Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco olfativas nasais de ratos ou humanos, com o fim de identificar anomalias moleculares ou reparar o cérebro afetado por patologias ou traumas. Isso é realizado primeiramente por meio da coleta cirúrgica de biópsias do epitélio olfativo da cavidade nasal. Em seguida, elimina-se o epitélio olfativo e suas células-tronco epiteliais para focar nas células-tronco ecto-mesenquimais presentes na lâmina própria subjacente, e então isolam-se essas células dissociando o tecido de roedores ou coletando as células em migração a partir de implantes humanos cultivados sob lamínulas de vidro.

O passo final do procedimento é cultivar esferas de células-tronco, induzindo a diferenciação em células semelhantes a neurônios. Em última análise, isso permite o isolamento da mucosa olfatória inteira, obtendo células-tronco individualizadas. As esferas flutuantes ou as células semelhantes a neurônios podem ser utilizadas para identificar marcadores moleculares em doenças cerebrais ou para reparar danos no sistema nervoso.

Descrevemos seu método para isolar células-tronco nasais humanas e de roedores a partir da mucosa olfatória. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que as células-tronco pertencem a um tecido nervoso, são facilmente acessíveis em todos os indivíduos vivos e podem ser utilizadas para diagnosticar ou reparar o cérebro em condições patológicas. Como cirurgião ORL, realizei centenas de biópsias nasais para fins clínicos e estudos científicos.

O procedimento é seguro e pode ser realizado com anestesia geral local. Sou um cientista júnior com especialização na cultura de células-tronco humanas ou de roedor, nasais ou fatoriais.

Isso apresenta alta taxa de preparação e uma tendência a se diferenciar em tipos celulares neurais. Demonstraram ser eficientes em modelos animais de amnésia e doenças neurodegenerativas. Antes da coleta da mucosa, as biópsias são colocadas em placas de Petri de 3 a 35 milímetros com meio de cultura DMEM/Ham F-12, preparado em uma câmara de cultura asséptica.

Agora, após verificar por meio da preensão do dedo do pé que o rato entrou em anestesia profunda com pentobarbital de sódio, eutanasiar por decapitação. Isolar a cabeça e remover a pele. Remover a mandíbula inferior com tesoura e, com a ajuda do próprio jurado, eliminar os músculos faciais em ambos os lados, começando pela parte posterior dos incisivos.

Usando o Ron Jur, remova o osso que recobre a cavidade nasal, um lado de cada vez. Os cornetos olfativos aparecem como órgãos alaranjados ou castanhos localizados na parte posterior do nariz; descarte delicadamente os cornetos com pinça.

Usando uma agulha de 26 gauge, isole a mucosa olfatória localizada no septo cortando o tecido ao longo de três linhas: o arco da lâmina perpendicular, a lâmina do forame CRI e o teto da cavidade nasal. Colete biópsias de ambos os lados e transfira-as para uma placa de Petri contendo meio A-D-M-E-M ham F 12. Este procedimento não deve levar mais de 10 minutos a partir do início da eutanásia.

Agora, para remover o muco, transfira as biópsias duas vezes para placas de Petri contendo meio, de acordo com os comitês éticos locais pertinentes. Um cirurgião otorrinolaringologista deve realizar este procedimento, e cada paciente ambulatorial deve assinar um termo de consentimento informado, utilizando um endoscópio rígido de zero ou 30 graus. Inspecione ambas as cavidades nasais e avalie a possível presença de pólipos ou qualquer lesão inflamatória.

Escolha a melhor cavidade nasal levando em consideração o desvio do septo. Usando um aplicador de algodão, aplique um anestésico local, como lidocaína com epinefrina, durante 10 minutos com um corte transversal. Com pinça etmoidal, colete uma biópsia de dois milímetros quadrados na raiz da face medial do corneto médio ou no septo na região medial dorsal.

Aqui mostramos a biópsia da região da raiz. A biópsia olfatória é então transferida, com uma agulha estéril, para um tubo estéril de dois mililitros contendo um mililitro de DMEM/F12. Inverta o tubo para garantir que a biópsia fique imersa no meio de cultura.

Insira o tubo em um recipiente refrigerado e transporte-o para o laboratório de pesquisa. Nesta etapa, a biópsia pode ser usada per se para estudos moleculares comparativos focados em doenças cerebrais específicas ou processada para gerar células-tronco. Lave as biópsias de humano ou de rato e incube as biópsias em uma placa de Petri contendo um mililitro de DMEM/F12 com dissipe.

Duas soluções por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, o epitélio olfativo humano ou de rato é removido da lâmina própria subjacente usando uma espátula microcirúrgica sob um microscópio estereoscópico com luz invertida difratada. O epitélio olfativo é translúcido sobre um fundo preto, em comparação com a lâmina própria, que apresenta faixas marrom-alaranjadas sobre um fundo branco.

O epitélio apresenta coloração acinzentada e a lâmina própria, marrom, após a purificação. Transfira a lâmina própria para uma placa de Petri contendo DMEM/F12. Se o tecido for de roedor, corte a lâmina própria em pequenos fragmentos utilizando duas agulhas de calibre 25. Em seguida, transfira os fragmentos para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de colagenase I A no tubo, usando uma pipeta plástica estéril para dissociar o tecido.

Em seguida, incubar o tubo por 10 minutos a 37 graus Celsius. Para interromper a dissociação, agitar suavemente o tubo e adicionar mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio e centrifugar a 200 Gs por cinco minutos. Resuspenda o pellet celular em meio de cultura e semear em placas de cultura de plástico.

Agora, se o tecido for humano, corte o limão adequadamente em três a quatro pedaços. Insira cada tira em um poço próprio de dois centímetros de diâmetro em uma placa de quatro poços e cubra o tecido com lamínulas de vidro estéreis de 1,3 centímetro de diâmetro.

Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada placa de cultura, independentemente do tipo de tecido. Renove o meio de cultura a cada dois ou três dias. Após cinco a sete dias de cultivo, as células-tronco começarão a invadir a placa de cultura.

E após duas semanas, elas devem estar confluentes. Quando a confluência for atingida, realize o repicagem e transfira as células para frascos de cultura para gerar esferoides de células-tronco.

Replique as células com uma densidade de 16.000 células por centímetro quadrado em frascos previamente tratados a cada dois dias. Alimente as células com 0,2 mililitros por centímetro quadrado de meio suplementado. Dois a cinco dias depois, colete as esferas celulares flutuantes e replique-as ou dissocie-as antes do enxerto.

Um modelo animal de terapia celular para diferenciar as células-tronco olfativas em células semelhantes a neurônios. Cultive as células por 21 dias em meio neurobasal contendo B27, penicilina, estreptomicina, glutamina e glutamato, e então troque o meio a cada três dias. Células semelhantes a neurônios devem aparecer após duas a três semanas, cinco a sete dias após o plaqueamento.

Células-tronco olfativas humanas nasais cresceram a partir do explante e proliferaram rapidamente. A confluência poderia ser atingida em uma ou duas semanas. Uma característica fundamental das células-tronco, ninho e expressão, foi avaliada quando cultivadas em polilisina com meio de cultura livre de soro suplementado com EGF e FGF dois; as células-tronco olfativas deram origem a esferoides quando os esferoides foram semeados em cultura contendo soro.

Meio, elas deram origem a populações celulares contendo aproximadamente 50% de células que expressam GFAP, até 15% de células que expressam tubulina e até 5% de células que expressam oh four. Quando as células derivadas de esferoides foram cultivadas em meio de cultura neuro basal suplementado, a maior parte da população tornou-se células semelhantes a neurônios que expressam tubulina beta três. As mesmas células semelhantes a neurônios também expressavam map dois.

Assim, o destino das células-tronco pode ser modificado em um semestre. Esta técnica pode facilmente gerar e manter milhões de células-tronco em menos de quatro semanas, permitindo aos clínicos realizar futuros transplantes celulares autólogos. As biópsias refratárias nasais são muito úteis para identificar biomarcadores e doenças cerebrais.

Recentemente, tivemos sucesso na identificação de novos genes candidatos para o autismo. Já estabelecemos um banco de células-tronco olfativas de indivíduos autistas e controles, e ele pode ser expandido para outras doenças cerebrais humanas.