Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Este vídeo demonstrará como extrair DNA de amostras de tecido embutidas em parafina. A amostra utilizada nesta demonstração é um fragmento de tecido com três milímetros de diâmetro e seis milímetros de comprimento. Embora um único fragmento seja usado nesta demonstração, amostras maiores com mais de cinco milímetros de diâmetro e 10 milímetros de comprimento, ou dois a três fragmentos do tamanho utilizado aqui, podem ser processadas em uma única reação.

No entanto, é importante observar que podem ser necessários ajustes no protocolo para garantir a remoção completa da parafina e a digestão do tecido. Antes que qualquer procedimento seja realizado com o tecido, a parafina cerosa que o preserva deve ser dissolvida. Isso é realizado com o uso de xilol, já que xilol e fenol são tóxicos. Todo trabalho com esses produtos químicos deve ser conduzido em capela de exaustão; adicione 800 microlitros de xilol ao tubo contendo sua amostra.

Em seguida, coloque a amostra em um agitador rotativo por 10 minutos com agitação suave. Centrifugue a amostra a 14.000 RPM por três minutos para formar o pellet e, então, remova o xilol e dissolva a parafina do tubo. Repita esses passos duas ou três vezes até que a parafina seja completamente dissolvida.

O tecido deve parecer úmido e macio. É importante remover toda a parafina para aumentar o rendimento final de DNA. Portanto, são necessárias mais lavagens para amostras de tecido maiores.

Agora que a parafina foi removida da amostra, o tecido deve ser reidratado para permitir a digestão tecidual. Isso é realizado utilizando uma série de reidratação com etanol. Primeiro, adicione 800 microlitros de etanol a 100% à amostra, vortexie e centrifugue a amostra a 14.000 RPM por três minutos.

Remova o sobrenadante. Repita esses passos usando 800 microlitros de etanol 70%, e depois usando etanol 50%. A centrifugação final deve durar cinco minutos, porque o tecido será menos sólido e exigirá mais força para formar o pellet.

Agora, o tecido precisa ser digerido para liberar o DNA das células. Isso é feito usando tampão de lise, uma solução composta por desnaturantes de proteínas, como SDS e proteinase K, a enzima responsável pela degradação do tecido.

Adicione de 200 a 500 microlitros de tampão de lise à amostra. Dependendo do tamanho, 400 microlitros é um bom volume a ser utilizado. Além disso, os componentes do tampão de lise, bem como a temperatura de incubação de 56 graus Celsius, servem para maximizar a atividade da proteína.

ACE K. Porque a proteína ACE K só pode degradar o tecido por um tempo limitado, mais enzima deve ser adicionada periodicamente para continuar a reação. Vinte microlitros de proteína ACE K numa concentração de 10 miligramas por M são adicionados à amostra pela manhã e à noite até que o tecido esteja completamente dissolvido.

Quando não for mais possível ver tecido sólido, o DNA precisa ser extraído do tampão de detritos celulares. O fenol saturado é usado para separar a amostra em fases aquosa e orgânica. A fase aquosa contém o DNA.

É importante usar fenol saturado com tampão porque a acidez do fenol comum não apenas degrada seu DNA, mas também inverte a estratificação das fases aquosa e orgânica. Esteja ciente de que o fenol saturado com tampão é armazenado em duas fases, sendo o fenol a camada inferior.

Adicione um volume igual de fenol saturado com tampão à amostra e inverta o tubo várias vezes. Em seguida, coloque a amostra na centrífuga e gire a 14.000 RPM por cinco minutos para induzir a separação de fases.

O DNA e o RNA serão encontrados na fase aquosa superior, enquanto as proteínas, lipídios e polissacarídeos são encontrados na fase intermédia e na fase orgânica inferior. Remova cuidadosamente a camada aquosa sem perturbar a fase intermédia e coloque-a em um novo tubo. Muitas vezes, após a primeira centrifugação, a interface está solta e irregular.

São necessárias extrações utilizando pequenos volumes de água. O protocolo para extrações de retorno pode ser encontrado no texto que acompanha este vídeo. Repita esses passos até que a interface fique clara, o que geralmente é alcançado após três a cinco repetições, prosseguindo com a adição de um volume igual de fenol-clorofórmio, álcool isoamílico à amostra de DNA.

Isso tem a mesma finalidade que o fenol sozinho, mas melhora a interface para maximizar o rendimento de DNA. Repita este procedimento uma ou duas vezes até que a interface esteja clara e nítida. Agora que sua amostra está livre de proteína, qualquer RNA contaminante deve ser removido.

Isso é conseguido por meio de RNAs. Um RNA de degradação A é adicionado à amostra em uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, e a amostra é incubada por uma hora a 37 graus Celsius. Agora que o RNA está degradado, a enzima RNAA precisa ser removida.

O procedimento de purificação do DNA é repetido como antes. Utilizando fenol saturado com tampão primeiro e depois passando para fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, serão necessárias menos etapas de purificação, já que a única contaminação agora é a enzima RNA A e o RNA degradado. Agora que a amostra contém apenas DNA, o DNA deve ser precipitado a partir da solução, adicionando-se um décimo do volume de acetato de sódio e um volume de isopropanol.

Alternativamente, pode-se adicionar dois e meio volumes de etanol, mas nesse caso será necessário um tubo maior. Incube a amostra a menos 20 graus Celsius por 30 minutos a uma hora, ou durante a noite, caso esteja trabalhando até tarde. Agora que você está trabalhando com DNA, certifique-se de manter a amostra sobre gelo para que não se degrade.

Centrifugue a amostra a 14.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius para formar o pellet do DNA precipitado. Remova o sobrenadante tomando cuidado para não deslocar o pellet, a fim de eliminar os sais em excesso que poderiam interferir em experimentos posteriores, como sequenciamento. Por exemplo, adicione um mililitro de etanol a 70% gelado e ressuspenda suavemente a amostra.

Centrifugue a amostra novamente a 14.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e deixe secar ao ar qualquer etanol em excesso por até cinco minutos. É importante não secar demais a amostra.

Por fim, o DNA é purificado e está pronto para ser ressuspenso no seu tampão de escolha. Aqui estamos utilizando água destilada autoclavada. Ah, sim.

Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Após a conclusão da extração, você deve avaliar a qualidade e a quantidade do seu DNA. Isso é feito por espectrometria usando o NanoDrop 3300 e definindo o tipo de medição como ácido nucleico, selecione DNA 50 como cálculo e inicialize o instrumento com 1,5 microlitros de água.

Limpe o pedestal e realize uma medição em branco usando 1,5 microlitros de diluente. Neste caso, água destilada. Limpe o pedestal, carregue 1,5 microlitros da amostra e pressione medir. Sim. Ótimo.

Uma proporção A dois 60 sobre dois 80 de 1,8 é ideal neste momento. Seu DNA está pronto para uso em aplicações posteriores, que incluem, mas não se limitam a, array, hibridização genômica comparativa, imunoprecipitação de DNA metilado e sequenciamento.

Os links para esses protocolos são mostrados aqui, caso não sejam necessários imediatamente. Armazene suas amostras a menos 20 graus Celsius para uso posterior.