Name: Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda a extrair DNA de amostras de tecido embebidas em parafina (FFPE) usando xileno, reidratação etílica e digestão com proteinase K. Este protocolo garante DNA de alta qualidade para análises genéticas e epigenéticas.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Lam para a sua avaliação e críticas deste vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research.

<p class="jove_title"&gt; 1. Notas processuais</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Xileno e fenol são produtos químicos tóxicos e devem ser tratadas em um fumehood. Consulte a folha de dados material de segurança (MSDS) antes de usar.</li&gt;<liXileno&gt; dissolve certos plásticos, tubos de polipropileno devem ser utilizados como eles toleram estes compostos.</li&gt;<li&gt; Dicas especiais podem ser adquiridos que contêm uma rolha de carvão interno. Isso evita que o xileno de dissolver todos os componentes de borracha na pipeta. Alternativamente, filtros podem ser utilizados.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Remoção de parafina</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Em um fumehood, adicione 800 mL de xileno (VWR, CABDH6216-4) para o tubo rotulado contendo o seu exemplar e coloque sobre um roqueiro, agitando suavemente por 5 a 15 minutos para dissolver a parafina.</li&gt;<li&gt; Pellet a amostra girando à velocidade máxima (14.000 rpm ou 16 000 xg) em microcentrífuga por 3 minutos. Retire cuidadosamente o sobrenadante xileno e dispor em um tubo de polipropileno para descarte dos resíduos xileno. Tenha cuidado para não perturbar o sedimento.</li&gt;<li&gt; Repita os passos de lavagem xileno 1 e parafina 2until é completamente dissolvido. Isso geralmente requer 2-3 lavagens, dependendo do tamanho da amostra de tecido. Uma amostra completamente dissolvido aparecerá macio, e, às vezes, perder a sua integridade estrutural. A integridade da amostra pode ser avaliada com cuidado com uma ponta da pipeta.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Reidratação etanol</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Adicionar 800 mL de etanol a 100% (v / v) grau de biologia molecular do etanol vortex, em seguida, girar por 3 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga. Retire o sobrenadante etanol, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.</li&gt;<li&gt; Adicionar 800 mL de etanol 70% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)) vortex, e girar por 3 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o sobrenadante etanol.</li&gt;<li&gt; Adicionar 800 mL de etanol 50% (100% (v / v) de etanol diluído em água destilada (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)) vortex, e girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Remova cuidadosamente o etanol tanto quanto possível, por pipetagem. Ser extremamente cuidadosa de perturbar o sedimento neste momento como o tecido completamente reidratadas não pellet, assim como tecido desidratado.</li&gt;<li&gt; Depois de remover o sobrenadante etanol, secar o pellet por 5 minutos, sendo o cuidado de não mais seca.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Digestão dos tecidos</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Adicionar 200-500 mL de tampão de lise (fórmula abaixo). Re-suspender o pellet utilizando uma ponteira ou um vórtice. Esforço extra neste momento para re-suspender completamente o tecido irá resultar em uma digestão mais completa da amostra e um melhor rendimento de DNA.</li&gt;<li&gt; Incubar as amostras a 56 ° C em banho-maria ou bloco de aquecimento.</li&gt;<li&gt; Para fragmentos de tecido, ponto 20 l de proteinase K (20 mg / ml solução estoque, Invitrogen, AM2548) de manhã e à noite.</li&gt;<li&gt; Repita os passos acima digestão de 2 a 5 dias até que o tecido é completamente dissolvido.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Tampão de Lise</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8,0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; SDS 0,5%</li&gt;<li&gt; 200 mg / ml proteinase K (adicione imediatamente antes da utilização)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA limpar</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Adicionar um volume igual de tampão saturada de fenol (Fisher, BP1750I-400) e misturar por inversão. Rotação por pelo menos 5 minutos a 14.000 rpm em microcentrífuga.</li&gt;<li&gt; Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Observe a interfase: existe uma grande quantidade de material branco?</li&gt;<li&gt; Repita os passos 1 e 2 na fração aquosa até que a interfase é claro (geralmente três ou mais vezes). Realizar extrações de volta * quando a interfase é distorcido para aumentar o rendimento final.</li&gt;<li&gt; Uma vez que a interfase é claro, adicionar igual volume de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) para a fração aquosa extraída de sua amostra. Misturar por 5 minutos e depois girar por 5 minutos a 14.000 rpm. Thisreduces residual de fenol e ainda aguça a interfase, facilitando a extração da camada aquosa</li&gt;<li&gt; Retire a camada aquosa para um novo tubo e treatwith RNase A a 100 mg / ml durante 1 hora a 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Repita os passos 1-4 para remover qualquer RNase remanescentes A e recolher a fração aquosa. Você só deve precisar de 1 ou 2 tampão saturada passos fenol como deve haver muito menos proteína para remover do que no lisado inicial.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Para realizar extrações de volta adicionar 50-100 mL de dH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 para o tubo de amostra contendo a interfase ea parte orgânica. Inverter o tubo para misturar, e girar a amostra a 14.000 rpm em microcentrífuga por cinco minutos. Coletar a fase aquosa e adicioná-lo à extração aquosa adquiridos anteriormente. Continue até a volta extrações interfase é clara.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA precipitação</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Estime o volume de sua camada aquosa recolhida.</li&gt;<li&gt; Adicione 1 / 10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1 volume de 100% de grau de biologia isopropanol (v / v) molecular (ou 2,5 volumes de etanol 100%).</li&gt;<li&gt; Misture bem e coloque em gelo ou em um freezer -20 ° C por 30 minutos ou durante a noite.</li&gt;<li&gt; Spin na velocidade máxima (14.000 rpm) a 4 ° C em microcentrífuga por 10 minutos</li&gt;<li&gt; Descartar o sobrenadante.</li&gt;<li&gt; Lave o pellet com etanol 70% de gelo fria para remover sais indesejados.</li&gt;<li&gt; Re-suspender o pellet no buffer de escolha (geralmente dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. Quantificação de DNA</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Quantificar a concentração de DNA. O A260: A280 relação deve ser ~ 1.8. Para pequenas quantidades de DNA, medição utilizando um espectrofotômetro NanoDrop é o preferido.</li&gt;<li&gt; Após a quantificação, eletroforese em gel devem ser realizados para testar a qualidade do seu DNA de amostras e determinar se a contaminação RNA foi completamente degradada.</li&gt;<li&gt; Alta qualidade de DNA extraído é agora adequado para aplicações a jusante, ou podem ser armazenadas a -20 ° C para uso posterior. Se RNA ainda está presente na sua amostra, repetir o DNA e as etapas de limpeza, precipitação e re quantificar e qualificar a qualidade de suas amostras.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Tecidos biopsiados ou extirpado cirurgicamente para análise histopatológica eo diagnóstico muitas vezes são fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) para o armazenamento de longo prazo. Com o crescente interesse na compreensão da base genética da doença, a capacidade de extrair DNA dessas amostras representam uma valiosa fonte de material de diagnóstico que pode ser usado para a análise genômica e estudos translacionais. Amostras historicamente FFPE não foram consideradas uma fonte viável para a análise molecular de ácidos nucléicos podem ser pesadamente modificadas por ácido nucléico e proteína-proteína-proteína reticulação 6. No entanto, a descoberta de que a digestão protease releases fragmentada ácidos nucléicos que são adequados para análises a jusante, incluindo PCR, CGH array, seqüenciamento e perfil de metilação, permite o uso destes espécimes valiosos para a análise genética 6. Extração de DNA de tecidos incluídos em parafina é um procedimento robusto que depende de solubilidade diferencial para purificar DNA. Qualidade do DNA extraído ea quantidade eo sucesso da amplificação do DNA subseqüente é dependente de um número de parâmetros antes, durante e após a extração. Estes incluem, mas não estão limitados a: tipo e quantidade de tecido, o tipo de fixador utilizado para preservação de tecido, a duração da fixação, a idade do bloco de parafina e as condições de armazenagem, bem como o comprimento do segmento de DNA que se deseja amplificado 1,7. Remoção de parafina do tecido é a etapa mais crítica para a extração de sucesso como a parafina não dissolvido leva a qualidade da amostra pobres e inibição da PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Xileno </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1,7 ml SafeSeal tubos de microcentrífuga </td><td> Sorenson BioScience </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge Microcentrífuga 16M </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Tampão de Lise </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl PH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 mcg / ml proteinase K </td></tr><tr><td> Proteinase K Solução stock </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinase K Solução stock </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampão saturada de fenol pH 6.6/7.9 </td><td> Pescador </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fenol: clorofórmio: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Pescador </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> A RNase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M pH acetato de sódio 5,2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc em 80ml Acertar a pH 5,2 com ácido acético glacial Adicionar dH 2 O para 100ml Autoclave </td></tr><tr><td> ND Espectrofotômetro 3300 </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

extração de dna de material parafinado embedded para análises genéticas e epigenéticas

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Desenvolvimento da doença e progressão são caracterizados por freqüentes aberrações genéticas e epigenéticas, incluindo rearranjos cromossômicos, os ganhos e perdas no número de cópias e metilação do DNA. Avanços em alto rendimento, tecnologias genome-wide perfis, tais como microarrays, têm melhorado significativamente nossa capacidade de identificar e detectar essas alterações específicas. No entanto, como tecnologia continua a melhorar, continua sendo um fator limitante da qualidade da amostra e disponibilidade. Além disso, informações de acompanhamento clínico e prognóstico da doença são muitas vezes coletados anos após a coleta da amostra inicial. Espécimes, normalmente fixado em formalina e incluídos em parafina (FFPE), são armazenados em arquivos hospital por anos a décadas. DNA pode ser eficiente e eficaz recuperado de parafina espécimes se o método adequado para a extração é aplicada. DNA extraído de alta qualidade a partir de amostras devidamente preservados e armazenados pode suportar ensaios quantitativos para comparações de tecidos normais e doentes e geração de assinaturas genéticas e epigenéticas 1. Para extrair o DNA de amostras de parafina, fragmentos de tecido ou tecido microdissecção são submetidos a tratamento xileno, que dissolve a parafina do tecido, e depois reidratados usando uma série de lavagens de etanol. Proteínas e enzimas prejudiciais, tais como nucleases são posteriormente digeridos por proteinase K. A adição de tampão de lise, que contém agentes desnaturantes, como dodecil sulfato de sódio (SDS), facilita a digestão 2. Ácidos nucléicos são purificados a partir do lisado dos tecidos usando tampão saturada centrifugação velocidade fenol e alta, que gera uma solução bifásica. DNA e RNA permanecem na fase aquosa superior, enquanto que as proteínas, lipídios e polissacarídeos são seqüestrados na inter-orgânicos e fases, respectivamente. Retenção da fase aquosa e repetidas extrações fenol gera uma amostra limpa. Após extrações fenol, RNase A é adicionado para eliminar RNA contaminantes. Extrações adicionais fenol seguintes incubação com RNase A são utilizados para remover qualquer enzima restantes. A adição de acetato de sódio e isopropanol DNA precipita, e centrifugação de alta velocidade é usada para sedimentar o DNA e facilitar a remoção isopropanol. Excesso de sais transitadas de precipitação podem interferir com a subseqüente ensaios enzimáticos, mas pode ser removida do DNA por lavagem com etanol 70%, seguido por centrifugação a re-pellet o DNA 3. DNA é re-suspensas em água destilada ou a reserva de escolha, quantificado e armazenado a -20 ° C. DNA purificado pode posteriormente ser utilizado em aplicações a jusante, que incluem, mas não estão limitados a, PCR, matriz hibridização genômica comparativa 4 (array CGH), imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP) e seqüenciamento, permitindo uma análise integrada de amostras de tecido / tumor.

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

O desenvolvimento e a progressão da doença são caracterizados por aberrações genéticas e epigenéticas frequentes, incluindo rearranjos cromossômicos, número de cópias...

Este vídeo demonstrará como extrair DNA de amostras de tecido embutidas em parafina. A amostra utilizada nesta demonstração é um fragmento de tecido com três milímetros de diâmetro e seis milímetros de comprimento. Embora um único fragmento seja usado nesta demonstração, amostras maiores com mais de cinco milímetros de diâmetro e 10 milímetros de comprimento, ou dois a três fragmentos do tamanho utilizado aqui, podem ser processadas em uma única reação.No entanto, é importante observar que podem ser necessários ajustes no protocolo para garantir a remoção completa da parafina e a digestão do tecido. Antes que qualquer procedimento seja realizado com o tecido, a parafina cerosa que o preserva deve ser dissolvida. Isso é realizado com o uso de xilol, já que xilol e fenol são tóxicos. Todo trabalho com esses produtos químicos deve ser conduzido em capela de exaustão; adicione 800 microlitros de xilol ao tubo contendo sua amostra.Em seguida, coloque a amostra em um agitador rotativo por 10 minutos com agitação suave. Centrifugue a amostra a 14.000 RPM por três minutos para formar o pellet e, então, remova o xilol e dissolva a parafina do tubo. Repita esses passos duas ou três vezes até que a parafina seja completamente dissolvida.O tecido deve parecer úmido e macio. É importante remover toda a parafina para aumentar o rendimento final de DNA. Portanto, são necessárias mais lavagens para amostras de tecido maiores.Agora que a parafina foi removida da amostra, o tecido deve ser reidratado para permitir a digestão tecidual. Isso é realizado utilizando uma série de reidratação com etanol. Primeiro, adicione 800 microlitros de etanol a 100% à amostra, vortexie e centrifugue a amostra a 14.000 RPM por três minutos.Remova o sobrenadante. Repita esses passos usando 800 microlitros de etanol 70%, e depois usando etanol 50%. A centrifugação final deve durar cinco minutos, porque o tecido será menos sólido e exigirá mais força para formar o pellet.Agora, o tecido precisa ser digerido para liberar o DNA das células. Isso é feito usando tampão de lise, uma solução composta por desnaturantes de proteínas, como SDS e proteinase K, a enzima responsável pela degradação do tecido.Adicione de 200 a 500 microlitros de tampão de lise à amostra. Dependendo do tamanho, 400 microlitros é um bom volume a ser utilizado. Além disso, os componentes do tampão de lise, bem como a temperatura de incubação de 56 graus Celsius, servem para maximizar a atividade da proteína.ACE K. Porque a proteína ACE K só pode degradar o tecido por um tempo limitado, mais enzima deve ser adicionada periodicamente para continuar a reação. Vinte microlitros de proteína ACE K numa concentração de 10 miligramas por M são adicionados à amostra pela manhã e à noite até que o tecido esteja completamente dissolvido.Quando não for mais possível ver tecido sólido, o DNA precisa ser extraído do tampão de detritos celulares. O fenol saturado é usado para separar a amostra em fases aquosa e orgânica. A fase aquosa contém o DNA.É importante usar fenol saturado com tampão porque a acidez do fenol comum não apenas degrada seu DNA, mas também inverte a estratificação das fases aquosa e orgânica. Esteja ciente de que o fenol saturado com tampão é armazenado em duas fases, sendo o fenol a camada inferior.Adicione um volume igual de fenol saturado com tampão à amostra e inverta o tubo várias vezes. Em seguida, coloque a amostra na centrífuga e gire a 14.000 RPM por cinco minutos para induzir a separação de fases.O DNA e o RNA serão encontrados na fase aquosa superior, enquanto as proteínas, lipídios e polissacarídeos são encontrados na fase intermédia e na fase orgânica inferior. Remova cuidadosamente a camada aquosa sem perturbar a fase intermédia e coloque-a em um novo tubo. Muitas vezes, após a primeira centrifugação, a interface está solta e irregular.São necessárias extrações utilizando pequenos volumes de água. O protocolo para extrações de retorno pode ser encontrado no texto que acompanha este vídeo. Repita esses passos até que a interface fique clara, o que geralmente é alcançado após três a cinco repetições, prosseguindo com a adição de um volume igual de fenol-clorofórmio, álcool isoamílico à amostra de DNA.Isso tem a mesma finalidade que o fenol sozinho, mas melhora a interface para maximizar o rendimento de DNA. Repita este procedimento uma ou duas vezes até que a interface esteja clara e nítida. Agora que sua amostra está livre de proteína, qualquer RNA contaminante deve ser removido.Isso é conseguido por meio de RNAs. Um RNA de degradação A é adicionado à amostra em uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, e a amostra é incubada por uma hora a 37 graus Celsius. Agora que o RNA está degradado, a enzima RNAA precisa ser removida.O procedimento de purificação do DNA é repetido como antes. Utilizando fenol saturado com tampão primeiro e depois passando para fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, serão necessárias menos etapas de purificação, já que a única contaminação agora é a enzima RNA A e o RNA degradado. Agora que a amostra contém apenas DNA, o DNA deve ser precipitado a partir da solução, adicionando-se um décimo do volume de acetato de sódio e um volume de isopropanol.Alternativamente, pode-se adicionar dois e meio volumes de etanol, mas nesse caso será necessário um tubo maior. Incube a amostra a menos 20 graus Celsius por 30 minutos a uma hora, ou durante a noite, caso esteja trabalhando até tarde. Agora que você está trabalhando com DNA, certifique-se de manter a amostra sobre gelo para que não se degrade.Centrifugue a amostra a 14.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius para formar o pellet do DNA precipitado. Remova o sobrenadante tomando cuidado para não deslocar o pellet, a fim de eliminar os sais em excesso que poderiam interferir em experimentos posteriores, como sequenciamento. Por exemplo, adicione um mililitro de etanol a 70% gelado e ressuspenda suavemente a amostra.Centrifugue a amostra novamente a 14.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante e deixe secar ao ar qualquer etanol em excesso por até cinco minutos. É importante não secar demais a amostra.Por fim, o DNA é purificado e está pronto para ser ressuspenso no seu tampão de escolha. Aqui estamos utilizando água destilada autoclavada. Ah, sim.Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius para uso posterior. Após a conclusão da extração, você deve avaliar a qualidade e a quantidade do seu DNA. Isso é feito por espectrometria usando o NanoDrop 3300 e definindo o tipo de medição como ácido nucleico, selecione DNA 50 como cálculo e inicialize o instrumento com 1,5 microlitros de água.Limpe o pedestal e realize uma medição em branco usando 1,5 microlitros de diluente. Neste caso, água destilada. Limpe o pedestal, carregue 1,5 microlitros da amostra e pressione medir. Sim. Ótimo.Uma proporção A dois 60 sobre dois 80 de 1,8 é ideal neste momento. Seu DNA está pronto para uso em aplicações posteriores, que incluem, mas não se limitam a, array, hibridização genômica comparativa, imunoprecipitação de DNA metilado e sequenciamento.Os links para esses protocolos são mostrados aqui, caso não sejam necessários imediatamente. Armazene suas amostras a menos 20 graus Celsius para uso posterior.

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Biologia

Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).

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