Name: Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco olfativas nasais de roedores e humanos para pesquisa em neurociência. Este método permite identificar anomalias moleculares em doenças cerebrais e explorar terapias celulares.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pela ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Miopatias), FEDER em PACA e Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encephale). Nós agradecem Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) por sua ajuda eficiente durante a gravação de lapso de tempo.

1. Coleção de Mucosa olfatória em Ratos <ol><li> Comece preparando três pratos de 35 milímetros Petri cheia de DMEM / HAM F12 meio de cultura em uma capa cultura limpa. </li><li> Qualquer método de eutanásia deve ser previamente aprovado pelo cuidado da instituição animal e comissão de uso e realizado por pessoal qualificado. Depois que o rato entrou anestesia profunda com pentobarbital sódico ou outras formas de anestesia injetável, tais como a cetamina / xilazina, decapitar e remover a pele. Os anestésicos inalantes deve ser evitado. Adequação da anestesia será avaliada por pinch pés antes de decapitação. Remova o maxilar inferior com uma tesoura e com a ajuda de um rongeur, eliminar os músculos faciais de ambos os lados. </li><li> A partir da volta dos incisivos, retire com uma rongeur o osso que cobre a cavidade nasal, um lado de cada vez. Cornetos olfativa entram em vista como laranja / marrom órgãos localizados na parte de trás do nariz. </li><li> Delicadamente descartar as conchas com uma pinça. Usando uma agulha de calibre 26, isolar a mucosa olfativa deitado no septo, cortando o tecido ao longo de três linhas: o arco da placa perpendicular, lâmina crivosa e teto da cavidade nasal. </li><li> Coletar biópsias de ambos os lados e transferi-los em um DMEM / HAM placa de Petri F12-cheia. Este procedimento não deve demorar mais do que 10 minutos do início da eutanásia. </li><li> Agora, a fim de remover o muco, a transferência das biópsias duas vezes em pratos de Petri cheia médio. </li></ol> 2. Coleção de Mucosa olfatória em seres humanos <ol><li> Este procedimento deve ser realizado por um Ouvido, Nariz e Garganta (ENT) cirurgião, de acordo com o comitê de ética local relevante (s), e cada ambulatorial deve assinar um termo de consentimento informado. </li><li> Usando um 0 ° ou 30 ° endoscópio rígido (4 mm de diâmetro), inspecionar ambas as fossas nasais e avaliar a presença de pólipos putativa ou qualquer lesão inflamatória. Escolher a melhor cavidade nasal, tendo em conta o desvio do septo. </li><li> Usando um aplicador de algodão, aplicar uma anestesia local, como a lidocaína com epinefrina, por 10 minutos. </li><li> Com uma pinça throughcut etmóide, coletar uma biópsia dois quadrados milímetros ou na raiz do aspecto medial da concha média ou no septo na área dorsomedial. </li><li> A biópsia olfativa é então transferido, usando uma agulha estéril, em um tubo estéril 2 ml preenchida com 1 ml de DMEM / HAM F12. Dica do tubo de cabeça para baixo para se certificar de que a biópsia está imerso em meio de cultura. </li><li> Insira o tubo em um recipiente refrigerado e transportá-lo para o laboratório de pesquisa. Nesta fase, a biópsia pode ser usado por si para estudos comparativos molecular focada em doenças específicas do cérebro ou processados ​​para gerar células-tronco. </li></ol> 3. Isolamento de células estaminais da mucosa olfativa Humanos e Rat <ol><li> Lavar as biópsias em DMEM / HAM F12. Incubar as biópsias em um prato de Petri preenchida com 1 ml de solução dispase II (2,4 UI / ml), por 1 hora a 37 ° C. </li><li> Em seguida, sob um microscópio de dissecação com uma luz difratada invertido, o epitélio olfativo é removido da lâmina própria subjacente usando uma espátula de micro. </li><li> O epitélio olfativo é mais fino e olha translúcido sobre um fundo preto em comparação com a lâmina própria que é listrada de laranja / marrom. Sobre um fundo branco, o epitélio parece cinza e lâmina própria, marrom. </li><li> Uma vez purificado, transferir a lâmina em uma placa de Petri cheia de DMEM / HAM F12. </li><li> Se o tecido é de um roedor, em seguida, corte da lâmina própria em pequenos pedaços com duas agulhas 25. Em seguida, transferir as peças para um tubo de 15 ml preenchida com 1 ml de colagenase IA. </li><li> No tubo, com uma pipeta de plástico estéril, dissociar o tecido. Então, incubar o tubo por 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Para terminar a dissociação, agite levemente o tubo e adicionar 9 ml de Ca-Mg-livre e livre PBS e centrifugar a 200 g por 5 minutos. </li><li> Ressuspender o pellet celular em DMEM / HAM F12 meio de cultura suplementado com soro bovino fetal a 10%, antibióticos e placa em placas de cultura de plástico. </li><li> Agora, se o tecido é humano, então a fatia de lâmina em 3 a 4 peças com uma espessura variando de 200 a 500 mm. </li><li> Inserir cada tira em seu prato 2 centímetros de diâmetro própria cultura e cobrir o tecido com 1,3 centímetros de diâmetro estéril lamínulas de vidro. </li><li> Então, adicionar 500 mL de meio de cultura (DMEM / HAM F12 suplementado com soro bovino fetal 10% e antibióticos) para cada placa de cultura. </li><li> Para qualquer tipo de tecido, renovar o meio de cultura a cada 2 a 3 dias. </li><li> Cinco a sete dias após, as células-tronco começará a invadir a placa de cultura e após duas semanas devem ser confluentes. Quando confluência é atingido, a passagem e transferência das células para frascos de cultura. </li></ol> 4. Formação esfera e difere Neuronalntiation de Células-Tronco Olfactory <ol><li> Para gerar esferas de células-tronco, incubar os frascos por duas horas a 37 ° C com poli-L-lisina. (TEXTO: 5 g/cm2). </li><li> Placa as células com uma densidade de 16.000 células por centímetro quadrado nos frascos tratada. </li><li> A cada dois dias, alimentar as células com 0,2 ml por centímetro quadrado de meio suplementado (DMEM / HAM F12 suplementado com insulina, transferrina, selênio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Dois a cinco dias depois, recolher as esferas de células de flutuação e ou re-plate ou dissociá-los antes do miocárdio em modelos animais de terapia celular. </li><li> Para diferenciar as células-tronco em neurônios olfativos células semelhantes, cultivá-las por 21 dias em meio contendo Neurobasal B-27, a penicilina, estreptomicina glutamina e glutamato. </li><li> Em seguida, fazer mudanças de médio a cada 3 dias. Neurônio-como pilhas deve aparecer após 2-3 semanas. </li></ol> 5. Resultados representativos: Nasal humana explante-outgrowing células-tronco (Figura 2A) estão se dividindo rapidamente e confluência pode ser alcançado dentro de 1-2 semanas. Uma característica chave da stemness, expressão nestina, foi avaliado (Figura 2B). Quando cultivada em poli-L-lisina com um meio de cultura sem soro suplementado com EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml), as células-tronco olfativas dar origem a esferas (figura 2C). Quando cultivada em soro contendo meio de cultura recém-esferas banhado dar origem a células que expressam GFAP (~ 50%), tubulina células que expressam (~ 10-15%) e O4 células que expressam (~ 2-5%) 9 (Figuras 2D-F). No entanto, o destino das células-esfera derivada pode ser modificado. Por exemplo, quando cultivada em meio de cultura suplementado com B27 Neurobasal e glutamato, a maioria dos nasal células-tronco em neurônios olfativos semelhantes células expressando β-tubulina III (Figura 2G) e MAP2 (Figura 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema geral do experimento. Biópsias mucosa olfativa são excisadas de rato ou cavidade nasal humana. Explantes podem ser usados ​​por si só para fins comparativos, estudos moleculares visando identificar biomarcadores em doenças cérebro. Para isolar células-tronco olfativas, as interações entre a lâmina própria eo epitélio neuro-são interrompidas com o II dispase enzima e, após 45 minutos, o epitélio é removido com uma espátula micro. Células-tronco de roedores olfativos são mais selecionados por dissociar a lâmina com colagenase IA. Para o tecido humano, pedaços de lâmina olfativa são cultivadas em lamínula de vidro até que as células-tronco outgrowing invadir todo o bem. Depois de proliferação, usando um meio de cultura apropriado, células-tronco olfativas pode gerar esferas ou se diferenciar em neurônio-como pilhas. Células-tronco olfativas pode ser usado para i) doenças reparação cerebral ou trauma ou ii) identificar marcadores moleculares do centro de doenças do sistema nervoso. Ilustrações são feitas com a ajuda de Servier Arte Médica. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultura e diferenciação de células-tronco humanas nasal olfativo. Células-tronco humanas crescem fora da lâmina própria explante (A) se dividem rapidamente, quando cultivadas em meio de soro contendo. Células-tronco expressar a stemness marcador nestina (B). Quando semeadas em poli-L-lisina revestido de plástico e cultivadas em meio de cultura sem soro suplementado com EGF e FGF2, células-tronco olfativas gerar esferas (C). Esfera células derivadas, quando banhado no soro contendo meio de cultura, dar origem a células que expressam GFAP (~ 50%), tubulina células que expressam (~ 10-15%) e O4 células que expressam (~ 2-5%) 9 (DF). Quando cultivada em meio de cultura suplementado com B27 Neurobasal e glutamato, que se diferenciar em neurônio-como células que expressam β-tubulina III (G) e MAP2 (H).

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As técnicas apresentadas aqui fazer o roedor e mucosa olfativa humana um modelo útil para a investigação clínica sobre as causas de doenças neurodegenerativas e do desenvolvimento neurológico, bem como uma ferramenta para reparar o cérebro patológicos ou traumatizados. O protocolo é relativamente simples e pode ser facilmente realizado por um biólogo celular experientes. A taxa de sucesso para as técnicas de biópsia e cultura é alto. Etapas críticas <ul><li> Para a coleta de mucosa olfativa em roedores, é recomendado não exceder um limite de tempo de 10 minutos entre a eutanásia ea excisão final do tecido olfativo. </li><li> A dissociação da lâmina própria de roedores olfativa é geralmente obtida após 10 min. incubação em colagenase IA. Se não, recomendamos a recolher no dia seguinte o sobrenadante em que os bits não dissociado do flutuador lâmina própria, centrífuga que em 200 g e mecanicamente dissociar a lâmina flutuante usando uma pipeta Pasteur antes repique as células em um novo poço. O primeiro poço que contém as células já anexado é preenchido com meio de cultura fresco. </li><li> Para a lâmina própria humana, que é mais compacto que o tecido de roedores, não recomendamos uma dissociação enzimática. O tecido é cortado e cada explante é inserido entre o fundo do prato de plástico e uma lamela de vidro. Culturas bem sucedidas incluem explantes cuja espessura variam de 200 a 500 mm. </li></ul> Possíveis modificações <ul><li> O protocolo atual pode ser ligeiramente modificada, a fim de gerar neurônios olfativos in vitro. Para esse efeito, o neuro-epitélio não é removido ea mucosa olfativa é todo cortado com um helicóptero McIlwain (200 espessura mm). Cada explante é banhado em um prato, parcialmente secos durante uma hora e depois reidratados com FCS contendo meio de cultura. Durante os primeiros dias pós-revestimento, células epiteliais e mesenquimais crescer fora do explante. Então, progenitores neurônio vai migrar no topo desta camada de células e se diferenciar em neurônios. </li><li> Purificação de células-tronco olfativas pode ser conseguido usando citometria de fluxo. Marcadores de superfície específicos podem ser recuperadas a partir da lista publicada no jornal caracterização 11. </li><li> Para experimentos de transplante, é possível usar uma linhagem de ratos cujas olfativa células-tronco são GFP-positivo. Esta cepa de ratos (Sprague Dawley, eGFP conduzido pelo promotor PGK) está disponível em ITERT (Nantes, França). Para inserir o gene GFP em células-tronco olfativas, nós usamos um método baseado na infecção lentivírus. </li><li> Este trabalho está focado em células olfativas ecto-mesenquimais. No entanto, outro tipo de célula de interesse, as células olfativas ensheathing, pode ser purificado a partir do mesmo tecido. Nós descrevemos um método para a sua recolha e tratamento 1,17 e usamos nasal humana células ensheathing para um ensaio clínico de fase I / IIa clínicos em pacientes paraplégicos 18. </li><li> Como um membro da superfamília de células-tronco mesenquimais, OE-CTMs são capazes, sob condições de cultivo adequado, para se diferenciar em adipócitos, osteócitos e miócitos 11. </li></ul> Aplicações futuras <ul><li> Nós já usamos humana biópsias olfativa para estudar anomalias celulares e moleculares em pacientes com autismo, transtorno bipolar, disautonomia familial, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esquizofrenia 2-7. Teoricamente, todas as doenças do cérebro podem ser estudadas usando biópsias nasais ou periférico de células-tronco olfativas. </li><li> Roedores e humanos nasal células-tronco olfativas já foram enxertados em modelos animais de amnésia, doença de Parkinson, lesão coclear e traumas da medula espinhal 12-16. É concebível para o transplante destas células em modelos animais da doença de Alzheimer, isquemia cerebral, esclerose múltipla. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td colspan="3"> Coleção de mucosa olfativa em ratos </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de calibre 26 </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Coleção de mucosa olfactiva em humanos </td></tr><tr><td> Endoscópio rígido </td><td> Karl Storz ou Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut etmóide forceps </td><td> Karl Storz ou Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolamento de células-tronco olfativas </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Espátula Micro </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Lamínula de vidro </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Formação de esfera e diferenciação neuronal </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insulina transferrina selênio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Médio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Suplemento Serum-Free </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolando nasal células-tronco olfativo dos roedores ou humanos

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

A mucosa olfativa, situado na cavidade nasal, é responsável pela detecção de odores. É também o único tecido nervoso que está exposta ao ambiente externo e de fácil acesso em cada indivíduo vivo. Como resultado, este tecido é única para qualquer pessoa com o objetivo de identificar anomalias molecular no cérebro patológico ou isolar células-tronco adultas para terapia celular. Anormalidades moleculares em doenças cerebrais são frequentemente estudadas usando amostras de tecido nervoso coletado post-mortem. No entanto, este material tem limitações numerosas. Em contraste, a mucosa olfativa é facilmente acessível e pode ser biopsiados com segurança, sem qualquer perda de sentido do olfacto 1. Assim, a mucosa olfativa fornece uma &quot;janela aberta&quot; no ser humano adulto através da qual se pode estudar de desenvolvimento (por exemplo, autismo, esquizofrenia) 2-4 ou neurodegenerativas (Parkinson, por exemplo, Alzheimer) doenças 4,5. Mucosa olfativa pode ser usado tanto para estudos comparativos molecular 4,6 ou em experimentos in vitro na neurogênese 3,7. O epitélio olfativo também é um tecido nervoso que produz novos neurônios a cada dia para substituir aqueles que estão danificados pela poluição, bacteriana de infecções virais. Este neurogênese permanente é sustentada pelos progenitores, mas também células-tronco que residem em ambos os compartimentos da mucosa, ou seja, o neuroepitélio e 10/08 lâmina própria subjacente. Recentemente, desenvolveu um método para purificar as células-tronco adultas localizadas na lâmina própria e, depois de ter demonstrado que elas estão intimamente relacionadas com a medula óssea células-tronco mesenquimais (MSC-BM), que nomeou células olfativas ecto-mesenquimais (OE- MSC) 11. Curiosamente, quando comparado ao BM-MSCs, OE-MSCs exibir uma alta taxa de proliferação, uma clonogenicity elevada e uma inclinação de se diferenciar em células neurais. Aproveitamos essas características para realizar estudos dedicados a desvendar genes novo candidato na esquizofrenia e 4 da doença de Parkinson. Nós e os outros também têm demonstrado que OE-MSCs são promissores candidatos para terapia celular, depois de um trauma na medula espinhal 12,13, a lesão coclear 14 ou em um modelo animal da doença de Parkinson 15 ou amnésia 16. Neste estudo, apresentamos métodos para biópsia da mucosa olfativa em ratos e seres humanos. Após a coleta, a lâmina própria é enzimaticamente separada do epitélio e as células-tronco são purificados usando um enzimáticos ou um método não-enzimática. Purificada de células-tronco olfativas pode então ser cultivado em grande número e depositado em nitrogênio líquido ou induzido a formar esferas ou diferenciados em células neurais. Essas células-tronco também podem ser usados ​​para omics comparativa (genômica, transcriptomic, epigenômico, proteômica) estudos.

Descrevemos aqui um método para biopsying mucosa olfativa de ratos e humanos cavidades nasais. Essas biópsias podem ser utilizados tanto para identificar anomalias molecular em doenças cerebrais ou isolar células-tronco adultas multipotentes que podem ser utilizados para o transplante de células em modelos animais de trauma cerebral / doença.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

A mucosa olfativa, localizada na cavidade nasal, é responsável pela detecção de odores. É também o único tecido nervoso que está exposto ao ambiente externo...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco olfativas nasais de ratos ou humanos, com o fim de identificar anomalias moleculares ou reparar o cérebro afetado por patologias ou traumas. Isso é realizado primeiramente por meio da coleta cirúrgica de biópsias do epitélio olfativo da cavidade nasal. Em seguida, elimina-se o epitélio olfativo e suas células-tronco epiteliais para focar nas células-tronco ecto-mesenquimais presentes na lâmina própria subjacente, e então isolam-se essas células dissociando o tecido de roedores ou coletando as células em migração a partir de implantes humanos cultivados sob lamínulas de vidro.O passo final do procedimento é cultivar esferas de células-tronco, induzindo a diferenciação em células semelhantes a neurônios. Em última análise, isso permite o isolamento da mucosa olfatória inteira, obtendo células-tronco individualizadas. As esferas flutuantes ou as células semelhantes a neurônios podem ser utilizadas para identificar marcadores moleculares em doenças cerebrais ou para reparar danos no sistema nervoso.Descrevemos seu método para isolar células-tronco nasais humanas e de roedores a partir da mucosa olfatória. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que as células-tronco pertencem a um tecido nervoso, são facilmente acessíveis em todos os indivíduos vivos e podem ser utilizadas para diagnosticar ou reparar o cérebro em condições patológicas. Como cirurgião ORL, realizei centenas de biópsias nasais para fins clínicos e estudos científicos.O procedimento é seguro e pode ser realizado com anestesia geral local. Sou um cientista júnior com especialização na cultura de células-tronco humanas ou de roedor, nasais ou fatoriais.Isso apresenta alta taxa de preparação e uma tendência a se diferenciar em tipos celulares neurais. Demonstraram ser eficientes em modelos animais de amnésia e doenças neurodegenerativas. Antes da coleta da mucosa, as biópsias são colocadas em placas de Petri de 3 a 35 milímetros com meio de cultura DMEM/Ham F-12, preparado em uma câmara de cultura asséptica.Agora, após verificar por meio da preensão do dedo do pé que o rato entrou em anestesia profunda com pentobarbital de sódio, eutanasiar por decapitação. Isolar a cabeça e remover a pele. Remover a mandíbula inferior com tesoura e, com a ajuda do próprio jurado, eliminar os músculos faciais em ambos os lados, começando pela parte posterior dos incisivos.Usando o Ron Jur, remova o osso que recobre a cavidade nasal, um lado de cada vez. Os cornetos olfativos aparecem como órgãos alaranjados ou castanhos localizados na parte posterior do nariz; descarte delicadamente os cornetos com pinça.Usando uma agulha de 26 gauge, isole a mucosa olfatória localizada no septo cortando o tecido ao longo de três linhas: o arco da lâmina perpendicular, a lâmina do forame CRI e o teto da cavidade nasal. Colete biópsias de ambos os lados e transfira-as para uma placa de Petri contendo meio A-D-M-E-M ham F 12. Este procedimento não deve levar mais de 10 minutos a partir do início da eutanásia.Agora, para remover o muco, transfira as biópsias duas vezes para placas de Petri contendo meio, de acordo com os comitês éticos locais pertinentes. Um cirurgião otorrinolaringologista deve realizar este procedimento, e cada paciente ambulatorial deve assinar um termo de consentimento informado, utilizando um endoscópio rígido de zero ou 30 graus. Inspecione ambas as cavidades nasais e avalie a possível presença de pólipos ou qualquer lesão inflamatória.Escolha a melhor cavidade nasal levando em consideração o desvio do septo. Usando um aplicador de algodão, aplique um anestésico local, como lidocaína com epinefrina, durante 10 minutos com um corte transversal. Com pinça etmoidal, colete uma biópsia de dois milímetros quadrados na raiz da face medial do corneto médio ou no septo na região medial dorsal.Aqui mostramos a biópsia da região da raiz. A biópsia olfatória é então transferida, com uma agulha estéril, para um tubo estéril de dois mililitros contendo um mililitro de DMEM/F12. Inverta o tubo para garantir que a biópsia fique imersa no meio de cultura.Insira o tubo em um recipiente refrigerado e transporte-o para o laboratório de pesquisa. Nesta etapa, a biópsia pode ser usada per se para estudos moleculares comparativos focados em doenças cerebrais específicas ou processada para gerar células-tronco. Lave as biópsias de humano ou de rato e incube as biópsias em uma placa de Petri contendo um mililitro de DMEM/F12 com dissipe.Duas soluções por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, o epitélio olfativo humano ou de rato é removido da lâmina própria subjacente usando uma espátula microcirúrgica sob um microscópio estereoscópico com luz invertida difratada. O epitélio olfativo é translúcido sobre um fundo preto, em comparação com a lâmina própria, que apresenta faixas marrom-alaranjadas sobre um fundo branco.O epitélio apresenta coloração acinzentada e a lâmina própria, marrom, após a purificação. Transfira a lâmina própria para uma placa de Petri contendo DMEM/F12. Se o tecido for de roedor, corte a lâmina própria em pequenos fragmentos utilizando duas agulhas de calibre 25. Em seguida, transfira os fragmentos para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de colagenase I A no tubo, usando uma pipeta plástica estéril para dissociar o tecido.Em seguida, incubar o tubo por 10 minutos a 37 graus Celsius. Para interromper a dissociação, agitar suavemente o tubo e adicionar mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio e centrifugar a 200 Gs por cinco minutos. Resuspenda o pellet celular em meio de cultura e semear em placas de cultura de plástico.Agora, se o tecido for humano, corte o limão adequadamente em três a quatro pedaços. Insira cada tira em um poço próprio de dois centímetros de diâmetro em uma placa de quatro poços e cubra o tecido com lamínulas de vidro estéreis de 1,3 centímetro de diâmetro.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada placa de cultura, independentemente do tipo de tecido. Renove o meio de cultura a cada dois ou três dias. Após cinco a sete dias de cultivo, as células-tronco começarão a invadir a placa de cultura.E após duas semanas, elas devem estar confluentes. Quando a confluência for atingida, realize o repicagem e transfira as células para frascos de cultura para gerar esferoides de células-tronco.Replique as células com uma densidade de 16.000 células por centímetro quadrado em frascos previamente tratados a cada dois dias. Alimente as células com 0,2 mililitros por centímetro quadrado de meio suplementado. Dois a cinco dias depois, colete as esferas celulares flutuantes e replique-as ou dissocie-as antes do enxerto.Um modelo animal de terapia celular para diferenciar as células-tronco olfativas em células semelhantes a neurônios. Cultive as células por 21 dias em meio neurobasal contendo B27, penicilina, estreptomicina, glutamina e glutamato, e então troque o meio a cada três dias. Células semelhantes a neurônios devem aparecer após duas a três semanas, cinco a sete dias após o plaqueamento.Células-tronco olfativas humanas nasais cresceram a partir do explante e proliferaram rapidamente. A confluência poderia ser atingida em uma ou duas semanas. Uma característica fundamental das células-tronco, ninho e expressão, foi avaliada quando cultivadas em polilisina com meio de cultura livre de soro suplementado com EGF e FGF dois; as células-tronco olfativas deram origem a esferoides quando os esferoides foram semeados em cultura contendo soro.Meio, elas deram origem a populações celulares contendo aproximadamente 50% de células que expressam GFAP, até 15% de células que expressam tubulina e até 5% de células que expressam oh four. Quando as células derivadas de esferoides foram cultivadas em meio de cultura neuro basal suplementado, a maior parte da população tornou-se células semelhantes a neurônios que expressam tubulina beta três. As mesmas células semelhantes a neurônios também expressavam map dois.Assim, o destino das células-tronco pode ser modificado em um semestre. Esta técnica pode facilmente gerar e manter milhões de células-tronco em menos de quatro semanas, permitindo aos clínicos realizar futuros transplantes celulares autólogos. As biópsias refratárias nasais são muito úteis para identificar biomarcadores e doenças cerebrais.Recentemente, tivemos sucesso na identificação de novos genes candidatos para o autismo. Já estabelecemos um banco de células-tronco olfativas de indivíduos autistas e controles, e ele pode ser expandido para outras doenças cerebrais humanas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um protocolo otimizado para o isolamento de células-tronco a partir da glândula salivar do mouse é descrito. O método emprega digestão enzimática e mecânica, e permite o isolamento de salispheres contendo células com características de células-tronco.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Este vídeo demonstra um protocolo detalhado para isolar as paredes laterais do ventrículo do cérebro de camundongo adulto e realizar a dissociação enzimática do tecido para obter células únicas. Essas células são então submetidas a condições específicas de cultura que aumentam seletivamente a proliferação de células-tronco neurais e promovem sua diferenciação em co-culturas de oligodendrócitos e astrócitos.

Obtenção de uma cultura mista de oligodendrócitos e astrócitos a partir de células-tronco neurais de camundongos adultos

Células olfativas ensheathing (OECO) são células da crista neural que permitem o crescimento dos neurônios olfativos primários. Esta propriedade específica pode ser utilizado para transplantação celular. Apresentamos aqui um modelo de transplante celular baseado na utilização de OECs em um modelo de lesão do nervo laríngeo.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Aqui, apresentamos uma nova técnica microcirúrgica para o isolamento de células-tronco neurais da Eminência ganglionar embrião de rato E13 .

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

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Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.

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Aprenda a isolar células-tronco olfativas nasais de roedores e humanos para pesquisa em neurociência. Este método permite identificar anomalias moleculares em doenças cerebrais e explorar terapias celulares.

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