Name: Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a medir a coesão intercelular em agregados 3D usando tensiometria de superfície tecidual. Este método correlaciona tensão superficial com invasividade tumoral em pesquisas de biologia celular.

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1. Preparação agregado para a medição da tensão superficial do tecido. Para células aderentes, esferóides podem ser formadas usando o método da gota pendente ou através da geração de uma folha coerente de células que podem então ser cortada em fragmentos 1 mm. Formação de agregados pelo método de gota em suspensão: <ol><li> Quase confluentes culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Parar tripsinização adicionando 2 ml de meio completo e gentilmente usar uma pipeta de 5 ml para triturar a mistura até que as células estão em suspensão. Transferência de células para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 40 mL da solução estoque a 10 mg / ml DNAse e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Brevemente Vortex e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 1 ml completa meio de cultura de tecidos. Repita, então as células ressuspender em 2 ml de meio completo de cultura de tecidos. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro, ou contador de células automatizado e ajustar a concentração para 2,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Remova a tampa de um prato de 60 milímetros de cultura de tecidos e coloque 5 ml de PBS no fundo do prato. Este funcionará como uma câmara de hidratação. </li><li> Inverter a tampa e use uma pipeta de 20 l para depositar 10 gotas mL para o fundo da tampa. Certifique-se que gotas são colocadas suficientemente distante para não tocar. É possível colocar pelo menos 20 gotas por prato. </li><li> Inverter a tampa do PBS-cheia câmara inferior e incubar a 37 ° CO C / 5% 2 / 95% de umidade, monitorar as gotas diárias e incubar até folhas ou células ou agregados formaram. </li><li> Uma vez que formam folhas, podem ser transferidos para fundo redondo de vidro shaker frascos contendo 3 ml de meio completo e incubados em um agitador banho maria a 37 ° C e 5% CO 2 até formar esferóides. </li></ol> Formação de agregados pelo método de camada de células: <ol start="9"><li> Suspensões de células individuais são preparadas como descrito acima, mas a concentração é ajustada para 1x10 6 células / ml. </li><li> Transferência de 3 ml de suspensão de células de 10 ml de fundo redondo de balões (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Incubar frascos em um banho de água giratórios / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 37 ° C, 5% de CO 2 para 4h de 120 rpm até que as células se recuperar de tripsinização. </li><li> Transferência de células para um tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo e centrifugar a 200 X g em um pellet fina. Incubar por mais 24 h até formar uma folha coerente. </li><li> Agite suavemente o tubo de cultura para desalojar a folha e despejar o conteúdo do tubo de cultura em um pequeno prato de vidro estéril, cultura de tecidos. </li><li> Use micro bisturis para cortar as folhas em fragmentos de vários tamanhos. </li><li> Incubar fragmentos a 37 ° C no banho de água giratórios shaker a 120 rpm com menos de 5% CO 2 por 2 a 3 dias ou até que se tornem esféricos. </li></ol> 2. Medição da tensão superficial agregado <ol><li> O tensiômetro superfície do tecido. O aparelho é mostrado nas Figs. 1 e 2. A célula de compressão (Fig. 3) é composto por duas câmaras. A câmara externa (OC) é conectado a uma bomba de 37 ° C água circulante, e serve para regular a temperatura da câmara interna (CI). As câmaras são construídas de Delrin moído e conter janelas de quartzo para a visualização do agregado. Quanto menor a montagem (LA) parafusos na base da câmara interna e é utilizada para: 1) a posição do agregado na câmara interna; 2) selar o fundo da câmara interna; 3) elevar o total para iniciar a compressão e (4 ) controlar a distância entre as placas paralelas e, portanto, a compressão do agregado. O núcleo central (CC) do conjunto é ajustável. A ponta do núcleo central (o pedestal) é composto de Teflon liso e atua como a placa de compressão mais baixa (LCP). A placa de compressão superior (UCP) é um cilindro de teflon 15 milímetros de comprimento que trava do braço de equilíbrio (B) por uma chama-se endireitou fio de níquel-cromo (NCW) *. Durante o curso de um experimento, o agregado de células (A) está posicionada na parte inferior do prato e levantou até que os contatos da placa superior. A placa superior está ligado ao braço de equilíbrio (B). Compressão do agregado causas deslocamento do braço equilíbrio. A balança é um Cahn / Ventron modelo electrobalance gravação de 2000, que opera no princípio de equilíbrio nulo. O fulcro do braço equilíbrio tem uma armadura dentro de um campo magnético permanente. Quando o saldo está operando, continuamente modula a corrente que passa através do conjunto eletromagnético, que por sua vez mantém o braço de equilíbrio na posição horizontal. Quando um objeto é suspenso a partir do braço de equilíbrio, a tensão, que se aplica o equilíbrio para manter o braço na horizoposição ntal, é proporcional ao peso do objeto. Esta tensão mede a força externa aplicada a compressão do agregado. Forma da agregação é monitorado por observação visual através de um estereoscópio Nikon x 25 SMZ10A acoplado a um computador equipado com uma placa de captura. A fim de minimizar a adesão de agregados celulares para as placas de compressão, ambas as placas de compressão inferior e superior foram revestidos com poli (2-hydroxyethylmethacrylate) {poli (HEMA)}, um material polimérico a que as células não aderem 16. * O fio é chama-se endireitou por enforcamento um comprimento de 15 polegadas de fio a partir de uma posição de aperto retorta e um clipe de binder pequeno até o fim. Um bico de Bunsen é, então, corra para cima e para baixo o comprimento do fio até o fio de luz vermelha. O fio esticado pode então ser cortada em comprimentos apropriados. Um pequeno gancho é formado por dobrar o fio cerca de ¼ de polegada a partir do final usando duas lâminas de barbear. A outra extremidade é então inserido no cano da placa de compressão mais baixa. </li><li> Compressão agregado. <ol><li> A câmara interior é preenchido com pré-aquecido CO 2-meio de cultura independente do tecido (Gibco / BRL, NY). </li><li> Agregados variando em tamanho de cerca de 200-300 μ são posicionados na placa de compressão mais baixa (Fig. 4A). Agregados são carregados por um agregado de aspiração em meio de cultura de tecidos metade do caminho até a ponta de uma pipeta Pasteur equipado com uma lâmpada de silicone, transferindo a pipeta para a câmara interior, eo posicionamento da ponta da pipeta sobre a LCP. O agregado é então gentilmente expulsos para o LCP, pressionando ligeiramente o bulbo. Alternativamente, o agregado é permitida a cair por gravidade para a LCP. </li><li> A placa de compressão superior (UCP) está posicionado acima do agregado e deixado em repouso, estabelecendo uma linha de base pré-compressão peso aparente UCP. </li><li> A LCP é então levantado até que a soma é comprimida contra a UCP (Fig. 4B). Ajustar a altura do núcleo interno da parte inferior do aparelho irá controlar diferentes graus de compressão. Compressão é monitorada pela observação através de um microscópio de dissecação equipado com uma câmera de vídeo CCD. </li><li> Imagens agregada são capturados, digitalizados e analisados ​​utilizando ImageJ. Mudança de peso aparente UCP é continuamente gravadas em um registador de agulhas, a realização de equilíbrio de forma a ser indicada pelo nivelamento da tensão de saída da balança Cahn. Cada agregado é submetido a dois diferentes graus de compressão. </li></ol></li><li> Cálculo da tensão superficial agregado. No equilíbrio, forma a coesividade de um agregado de células comprimido entre placas paralelas a que não adere podem ser obtidas a partir da equação de Young-Laplace (Fig. 5), onde σ é coesividade, F é a força que age para comprimir o agregado , πr 3 2 é a área da superfície do agregado em que F força é exercida, e R 2 e R 3 são, respectivamente, o raio do equador do agregado comprimido eo raio de um arco definir seu perfil de superfície normal para a compressão de placas e estendendo entre eles (Fig. 6). Medir a força de compressão e da geometria com força e equilíbrio de forma e aplicar essas medidas para a equação de Young-Laplace gera valores numéricos de tensão aparente tecido da superfície. Ao atingir o equilíbrio e cálculo de σ 1, os agregados são descompactados e permitiu a abordagem de um equilíbrio de segundo e σ 2 é calculado conforme descrito acima. </li><li> Confirmação da liquidez agregada. A tensão superficial calculada de um agregado líquido, quando submetido a duas compressões diferentes permanecerá constante. Em tais agregados a relação entre σ 2 / σ 1 será igual a 1 e será menor do que a razão entre a força aplicada em cada compressão sucessivas (F 2 / F 1). Em contraste, a tensão superficial calculada de um agregado elástica vai obedecer à lei de Hooke e aumentar proporcionalmente à força aplicada. Para os agregados elástica a relação entre σ 2 / σ 1 não será igual a 1, mas em vez disso, a abordagem da relação de F 2 / F 1. A tensão superficial dos agregados líquidos também será independente do tamanho total 2,17. Medições apenas em que a tensão de superfície é independente da força aplicada e tamanho são usados ​​para calcular σ média para cada linhagem celular. </li></ol> 3. Resultados representativos: Abaixo está uma tabela de resultados TST típicos para agregados de fibroblastos de rato próstata (RPF) e próstata de ratos células musculares lisas (RPSMC). Como pode ser visto na fig. 7 agregados de células RPF tem uma tensão superficial de 22,8 ± 1,1 dinas / cm. Além disso, os valores de temperatura média tensão medida após a compactação 1 e após a compressão 2 foram estatisticamente identical, quando comparados por um teste t pareado. Também comparamos os índices de σ 2 / σ 1 e F 2 / F 1 para garantir que estes agregados não obedeceu a lei de Hooke, como fariam se eles se comportaram como sólidos elásticos. Conforme demonstrado na Tabela 1, a proporção de σ 2 / σ uma abordagem realmente 1.0. Além disso, a proporção de F 2 / F 1 foi significativamente maior que σ 2 / σ 1 (teste t pareado, P &lt;0,05), confirmando que estes agregados não obedecem a lei de Hooke e de fato se comportam como líquidos. Em contraste RPSMCs obedeceu a lei de Hooke. Como é evidente na Tabela 1, a relação entre σ 2 / σ 1 é significativamente maior que 1 e não foi estatisticamente diferente do que a de F 2 / F 1. Para demonstrar ainda mais líquido como o comportamento, que explorou a relação entre a tensão superficial (σ) e volume agregado. Como pode ser visto na fig. 8 de volume é independente do sigma para células RPF (linha de regressão vermelho, r 2 = 0,002), enquanto parece haver alguma dependência da sigma no volume de RPSMCs (linha de regressão azul, r 2 = 0,146). Estes dados confirmam que agrega RPF se comportam de maneira semelhante líquido, enquanto que os de RPSMCs parecem se comportar mais como sólidos elásticos. Somente aqueles obtidos a partir de agregados mesurements comportando-se como líquidos seriam usados ​​para calcular a tensão superficial. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visão geral do tensiômetro superfície do tecido. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Uma visão mais detalhada da câmara de tensiômetro (painel direito). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Visão esquemática da câmara de tensiômetro. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imagens de descompactado (A) e comprimido (B) agregados. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. A Equação de Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Diagrama de uma gota de líquido comprimido entre duas placas paralelas a que adere mal, em equilíbrio forma. R 1 e R 2 são os dois raios de curvatura principal, no equador da gota e em um plano através do seu eixo de simetria, respectivamente. R 3 é o raio da área circular a gota de contato com qualquer placa de compressão. H é a distância entre as placas de compressão superior e inferior. X é um lado de um triângulo retângulo com hipotenusa R 2 estendendo-se até um ponto de contato entre a superfície da gota e nem placa de compressão. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 e F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figura 7. Medições TST e confirmação de liquidez agregada para agregados de fibroblastos de rato próstata e células musculares lisas. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Relação entre sigma e volume de agregados de RPF (linha vermelha) e RPSMCs (linha azul).

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<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+properties+of+embryonic+tissues%3A+Measurement+of+interfacial+tensions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li>
<li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Medir a coesão agregado pelo TST é relativamente simples. Há, no entanto, passos-chave que devem ser dominados, a fim de gerar dados TST utilizável; 1) agregados deve ser &quot;saudável&quot;. Isto pode ser controlado, garantindo que a formação de agregados começa com as células que estão na confluência ideal antes de desapego. Tamanho agregado eo tempo na cultura também deve ser controlado para minimizar o desenvolvimento de um núcleo necrótico dentro do agregado; 2) Outro parâmetro que pode influenciar as medições TST...

<ul><li> água do banho / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml de fundo redondo de balões (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

medição de coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Medição rigorosa de energia de ligação intercelular só pode ser feita através de métodos baseados em princípios termodinâmicos em sistemas em equilíbrio. Nós desenvolvemos tensiometria tecido da superfície (TST) especificamente para medir a energia livre de superfície de interação entre as células. Os conceitos biofísicos subjacentes TST têm sido descritos anteriormente em 1,2 detalhe. O método é baseado na observação de que células mutuamente coesa, se mantida em agitação cultura, espontaneamente montar em clusters. Ao longo do tempo, esses grupos irão arredondar para cima para formar as esferas. Este comportamento arredondamento imita o comportamento característico de sistemas líquidos. Energia de ligação intercelular é medido através da compressão agregados esférico entre placas paralelas em um tensiômetro de superfície de design personalizado tecido. A mesma equação matemática usada para medir a tensão superficial de uma gota de líquido é usado para medir a tensão superficial do tecido 3D-como agregados esféricos. O equivalente celular de tensão superficial líquido é energia de ligação intercelular, ou, mais geralmente coesividade tecidos,. Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram que a tensão de superfície de tecido (1) prevê como dois grupos de células embrionárias vão interagir uns com os outros 1-5, (2) pode influenciar fortemente a capacidade dos tecidos para interagir com biomateriais 6, (3) pode ser alterada, não só através da manipulação direta da caderina-base da coesão intercelular 7, mas também pela manipulação de moléculas-chave ECM, como FN 11/08 e 4) se correlaciona com o potencial invasivo de câncer de pulmão 12, 13 fibrossarcoma, tumor cerebral 14 e tumor de próstata linhagens de células 15. Neste artigo vamos descrever o aparelho detalhe, os passos necessários para gerar esferóides, para carregar o esferóides na câmara de tensiômetro, para iniciar a compressão agregado, e analisar e validar as medições de superfície de tecido tensão gerada.

Nós descrevemos um método de medir energia de ligação, expressável como tensão superficial do tecido, entre as células dentro do tecido 3D-como agregados. Diferenças na tensão superficial do tecido têm demonstrado correlação com invasão do pulmão, músculos e tumores cerebrais, e são determinantes fundamentais de estabelecer relações espaciais entre diferentes tipos celulares.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

A medição rigorosa da energia de ligação intercelular só pode ser realizada utilizando métodos fundamentados em princípios termodinâmicos em sistemas em equilíbrio. Nós...

Este procedimento demonstra como medir a força da coesão intracelular em tecidos tridimensionais, como agregados. O primeiro passo é gerar agregados esféricos semelhantes a tecidos e transferi-los para uma placa de Petri contendo meio de cultura tecidual. Em seguida, agregados individuais são aspirados em uma pipeta de pasta e carregados na placa inferior de compressão da câmara do tensiômetro.Em seguida, a placa superior de compressão é conectada a um fio de níquel-cromo, que a liga à balança eletrônica e estabelece um peso de linha de base zero denominado F zero. O experimento é iniciado elevando-se a placa inferior de compressão até que o agregado seja comprimido entre as placas inferior e superior, sendo encerrado quando os agregados atingem o equilíbrio de forma e força, ou FEQ. Os passos finais do procedimento consistem em capturar imagens, medir a geometria do agregado e a força de resistência, e inserir essas medidas na equação de Young LA Place.No fim das contas, podem-se obter resultados que demonstram alterações na coesão tecidual e como essas poderiam influenciar a dispersão tumoral ou o posicionamento espacial entre diferentes populações celulares por meio de ensaios de espalhamento de agregados ou ensaios de separação celular, respectivamente. Assim, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas da biologia tumoral, desenvolvimento embrionário e engenharia de tecidos. Perguntas como: Como a coesão tumoral influencia a invasão maligna, a estratificação das camadas germinativas durante o gastrulado?Ou como podemos realmente engenhar coesão para gerar estruturas semelhantes a órgãos funcionais in vitro? Manipulações experimentais envolvendo o cultivo de células vivas devem ser realizadas em condições assépticas dentro de uma câmara de fluxo laminar designada. Soluções estéreis e material de laboratório estéril devem ser utilizados durante todo o procedimento. Para iniciar este experimento, colete células aderentes com 90% de confluência.Primeiro, aspire o meio de cultura e lave a camada celular duas vezes com PBS. Em seguida, aspire o PBS e pipete dois mililitros de tripsina a 0,05% com solução de EDTA sobre o monocamada. Coloque a placa no incubador de cultura tecidual a 37 graus Celsius e incube até que as células se desprendam.Em seguida, retire a placa do incubador e interrompa a ization adicionando dois mililitros de meio completo. Utilize a pipeta de cinco mililitros para triar a mistura até que as células estejam completamente em suspensão. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.Pipete 40 microlitros de uma solução de DNA a 10 miligramas por mililitro na suspensão celular e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, vortexe brevemente a suspensão celular e, em seguida, centrifugue a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante e descarte-o. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo e repita a centrifugação para lavar. Suspenda o pellet em um mililitro de meio completo, então realize uma contagem celular e, se necessário, ajuste a concentração da suspensão celular para um vezes. Centralize seis células por mililitro com meio completo usando uma pipeta. Adicione três mililitros da suspensão celular a um frasco redondo de 10 mililitros e incube em banho-maria agitado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas a 120 rotações por minuto, até que as células se recuperem da ionização, conforme indicado pelo aderimento celular umas às outras para formar pequenos agregados.Em seguida, transfira as células para um tubo de centrífuga de fundo redondo de vidro e centrifugue a 200 vezes a gravidade durante quatro minutos para formar uma fina lâmina após a centrifugação. Afrouxe a tampa do tubo para permitir a troca gasosa e, então, coloque o tubo no incubador de cultura de tecidos. Incube por 24 horas, período após o qual a lâmina deverá tornar-se coerente.Após 24 horas, agite suavemente o tubo de centrífuga para soltar a lâmina. Em seguida, despeje o conteúdo do tubo de cultura em uma pequena placa de cultura de tecidos estéril de vidro. Utilize escalpelos microcirúrgicos para cortar a lâmina celular em fragmentos de diversos tamanhos e, então, transfira os fragmentos para um frasco redondo de fundo chato de 10 mililitros contendo três mililitros de meio de cultura de tecidos.Incube os fragmentos a 37 graus Celsius em banho-maria agitado a 120 rotações por minuto sob 5% de dióxido de carbono por dois a três dias ou até que se tornem esféricos. A formação de agregados também pode ser realizada utilizando o método da gota suspensa. De acordo com o protocolo previamente publicado, o conjunto do TENSIÔMETRO ou TST da superfície tecidual consiste na câmara principal do tensiômetro contendo a célula de compressão, um banho d'água para manter a temperatura da câmara, um microscópio estereoscópico com câmera CCD acoplada, uma balança eletrônica para carro com fonte de alimentação e um registrador gráfico.A célula de compressão do TST é composta por duas câmaras, uma câmara externa e uma câmara interna. A câmara interna contém a placa superior de compressão revestida com poli(2-hidroxietil metacrilato) e a placa inferior de compressão. Primeiro, ajuste a bomba de circulação de água para 37 graus Celsius e certifique-se de que as tubulações estejam conectadas às portas da câmara externa.Em seguida, parafuse o conjunto inferior, que é usado para elevar o agregado e iniciar a compressão na base da câmara interna. Depois, prepare um trecho de fio de níquel-cromo endireitado pela chama pendurando inicialmente um comprimento de 15 polegadas de fio em um suporte de ferrovia e prendendo um clipe de papel pequeno à extremidade. Em seguida, passe uma chama de bico de Bunsen para cima e para baixo ao longo do comprimento do fio até que ele brilhe em vermelho.Use alicate de corte para cortar o fio esticado no comprimento apropriado. Em seguida, use duas lâminas de barbear para dobrar o fio aproximadamente um quarto de polegada a partir da extremidade, formando um pequeno gancho. Por fim, encha a câmara interna do TST com meio de cultura de tecidos independente de dióxido de carbono que tenha sido dessurgelado por incubação a 37 graus Celsius por 24 horas.Use uma pipeta para deslocar quaisquer bolhas de ar que possam ter se formado na placa de compressão inferior. O aparelho de TST está agora pronto para o experimento de compressão do agregado. Use uma pipeta para aspirar um agregado celular de 200 a 300 mícrons da placa de cultura.Em seguida, expulse suavemente o agregado sobre a placa de compressão inferior na câmara interna do aparelho TST. Posicione o agregado o mais próximo possível do centro da placa de compressão inferior, empurrando-o suavemente com um tubo capilar equipado com um laço pequeno de cabelo. Conecte o fio de níquel-cromo do conjunto da placa ao braço da balança da balança eletrográfica modelo Can Venton 2000.Ajuste a posição da balança até que as placas de compressão superior e inferior estejam paralelas e diretamente uma acima da outra. Deixe a placa superior assentar. Em seguida, zere o registrador de gráficos em relação ao peso da linha de base estabelecida.Utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para capturar uma imagem do agregado não comprimido. Em seguida, ajuste a altura do dispositivo do núcleo interno para controlar o grau desejado de compressão e eleve a placa de compressão inferior até que o agregado seja comprimido contra a placa de compressão superior. Utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para monitorar a compressão e capturar imagens do agregado, como a mostrada aqui.Registre continuamente a mudança aparente do peso da placa superior de compressão em um registrador de gráfico de fita durante toda a compressão até a obtenção da forma. O equilíbrio é indicado pelo estabilização da saída de tensão do balanço da lata. Mais uma vez, utilize o microscópio estereoscópico equipado com câmera CCD para capturar uma imagem do agregado comprimido.Esta imagem será utilizada para medir a geometria do agregado. Após capturar a imagem, abaixe a placa de compressão para descomprimir o agregado e medir a força compressiva no equilíbrio. Leia o traçado do registrador gráfico como a diferença entre a força medida imediatamente antes da descompressão do agregado e a linha de base zero estabelecida. Repita o processo utilizando um grau diferente de compressão para determinar o equilíbrio de força desta vez.Meça a força compressiva e a geometria no equilíbrio de forças e aplique essas medições, juntamente com as medições do equilíbrio de forma, à equação de Young-Laplace para gerar valores numéricos da tensão superficial aparente do tecido. De acordo com as instruções no protocolo escrito, esta tabela mostra medições da tensão superficial do tecido e confirmação da liquidez do agregado para agregados de próstata de rato, fibroblastos e células musculares lisas. Agregados de células de fibroblastos da próstata de rato apresentam uma tensão superficial de 22,8 ± 1,1 dinas por centímetro.Além disso, os valores médios da tensão superficial medidos após a primeira compressão e após a segunda compressão foram estatisticamente idênticos quando comparados por um teste T pareado. Também comparamos as razões de sigma dois sobre sigma um e de F dois sobre F1 para garantir que esses agregados não obedecessem à lei de Hooke, como ocorreria se se comportassem como sólidos elásticos, conforme demonstrado na tabela um. A razão de sigma dois sobre sigma um, de fato, se aproxima de um.Além disso, a razão de F dois sobre F1 foi significativamente maior do que sigma dois sobre sigma um, confirmando ainda mais que esses agregados não obedecem à lei de Hooke e, na verdade, se comportam como líquidos. Em contraste, como é evidente na tabela um, a razão de sigma dois sobre sigma um de células musculares lisas da próstata de rato é significativamente maior do que um e não diferiu estatisticamente da razão de F dois sobre F1. Para demonstrar ainda mais o comportamento semelhante ao de líquidos, exploramos a relação entre tensão superficial e volume do agregado, conforme pode ser visto aqui. O volume é independente de sigma para células RPF, conforme representado pela linha de regressão vermelha, enquanto parece haver alguma dependência de sigma em relação ao volume para células musculares lisas da próstata de rato, conforme representado pela linha de regressão azul.Esses dados confirmam ainda mais que agregados de fibroblastos da próstata de rato se comportam de maneira semelhante à de um líquido, enquanto os de células musculares lisas da próstata de rato parecem comportar-se mais como sólidos elásticos. Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de desenvolvimento embrionário, invasão maligna e engenharia de tecidos explorarem o papel da coesão tecidual na formação de compartimentos e limites entre diferentes tipos celulares durante o desenvolvimento das camadas germinativas embrionárias, durante a interação entre células estromais tumorais e o rearranjo de células insulares pancreáticas em diversos modelos animais, incluindo anfíbios, teleósteos, aves e modelos humanos.

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