Trichuris Muris Infecção: Um Modelo de imunidade do tipo 2 e inflamação no intestino

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer e manter um modelo natural de infecção por hain. Primeiramente, camundongos são infectados com ovos de tra curus mirrors por meio de gavagem oral. Vinte e um dias depois, os animais infectados são eutanasiados e sangue, linfonodos mesentéricos, pelotas fecais, cólons e seeker são coletados.

Usando essas amostras, a resposta imune gerada contra truques pode ser analisada. Espelhos podem ser analisados. Amostras de soro podem ser analisadas por lisado para detectar anticorpos específicos contra TRA.

A restimulação in vitro de células de linfonodo pode ser realizada para analisar respostas imunes celulares. Pelotas fecais podem ser utilizadas para avaliação do conteúdo proteico e a análise de expressão gênica pode ser realizada por meio de PCR em tempo real da porção colônica. Por fim, a ponta do ceco pode ser utilizada para histologia, enquanto o restante do ceco pode ser usado para determinar a carga parasitária em camundongos infectados.

No final, podem ser obtidos resultados que mostram se um camundongo é resistente ou suscetível à infecção por trais MOUs, e a resposta imune desencadeada contra o parasita pode ser caracterizada. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da imunologia, como quais fatores controlam a ativação de células T auxiliares, bem como quais proteínas são necessárias para a diferenciação de células TH2. Os ovos de Trauss MOUs podem ser propagados em camundongos imunodeficientes ou em linhagens geneticamente suscetíveis, como a KR, 35 dias após a infecção, para colher ovos de camundongos eutanasiados.

Exponha a superfície ventral do animal e lave o abdômen do camundongo com etanol utilizando pinça e tesoura estéreis. Segure a pele abdominal e faça uma pequena incisão. Exponha o conteúdo abdominal, identifique o ceco e o cólon proximal e, em seguida, remova-os.

Transfira os órgãos para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo DMEM suplementado com penicilina e estreptomicina. Em seguida, abra o ceco e o cólon proximal com pinça, expondo a luz e os vermes. Coloque os órgãos abertos em um béquer contendo PBS e agite suavemente para remover as fezes.

Após a lavagem do ceco, transfira-o para uma nova placa de Petri e use pinças curvas lisas para retirar suavemente os vermes. Transfira todos os vermes de cada camundongo para um poço de uma placa de seis poços contendo cinco mililitros de DMEM suplementado com antibiótico. Coloque a placa de seis poços com uma toalha de papel úmida dentro de um recipiente Tupperware e incube a 37 graus Celsius por quatro horas para permitir que os vermes depositem ovos.

Após esta incubação, utilize pinças para remover os vermes do poço original e dividi-los em dois novos poços contendo DMEM. Dividir os vermes desta maneira maximizará a recuperação de ovos utilizando uma pipeta. Recolha o meio remanescente contendo antígeno secretado e ovos do poço original e transfira-o para um tubo Falcon de 15 mililitros.

Centrifugue o tubo a 3000 RPM por cinco minutos. Em seguida, remova e conserve o sobrenadante contendo o antígeno de quatro horas e o Reese's bend o ovo contendo o pellet em água estéril. Coloque a placa de seis poços contendo os vermes a 37 graus Celsius novamente e incube durante a noite até a manhã seguinte.

Após descartar os vermes, colete o conteúdo dos poços conforme mostrado anteriormente e centrifugue o sobrenadante para isolar os ovos. Guarde o sobrenadante contendo o antígeno de incubação noturna e re-suspenda os ovos em água. Como antes, combine esses ovos com os obtidos da incubação de quatro horas.

Filtre os ovos por meio de uma peneira de 70 microns para remover quaisquer vermes remanescentes. Em seguida, transfira-os para um frasco quadrado de 75 centímetros. Cubra o frasco com papel alumínio para protegê-lo da luz e armazene os ovos por seis semanas em temperatura ambiente.

Isso permitirá que os ovos amadureçam e sofram embriogênese após seis semanas. Lave os ovos, agite com água e conte os ovos viáveis. Conforme mostrado aqui.

Como exemplo de um ovo embrionado viável e um ovo não viável, Reese's bend a concentração de Exeter de 50 por 50 microlitros. Neste ponto, os ovos podem ser armazenados a quatro graus Celsius antes de infectar camundongos. Certifique-se de ressuspender completamente a solução contendo os ovos.

Transfira a quantidade desejada de inóculo para um tubo de tampa rosqueável de 14 mililitros e inverta o tubo para misturar. Aspire 200 microlitros de ovos com uma agulha de alimentação de tamanho apropriado para o tamanho do animal, acoplada a uma seringa de um mililitro. Segure o camundongo pelo pescoço e administre os ovos por gavagem oral.

Retorne o camundongo infectado à sua gaiola e permita que a infecção prossiga por 21 dias. Após 21 dias, utilize uma seringa não heparinizada para coletar o sangue dos camundongos infectados por punção cardíaca. Após a eutanásia com dióxido de carbono, as amostras de sangue podem ser armazenadas a quatro graus Celsius.

Para isolamento de soro e análise de IgGs e IgE específicas contra tra por ELISA. Exponha a cavidade abdominal do camundongo conforme descrito anteriormente. Em seguida, use pinça para retirar o ceco com tesoura ou outro par de pinças.

Empurre o intestino delgado para a direita, expondo os linfonodos mesentéricos. Remova cuidadosamente os linfonodos, tomando cuidado para não cortar os intestinos, e coloque-os em um tubo Falcon de 15 mililitros contendo dois mililitros de meio. As células dos linfonodos podem posteriormente ser cultivadas in vitro com o sobrenadante de antígeno S de quatro horas proveniente dos cultivos de vermes para analisar a resposta imune celular ao parasita.

Uma vez que os linfonodos tenham sido coletados, ressecar o ceco e o cólon conforme descrito anteriormente, usando pinça, liberar as pelotas fecais do cólon distal, colocando-as no tubo de oxigênio de dois mililitros; as pelotas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius e analisadas quanto ao teor proteico por meio de western blot utilizando tesoura. Cortar aproximadamente um centímetro do cólon proximal e colocar em um tubo contendo RNA. Posteriormente, armazenar a quatro graus Celsius.

Corte cerca de cinco milímetros da ponta do ceco segurando a ponta do ceco com pinças. Use uma seringa de três mililitros e uma agulha de 22 gauge para lavar a amostra com PBS. Em seguida, transfira-a para um tubo com tampa de encaixe rápido de cinco mililitros contendo paraformaldeído a 4%.

A amostra do ceco fixada em paraformaldeído pode ser armazenada a quatro graus Celsius e utilizada para análise histológica. Coloque o restante do ceco em uma placa de Petri e congele-a a menos 20 graus Celsius para matar os vermes. Para facilitar a contagem dos vermes, descongele o ceco e coloque-o em uma placa de Petri contendo cerca de cinco mililitros de água, utilizando uma tesoura.

Corte o ceco ao meio para expor a luz e agite para coletar as fezes em uma placa. Coloque o ceco limpo em uma placa de Petri nova contendo água e use pinças curvas lisas para raspar as células epiteliais intestinais. Transfira o ceco para uma nova placa de Petri contendo água e rasgue o tecido em pequenos pedaços.

E observe as fezes, as células epiteliais intestinais e o tecido do ceco sob um microscópio estereoscópico e conte os vermes, removendo-os à medida que forem contados e colocando-os em uma placa nova. Assim é como os vermes no ceco devem parecer antes e depois do isolamento, conforme mostrado aqui. Após a infecção, camundongos tragus mirrors preto seis são capazes de controlar os parasitas, enquanto camundongos KR desenvolvem cargas parasitárias elevadas.

Camundongos A KR igualmente suscetíveis desenvolvem títulos de IgG específica contra TRA significativamente mais altos do que camundongos black six, conforme determinado por ELISA sérica. Neste experimento, a análise por Western blot revelou que a quantidade da proteína específica de células caliciformes, lectina beta, estava aumentada nas fezes de camundongos black six, mas não em camundongos A KR após infecção. A análise histológica do ceco distal mostra hiperplasia das células caliciformes e produção de muco em camundongos black six resistentes infectados com TRAs MOUs, mas não em camundongos A KR suscetíveis.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como propagar ovos de trismo, infectar camundongos experimentais e coletar os tecidos intestinais, o meso, os linfonodos entéricos e o sangue para análise da infecção em camundongos suscetíveis ou resistentes.