Name: Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a técnica de vibrodissociação para isolar neurônios viáveis com terminais pré-sinápticos intactos em roedores. Este método permite estudos detalhados de fisiologia sináptica, farmacologia e imagem em tempo real.

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Gostaríamos de agradecer as Dras. Ping Jun Zhu e Susumu Koyama por sua ajuda durante a configuração inicial da técnica, e Dr. Veronica Alvarez para a assistência na formatação do manuscrito escrito. Este estudo foi financiado pela Divisão de Pesquisa Clínica e Biomédica intramuros da NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vibrodissociation bem sucedida requer que as fatias contêm neurônios saudáveis ​​e que espaços intersticiais são flexíveis o suficiente para permitir que os neurônios para sair a fatia sem danos tóxicos. Assim, a técnica funciona perfeitamente no início idades pós-natal (P1-21), quando fatias saudável pode ser feita com material menos glial / interstiatial do que é encontrado em fatias do cérebro adulto. Em nossa experiência, no entanto, otimizando preparação fatia para a sobrevivência neuronal na fatia em si pode ser contraproducente para a técnica vibrodissociation. Considerando que rotineiramente preparar fatias na gravação situ usando ACSF modificada fria em que a sacarose foi substituída por grande parte do Na + extracelular e Ca 2 +, fatias preparado para vibrodissociation pode ser preparada (cortada por exemplo) em nosso ACSF gravação normal. Ao se preparar para a gravação fatias de neurônios individuais no fatias-se que, também, colocar fatias em ACSF normal em 35 ° C logo após a secção e deixá-los por 30-60 min a esta temperatura antes de devolvê-los à temperatura ambiente. No entanto, as fatias preparado para vibrodissociation são movidos imediatamente à temperatura ambiente logo após o corte. Estes procedimentos proporcionam um maior rendimento de neurônios saudáveis ​​após vibrodissociation, talvez devido à falta de tecido intersticial empresa que permite que os neurônios para ser mais facilmente abalada solto da fatia em si. Nós não temos exaustivamente examinadas as condições de preparação fatia, como nós rotineiramente obter neurônios suficientes para nossa gravação e experimentos com imagens em um determinado dia. É possível que modificações adicionais, tais como mudanças na espessura de corte ou procedimentos preincubaton, poderia ser feito para aumentar a produção de neurônios saudáveis. Tratamentos protease muito leves foram tentadas em um esforço para aumentar o rendimento das células e obter a técnica para trabalhar em animais mais velhos. No entanto, invariavelmente mesmo tratamento protease leve parece interromper a função sinapse. Assim, enquanto a combinação de protease e mecânica dissociação pode ainda ser encontrado a trabalhar, não tem se mostrado confiável nos neurônios do cérebro anterior até à data. Também deve ser observado o rendimento relativamente baixo de neurônios saudáveis ​​após vibrodissociation significa que a técnica é útil principalmente para estudar abundante subtipos neuronal, os neurônios, principalmente projeção. A disponibilidade de GFP-expressando ratos em que as pequenas subpopulações neuronais podem ser facilmente identificados aumenta a chance de estudar esses neurônios mais raros. No entanto, a menos que o rendimento neuronal pode ser melhorado substancialmente o acúmulo de dados sobre esses neurônios é susceptível de ser relativamente lento. Várias etapas provaram ser cruciais para o carregamento de sucesso de neurônios com cálcio-sensing corantes. Exposição a AM-esterificados corante é realizada a 37 ° C, e temos tido sucesso na tentativa de corante de carga a baixas temperaturas. A concentração dos corantes deve ser otimizada considerando tanto o tempo de carregamento e da temperatura, uma vez que parece que a maior concentração de corante carregamento diminui a concentração de cálcio no boutons pré-sináptica. Temos observado que o carregamento com concentrações mais altas diminui a freqüência ea amplitude da sIPSCs. Ao carregar sensível ao cálcio corantes em terminais pré-sinápticos de neurônios vibrodissociated, é preciso ter cuidado porque a capacidade de tamponamento do boutons pequena pré-sináptico pode ser diferente na soma e os tamanhos de boutons não são consistentes. Neurônio contendo os pratos são lavados com tampão HEPES solução externa seguintes dye-loading, eo tempo de recuperação após a lavagem é crucial. Além disso, para fazer uma boa vedação de toda a gravação de células, as células devem ser cuidadosamente lavados para se livrar de não-internalizado moléculas de corante da membrana externa celular. Além de usar os neurônios vibrodissociated para eletrofisiologia e viver imagens de células, técnicas imunocitoquímicas também pode ser aplicado a essas células 11,12. As células podem ser facilmente fixados e corados com uma variedade de anticorpos e marcadores de células outras. O uso dessas células fornece uma preparação limpa para a visualização de expressão da proteína em GABAérgica terminais pré-sinápticos. Utilizando camundongos que expressam proteínas fluorescentes sob o controle de promotores específicos de neurônios GABAérgicos permite ao investigador identificar individuais terminais sinápticos na preparação do vibrodissociated (Figura 1). Marcadores fluorescentes de imagens deste tipo pode permitir medições morfológicas em terminais baseados em laser utilizando microscopia e técnicas mais recentes, como STED (Estimulação Microscopia Esgotamento Emission). Visualização com corantes que o relatório de ciclismo das vesículas sinápticas também é possível com esta preparação. Akaike e colegas de trabalho têm rotulado terminais GABAérgicos com o corante styryl, FM1-43 para visualizar terminais em células vivas 4. Também deve ser possível a realização de uma única célula da transcriptase reversa PCR para RNA no perfil de expressão vibrodissociatedneurônios. Esta técnica é rotineiramente aplicada a enzimaticamente-dissociada neurônios e os neurônios cultivados em cultura de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Vibrando Slicer Tissue </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Dish Cultura de células (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Pratos de vidro de fundo </td><td> Willco-prato </td><td> GWSB-5040-3522 Ou GWSB </td><td> 0,16-0,19 mm para espessura do vidro de imagens </td></tr><tr><td> Manipulator piezoelétrico </td><td> EXFO-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Também pode usar relé, etc </td></tr><tr><td> SD9 Praça Pulso Stimulator </td><td> Grama Technologies </td><td> SD9K </td><td> Para desencadear manipulador piezoelétrico </td></tr><tr><td> Dissecando Stereoscope </td><td> Selvagens Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Também pode usar qualquer estereoscópio </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Fina parede de vidro Capilares </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> TW-150F-4 </td><td> Para chama-selado de vidro micropipeta e micropipeta de patch </td></tr><tr><td> Seis Canal Perfusão Sistemas de Controle da Válvula </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 ou VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusão rápida passo </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido com 20-63x objetivos </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Camera </td><td> ANDOR Tecnologia </td><td> ixon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Fonte de Luz de Fluorescência Iluminação </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM indicador de cálcio </td><td> Sondas moleculares </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e imagem terminais pré-sináptica

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Dissociação mecânica dos neurônios do sistema nervoso central tem a vantagem de boutons pré-sináptica permanecer solidários com o neurônio isolado de interesse. Isto permite a análise da transmissão sináptica sob condições onde os ambientes extracelular e intracelular pós-sináptico pode ser bem controlada. A técnica de vibração baseado sem o uso de proteases, conhecido como vibrodissociation, é a técnica mais popular para isolamento mecânico. A micropipeta, com a ponta-fogo polido com a forma de uma pequena bola, é colocado em uma fatia do cérebro feito de um P1-P21 roedores. A micropipeta é vibrado paralela à superfície e uma fatia reduzida através da espessura de corte, resultando na libertação de neurônios isolados. Os neurônios isolados está pronto para o estudo dentro de alguns minutos de vibrodissociation. Esta técnica tem vantagens sobre o uso de culturas primárias neuronais, fatias de cérebro e neurônios isolados enzimaticamente incluindo: produção rápida de viáveis, os neurônios relativamente madura adequado para estudos eletrofisiológicos e de imagem; controle superior do ambiente extracelular livre da influência das células vizinhas; adequação para o bem-controlado experimentos farmacológicos utilizando a aplicação de drogas rápida e superfusão celular total; e melhorado o espaço clamp-in whole-cell recording em relação aos neurônios em fatia ou preparações de cultura de células. Esta preparação pode ser usado para examinar sináptica fisiologia, farmacologia, modulação e plasticidade. Imagens em tempo real de ambos os elementos pré e pós-sinápticos nas células que vivem e boutons também é possível usando neurônios vibrodissociated. Caracterização dos constituintes moleculares de elementos pré e pós-sinápticos também pode ser alcançado com abordagens imunológicas e de imagem-based.

Este relatório demonstra uma técnica para isolamento mecânico de cada um dos neurônios viáveis ​​retenção anexado boutons pré-sináptica. Neurônios Vibrodissociated têm as vantagens de rápida produção, controle farmacológico excelente e melhor espaço grampo sem a influência das células vizinhas. Este método pode ser usado para imagens de elementos sináptica e patch-clamp gravação.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

A dissociação mecânica de neurônios do sistema nervoso central apresenta a vantagem de que os botões pré-sinápticos permanecem ligados ao neurônio isolado de ...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar neurônios que mantenham bactos sinápticos destacados ainda aderidos, permitindo controle farmacológico e melhoria do espaço de fixação, ao mesmo tempo que elimina a influência de células vizinhas. Isso é conseguido preparando fatias cerebrais agudas de ratos ou camundongos do dia pós-natal P1 a P21 contendo a área cerebral de interesse, para isolar neurônios individuais como segundo passo. As fatias agudas são colocadas em um recipiente e uma micropipeta de vidro selada com chama é vibrada dentro da área de interesse enquanto a ponta é movida através da fatia, o que libera neurônios individuais.Deixa-se um tempo para que os neurônios aderem ao fundo do recipiente. Em seguida, o recipiente contendo os neurônios fibro dissociados é transferido para um microscópio com o objetivo de examinar a fisiologia sináptica, farmacologia, modulação, plasticidade, bem como a imagem em tempo real e a caracterização de elementos pré e pós-sinápticos na célula viva; os resultados obtidos demonstram as características fisiológicas e farmacológicas das respostas sinápticas e as alterações associadas na função do terminal pré-sináptico, por meio de gravação em selo apertado, em célula inteira e microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como gravações em fatias cerebrais, neurônios cultivados e neurônios dissociados enzimaticamente, é que a sinapse robusta e aderida permite o controle e a visualização dos elementos pré-sinápticos, enquanto a estrutura pós-sináptica relativamente compacta possibilita um clamp de voltagem aprimorado e um controle excepcional do ambiente extracelular.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o rendimento para obter neurônios saudáveis pode variar drasticamente dependendo de várias condições, como a idade do animal, os parâmetros de vibração e a área de interesse na fatia. Além disso, os indivíduos apresentam gravações celulares que persistem por um tempo menor do que em lâminas convencionais. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de dissociação por VI são difíceis de aprender, já que é difícil descrever com precisão a distância de movimento e a dissociação através da fatia. Para se preparar para a confecção das fatias cerebrais, prepare uma solução artificial de líquido cefalorraquidiano borbulhada com carbogênio (A CSF) por 15 minutos.Em seguida, adicione cloreto de cálcio a dois milimolares e cloreto de magnésio a um milimolar. Após anestesiar e decapitar um animal com idade pós-natal de P1 a 21, remova o cérebro e corte-o na orientação desejada de modo a incluir a região de interesse. Fixe o cérebro dissecado em uma platina e submerja-o em uma câmara preenchida com A CSF.Em seguida, monte a câmara em um cortador de cérebro e seccione o cérebro com espessura de 250 a 400 micrômetros por fatia, utilizando uma lâmina vibratória. Coloque as fatias em um ACSF e borbulhe com carbogênio em uma câmara de pré-incubação por pelo menos uma hora. Para preparar uma micropipeta de vidro selada com chama, primeiro puxe uma micropipeta padrão para registro de patch clamp com diâmetro de ponta de dois micrômetros em um puxador de micropipetas Flaming Brown ou equivalente.Coloque a ponta da micropipeta na chama de um bico de Bunsen por cerca de dois segundos para formar uma esfera fundida com diâmetro de 200 a 300 micrômetros. Em seguida, coloque a micropipeta selada pela chama em um suporte do micromanipulador que possa ser rapidamente vibrado lateralmente com uma distância de deslocamento de 100 a 200 micrômetros, utilizando um relé bimorfo piezoelétrico ou dispositivo igualmente eficaz. Prepare solução salina tamponada em montes.Ajuste a solução com hidróxido de sódio até pH 7,4 e a osmolaridade com sacarose até cerca de 300 miliosmois. Em seguida, encha uma placa de cultura de 35 milímetros de diâmetro com solução salina tamponada em abundância. Coloque uma fatia na placa de cultura e visualize-a com um estereoscópio de dissecação em 250 x de magnificação usando um fio dobrado.Mantenha a fatia no fundo do recipiente para dissociar as células. Posicione a ponta da micropipeta selada ao chama sobre a superfície da fatia. Ative o micromanipulador para que a ponta vibre lateralmente entre 10 e 30 hertz, com uma distância de excursão de cerca de 100 micrômetros.Abaixe a ponta da micropipeta no corte com o micromanipulador de modo que ela atravesse toda a profundidade em até 30 segundos. Repita este passo conforme necessário para maximizar o número de neurônios isolados. Em seguida, remova a ponta do corte.Segure a fatia com pin&ccedil;as e agite-a suavemente na solu&ccedil;&atilde;o. Em seguida, retire completamente a fatia da solu&ccedil;&atilde;o. Deixe as c&eacute;lulas sedimentarem no fundo do recipiente por pelo menos 10 minutos.Coloque a placa contendo os neurônios sobre a platina de um microscópio invertido e visualize-os com uma objetiva de 1x a 63x. Procure pelos neurônios que apresentam membranas lisas, sem borbulhamento, e núcleos detectáveis, mas não excessivamente grandes. Se for utilizada óptica de contraste de fase, procure neurônios com brilho de fase e uma tonalidade amarelada, mas não muito azulados.Puxe uma micropipeta de patch padrão utilizando um puxador de vidro tipo flaming brown ou equivalente, com resistência da ponta da pipeta entre dois e quatro megaohms. Encha a micropipeta de patch com uma solução intracelular à base de cloreto de césio para medição de respostas sinápticas ou com uma solução intracelular à base de cloreto de potássio para medição de propriedades intrínsecas da membrana e potenciais de ação. Realize o registro em configuração de célula inteira (whole cell) utilizando técnicas eletrofisiológicas padrão.Primeiro, registre correntes pós-sinápticas espontâneas utilizando um protocolo de aquisição de dados contínuo. Em seguida, aplique 200 nan de animal ou tetrodotoxina e/ou solução extracelular com baixo teor de cálcio para registrar correntes pós-sinápticas miniatura e alterar o conteúdo molecular extracelular. Fármacos de interesse são carregados individualmente em um dos compartimentos de um tubo de vidro quadrado fundido com ponta, que é posicionado próximo ao neurônio de interesse.Um barril individual é exposto ao neurônio por meio de um micromanipulador acionado por motor de passo que se move lateralmente para permitir a troca de solução em 10 a 100 milissegundos. Observe os bns baixados em alta ampliação com objetivo de alta abertura numérica em um microscópio baseado em câmera ou multiphoton. Aqui é mostrada a imagem de um neurônio e dos bns capturada com uma câmera de dispositivo acoplado por carga com multiplicação eletrônica.A potência da fonte de luz para excitação foi atenuada a 1,2% com um filtro de densidade neutra de 1,0 e um filtro de íris ajustado a 12% da saída durante as gravações em regime de fixação de voltagem. Com uma solução intracelular à base de cloreto de césio, correntes sinápticas espontâneas são observadas para visualizar a fusão vesicular. Nos batões pré-sinápticos, utilizamos camundongos que expressam o construto sináptico florina sob o controle do promotor TH1.Florina sináptica é uma construção molecular na qual a florina eclíptica, um mutante da GFP com sensibilidade aumentada ao pH, está ligada à proteína da membrana associada a vesículas, após a fusão vesicular. Esse motivo é exposto ao ambiente extracelular mais neutro, com consequente aumento da fluorescência em pontos que correspondem a vesículas e terminais pré-sinápticos. A dissociação em fibras de neurônios do hipocampo provenientes desses camundongos permite a visualização de pontos fluorescentes com tamanho e localização esperados para terminais GABAérgicos durante a tentativa desse procedimento.É importante lembrar que, para ter neurônios saudáveis, é necessário garantir que você tenha fatias saudáveis. Portanto, o preparo de fatias cerebrais agudas é uma etapa importante neste procedimento após este processo. Outros métodos, como imunohistoquímica ou RT-PCR de célula única, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais proteínas e espécies de mRNA são expressas nos botões sinápticos ou neurônios pós-sinápticos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter neurônios isolados saudáveis e utilizá-los para eletrofisiologia, bem como para imagem em tempo real.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman...

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

O vídeo descreve o registro eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongos. Os cortes contendo o núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) são colocados em uma câmara de registro. Uma pipeta estimulante é posicionada no trato óptico para estimular as células ganglionares da retina (RGCs) e investigar sinapses retinogeniculadas ou no núcleo reticular tálamo para estimular neurônios corticais e investigar sinapses corticogeniculadas. Após a...

Um estudo eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongo

Este vídeo demonstra o procedimento para estudar a eficiência sináptica no córtex entorrinal lateral (LEC) estimulando optogeneticamente os axônios do córtex pré-frontal medial (mPFC) e registrando as respostas dos neurônios piramidais no LEC. Este método combina gravações de patch-clamp com ativação sináptica por estimulação de luz para estudar a plasticidade sináptica.

Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

Fonte: McLeod, F., et al. Avaliação da densidade de sinapses em fatias de cérebro de roedores hipocampais. J. Vis. Exp. (2017). Este vídeo demonstra um método para visualizar marcadores sinápticos em fatias cerebrais do hipocampo usando análise de imunofluorescência confocal. As fatias são imunomarcadas com anticorpos primários direcionados a marcadores pré-sinápticos e pós-sinápticos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. Os marcadores marcados são então visualizados...

Análise microscópica de sinapses em fatias de hipocampo de camundongos usando imunofluorescência

Registrar correntes de Ca2+ na membrana facial de liberação pré-sináptica é a chave para uma compreensão precisa da entrada de Ca2+ e da liberação de neurotransmissores. Apresentamos uma dissociação aguda da medula espinhal da lampreia que produz axônios reticuloespinhais isolados funcionais, permitindo o registro diretamente da membrana facial de liberação de terminais pré-sinápticos individuais.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.

Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aprenda a técnica de vibrodissociação para isolar neurônios viáveis com terminais pré-sinápticos intactos em roedores. Este método permite estudos detalhados de fisiologia sináptica, farmacologia e imagem em tempo real.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica (Vídeo) | JoVE Journal

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

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