tecidos independente de dióxido de carbono que tenha sido dessurgelado por incubação a 37 graus Celsius por 24 horas.

Use uma pipeta para deslocar quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado na placa de compressão inferior. O aparelho de TST está agora pronto para o experimento de compressão do agregado. Use uma pipeta para aspirar um agregado celular de 200 a 300 mícrons da placa de cultura.

Em seguida, expulse suavemente o agregado sobre a placa de compressão inferior na câmara interna do aparelho TST. Posicione o agregado o mais próximo possível do centro da placa de compressão inferior, empurrando-o suavemente com um tubo capilar equipado com um laço pequeno de cabelo. Conecte o fio de níquel-cromo do conjunto da placa ao braço da balança da balança eletrográfica modelo Can Venton 2000.

Ajuste a posição da balança até que as placas de compressão superior e inferior estejam paralelas e diretamente uma acima da outra. Deixe a placa superior assentar. Em seguida, zere o registrador de gráficos em relação ao peso da linha de base estabelecida.

Utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para capturar uma imagem do agregado não comprimido. Em seguida, ajuste a altura do dispositivo do núcleo interno para controlar o grau desejado de compressão e eleve a placa de compressão inferior até que o agregado seja comprimido contra a placa de compressão superior. Utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para monitorar a compressão e capturar imagens do agregado, como a mostrada aqui.

Registre continuamente a mudança aparente do peso da placa superior de compressão em um registrador de gráfico de fita durante toda a compressão até a obtenção da forma. O equilíbrio é indicado pelo estabilização da saída de tensão do balanço da lata. Mais uma vez, utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para capturar uma imagem do agregado comprimido.

Esta imagem será utilizada para medir a geometria do agregado. Após capturar a imagem, abaixe a placa de compressão para descomprimir o agregado e medir a força compressiva no equilíbrio. Leia o traçado do registrador gráfico como a diferença entre a força medida imediatamente antes da descompressão do agregado e a linha de base zero estabelecida. Repita o processo utilizando um grau diferente de compressão para determinar o equilíbrio de força desta vez.

Meça a força compressiva e a geometria no equilíbrio de forças e aplique essas medições, juntamente com as medições do equilíbrio de forma, à equação de Young-Laplace para gerar valores numéricos da tensão superficial aparente do tecido. De acordo com as instruções no protocolo escrito, esta tabela mostra medições da tensão superficial do tecido e confirmação da liquidez do agregado para agregados de próstata de rato, fibroblastos e células musculares lisas. Agregados de células de fibroblastos da próstata de rato apresentam uma tensão superficial de 22,8 ± 1,1 dinas por centímetro.

Além disso, os valores médios da tensão superficial medidos após a primeira compressão e após a segunda compressão foram estatisticamente idênticos quando comparados por um teste T pareado. Também comparamos as razões de sigma dois sobre sigma um e de F dois sobre F1 para garantir que esses agregados não obedecessem à lei de Hooke, como ocorreria se se comportassem como sólidos elásticos, conforme demonstrado na tabela um. A razão de sigma dois sobre sigma um, de fato, se aproxima de um.

Além disso, a razão de F dois sobre F1 foi significativamente maior do que sigma dois sobre sigma um, confirmando ainda mais que esses agregados não obedecem à lei de Hooke e, na verdade, se comportam como líquidos. Em contraste, como é evidente na tabela um, a razão de sigma dois sobre sigma um de células musculares lisas da próstata de rato é significativamente maior do que um e não diferiu estatisticamente da razão de F dois sobre F1. Para demonstrar ainda mais o comportamento semelhante ao de líquidos, exploramos a relação entre tensão superficial e volume do agregado, conforme pode ser visto aqui. O volume é independente de sigma para células RPF, conforme representado pela linha de regressão vermelha, enquanto parece haver alguma dependência de sigma em relação ao volume para células musculares lisas da próstata de rato, conforme representado pela linha de regressão azul.

Esses dados confirmam ainda mais que agregados de fibroblastos da próstata de rato se comportam de maneira semelhante à de um líquido, enquanto os de células musculares lisas da próstata de rato parecem comportar-se mais como sólidos elásticos. Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de desenvolvimento embrionário, invasão maligna e engenharia de tecidos explorarem o papel da coesão tecidual na formação de compartimentos e limites entre diferentes tipos celulares durante o desenvolvimento das camadas germinativas embrionárias, durante a interação entre células estromais tumorais e o rearranjo de células insulares pancreáticas em diversos modelos animais, incluindo anfíbios, teleósteos, aves e modelos humanos.