Name: Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a monitorar mitofagia em Saccharomyces cerevisiae usando microscopia de fluorescência com o biosensor Mt Rosea. Este método permite visualizar a entrega de mitocôndrias ao vacúolo em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo Australian Research Council Grant DP0986937.

Seleção de cepas de leveduras adequadas de controle O ensaio conta com o experimentador avaliar visualmente o acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo levedura. Como tal, o ensaio é subjetiva e depende da seleção de estirpes de controlo adequado e condições de crescimento. Um controle do tipo selvagem é usado para indicar os níveis de autofagia normalmente esperado. Como controle negativo uma cepa nulo para a expressão de um dos genes do núcleo autofagia (por exemplo, ATG3) é adequado; cepas tal não pode entregar material (por exemplo, as mitocôndrias, núcleo) para o vacúolo 1. Transformação de células de levedura com o DNA do plasmídeo Células de levedura pode ser feita facilmente competentes para transformação por tratamento com LiAcetate. Kits comerciais podem ser comprados (por exemplo, EasyComp, Invitrogen) e protocolos publicados estão disponíveis 13. Neste protocolo utilizamos cepa selvagem BY4741 (MAT uma his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), e alguns membros de uma biblioteca abrangente de cepas mutantes de deleção (por exemplo, Δ atg3) derivados dela, cada expressão falta de um gene não essenciais diferentes. A biblioteca de tensão exclusão representa uma valiosa ferramenta para a investigação de autofagia usando Rosella baseado em sondas. O repórter empregada neste protocolo é mt Rosella para mitocôndrias (Fig. 2A), codificada pelo pAS1NB: mt-Rosella 12. Os passos seguintes são baseados no uso de células competentes fez usando o Kit de Transformação EasyComp e armazenadas congeladas a -80 ° C para uso conveniente. <ol><li> Equilibrar Solução III (EasyComp Transformação Kit) à temperatura ambiente 30 minutos antes de adicionar a células de levedura. </li><li> Adicionar 2-2,5 mL (~ 100 ng / L) de DNA plasmídeo codificando o repórter (pAS1NB: mt-Rosella) para um 1,7 ml estéril pressão cap-tubo de microcentrífuga de plástico. </li><li> Adicionar 5 mL de suspensão recém-descongelado de células de levedura competentes e misture por pipetagem suave. </li><li> Adicionar 50 ml de solução III (EasyComp Transformação Kit) e vortex para misturar. 1.5) Incube as reações de transformação para uma hora a 28-30 ° C com vigorosa mistura a cada 15 minutos usando um mixer vortex ou manualmente por flicking o tubo com o dedo. </li><li> Transferir cuidadosamente a mistura de transformação para uma placa de crescimento YMM única agar suplementado com histidina, metionina e uracila, distribuir e suavemente as células ao redor da superfície do ágar com um espalhador de vidro estéril. Células de levedura são frágeis nesta fase e manuseio suave pode aumentar o rendimento de transformantes. </li><li> Incubar as placas de crescimento para 2 a 4 dias a 28-30 ° C ou até colônias aparecem cerca de 2-3 mm de diâmetro. </li></ol> 2. Confirmando expressão de Rosella em células de levedura Antes de embarcar em experimentos detalhados a localização correta e expressão eficiente de Rosella devem ser confirmados. <ol><li> Usando palitos estéreis selecionar para cada cepa cinco colônias único da placa de transformação e ressuspender as células em 50 mL de água estéril em separado 1,7 ml estéril pressão cap-tubo de microcentrífuga de plástico. </li><li> Lugar mL 10 de cada suspensão de células para separar as lâminas de vidro rotulados microscópio (76 x 26 mm) e cobrir a suspensão de células com uma lamela quadrados (22 x 22 mm). </li><li> Examinar imediatamente as células para emissão de fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência (por exemplo, a Olympus FluoView FV500). Procure por fluorescência verde e vermelho forte e rotulagem típico de localização mitocondrial (Fig. 2B e 2C). </li><li> O restante de cada colônia examinados para fluorescência desta forma deve ser inoculado em um prato doce YMM crescimento. </li><li> Incubar as placas a 28-30 ° C por 2 dias até colônia são aproximadamente 2-3 mm de diâmetro. </li></ol> 3. Crescimento celular e indução de autofagia Autofagia pode ser induzida pelo uso de um número de diferentes condições experimentais, incluindo entrada em fase estacionária, mudança na fonte de carbono, a administração de rapamicina, ou privação de nitrogênio. Nós usam rotineiramente privação de nitrogênio como o método para induzir mitophagy. <ol><li> Inocular uma única colônia em 10 ml de meio de crescimento contendo etanol e os suplementos apropriados auxotróficos. </li><li> Incubar as culturas de levedura a 28-30 ° C com agitação orbital (200 rpm) por aproximadamente 48 horas. As células devem ser em meados de log-fase de crescimento. </li><li> Pellet de células duplicadas amostras de 1ml da cultura em 1,7 ml estéril pressão cap-tubos plásticos de centrífuga por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente. Remova e elimine cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. </li><li> Lave as células três vezes com 1 ml de água estéril destilada por ressuspensão seguida de centrifugação para remover m residualedium. </li><li> Após a terceira lavagem ressuspender as células em 100 ml de meio de crescimento ou nitrogênio fome e médio prazo. </li><li> Re-inocular as células ressuspendidas em 10 ml de meio de crescimento fresco ou 10 ml de meio de nitrogênio-inanição. Incube com agitação orbital por 6-12 horas para permitir a indução da mitophagy. Depois de fome preparar células para visualização por microscopia de fluorescência. </li></ol> Nota: Etiquetagem do vacúolo com CMAC-Arg Ao primeiro, que estabelece o ensaio é útil para confirmar a entrega sob microscópio de fluorescência de Rosella ao vacúolo. Apesar de o vacúolo levedura é uma organela grandes cuja localização pode muitas vezes ser facilmente determinado por referência a transmitiu imagens de luz, em algumas cepas de leveduras e em algumas condições de crescimento do vacúolo pode ser fragmentada e difícil de localizar. O vacúolo pode ser prontamente rotulados com uma tintura baseada em cumarina vacúolo como CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amida). A ação de proteases vacuolar nos resultados corante azul brilhante na rotulagem fluorescência do vacúolo. A emissão azul pode ser facilmente distinguidas das emissões vermelho e verde de Rosella 11. Rotulagem com CMAC-Arg não precisa ser realizada rotineiramente, mas é recomendado para aqueles que não estão familiarizados com o local ea aparência do vacúolo em levedura. 4. Rotulagem do vacúolo com CMAC-Arg <ol><li> Adicione o CMAC-Arg (100 mM de concentração final) para as células de crescimento ou nitrogênio de fome antes da imagem. A solução CMAC-Arg pode ser preparado com antecedência, mas como a solução é sensível à luz que precisa ser protegido da exposição à luz. </li><li> Incubar a 28-30 ° C com agitação orbital (200 rpm) por 30 minutos. </li><li> Pellet células por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Lave as células três vezes com água destilada estéril por ressuspensão seguida de centrifugação para remover médio residual e excesso CMAC Arg-dye. </li><li> Montagem das células para criação de imagens como descrito abaixo. </li></ol> 5. Montagem ao vivo células de levedura para microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) <ol><li> Derreta 2 mg de baixo ponto de fusão de agarose em separado um alíquotas ml de meio de crescimento e de nitrogênio fome-meio, incubando a 70 ° C. A agarose fundida é mantida a 70 ° C. </li><li> Suavemente as células pellet em 1 ml alíquotas de cada cultura de células por centrifugação a 2000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente e descartar o sobrenadante. </li><li> Lave as células três vezes com 1 ml de água estéril destilada por ressuspensão e centrifugação, tal como no passo 5.2. </li><li> Ressuspender as células lavadas com 100 ml de água destilada estéril. </li><li> Para montar as células no local 20 l de agarose fundida numa lâmina de vidro rotulados microscópio (76 x 26 mm). </li><li> Detectar imediatamente 10 ml de suspensão de células lavadas em cima da cama agarose. </li><li> Cobrir a cama agarose com uma lamela (22 x 22 mm). As células se espalhará por toda a superfície agarose sob a lamínula. </li><li> Para evitar a desidratação eo movimento da lamela durante a imagem cuidadosamente selar as bordas da lamínula com uma película fina de unha polonês. </li><li> Quando a unha polonês está completamente seco (10 min) o slide está pronto para ver por microscopia de fluorescência Beware: unha polonês pode causar danos aos objetivos microscópio. </li><li> Células montado usando esta técnica pode ser observado até uma hora após a montagem. </li></ol> 6. Autofagia visualizar usando CLSM O nível de autofagia em uma população de células é rotineiramente avaliados através da determinação do número de células mostrando fluorescência vermelha vacuolar antes e após a indução de autofagia. Idealmente, a progressão da autofagia é monitorado em momentos selecionados após a indução de autofagia (Fig. 3). Esta é a melhor realizada através da visualização através do microscópio binocular. É importante que os controles corretos são empregados (por exemplo, Δ atg3 mutantes) e que as configurações microscópio permanecem inalterados entre observar amostras diferentes (por exemplo, o uso de filtros de densidade neutra, seleção de filtro). Células de levedura são relativamente pequenos que requerem um microscópio de fluorescência de boa qualidade (por exemplo, a Olympus FluoView FV500) equipado com excitação / emissão de filtros adequados para a visualização separada de GFP e / ou pHluorin (verde emissão de fluorescência) (FITC filtro) e DsRed.T3 (vermelho emissão de fluorescência) (TRITC filtro). <ol><li> Usando uma visão objetiva 60x de água não-fome células de tipo selvagem utilizando alternadamente os filtros FITC e TRITC. Células de tipo selvagem deve apresentar uma distribuição típica celulares das mitocôndrias na periferia das células que mostram tanto fluorescência vermelha e verde. Note-se que esta distribuição das mitocôndrias é dependente do pinhole configuração do microscópio confocal. Geralmente usamos um valor menor pinhole de 125 M que só permite a mitocôndria para ser observado como uma série de pontos localizados na periferia da célula (Fig. 2C) de modo que o vacúolo não é obscurecida 12. Se um valor elevado de pinhole (200 mm) é usado isto permite que a rede filamentosa típica mitocondrial distribuídos por toda a célula (e as mudanças que sofre) a serem observados 11. Sem outras estruturas na célula deve ser fluorescente etiquetado. </li><li> Seqüencialmente vista células para cada um dos seguintes momentos de transferência a médio fome. Visualize alternadamente utilizando os filtros de emissão verde e vermelho. Na inanição h 6 de fluorescência tempo ponto vermelho, mas não de emissão correspondentes verde deve ser perceptível no vacúolo. Localização vacuolar pode ser confirmada separadamente usando CMAC-Arg (Fig. 2C). Ver ~ 200 células e contar o número que mostram apenas fluorescência vermelha no vacúolo (ou seja, a captação vacuolar das mitocôndrias). </li><li> Contagem de acumulação vacuolar para todos os pontos tempo observando&gt; 200 células e, em seguida, percentual lote de células mostrando acúmulo vacuolar. </li><li> Examinar células autofagia-controlo negativo expressar mt-Rosella antes fome e inanição após 6 h. </li></ol> 7. Resultados representativos: Aqui, nós mostramos os resultados típicos obtidos utilizando-mt Rosella, expressa no tipo selvagem e Δatg3 células mutantes. Sob condições de crescimento com o etanol como fonte de carbono, tanto do tipo selvagem e Δatg3 células mutantes apresentam uma distribuição celular de fluorescência (vermelho e verde) típico das mitocôndrias nas células de levedura. Vermelho e verde emissão de fluorescência não é detectado no vacúolo (Fig. 2B e 2C). Quando submetido a privação de nitrogênio por 6 h, em seguida, e além, além de fluorescência vermelha e verde correspondente a mitocôndria, células de tipo selvagem também apresentam o acúmulo de vermelho, mas não de fluorescência verde no lúmen vacuolar (Fig. 2B;. Fig. 3) . No entanto, em Δatg3 células mutantes fluorescência vermelhas nem verdes acumula no lúmen vacuolar (Fig. 2C;. Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Top, o esquema de organelas e compartimentos em uma célula de levedura. Fundo, uma visão vacúolo-centric de uma célula de levedura é apresentada indicando degradação autofágica de organelas e compartimentos diferentes. Algumas das diferenças entre os vários tipos de organelas específicas de autofagia (por exemplo, mitophagy, nucleophagy) incluem a especificidade (seleção de carga) do conteúdo engolido, várias necessidades intracelular e extracelular pistas (por exemplo, a fome, danos), sinais específicos, ATG genes ea dependência do tempo. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figura 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figura 2d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2d"> Figura 2. (A) representação esquemática do mt-Rosella. A seqüência líder mitocondrial (neste caso da citrato sintase) é usado para direcionar o biossensor Rosella para a matriz mitocondrial. Excitação e emissão maxima para ambas as proteínas fluorescentes vermelhas (DsRed.T3) e proteína verde fluorescente (pHluorin) são indicados. Em pH elevado (pH ~ 8,2 mitocondrial), o biosensor fluorescente vermelho e verde, no entanto, em pH baixo (pH vacuolar ~ 5.5) que fluoresce apenas vermelho. (B) Representação esquemática dos resultados esperados no tipo selvagem e atg3 Δ células mutantes expressando mt-Rosella. (C) Os resultados reais obtidos por CLSM de células de tipo selvagem sob crescente e as condições de privação de nitrogênio. Da esquerda para a direita:. DIC (diferença de contraste), RFP (DsRed.T3) emissão de fluorescência, GFP (pHluorin) emissão de fluorescência, CMAC-Arg fluorescência e imagem merge (D) Os resultados reais obtidos por microscopia de fluorescência de células mutantes em Datg3 crescente e as condições de privação de nitrogênio. Da esquerda para a direita: DIC (diferença de contraste), RFP (DsRed.T3) emissão de fluorescência, GFP (pHluorin) emissão de fluorescência, CMAC-Arg fluorescência e imagem fundem. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A percentagem de células do tipo selvagem e mutante Δ atg3, expressando-mt Rosella e cultivadas sob privação de nitrogênio, mostrando fluorescência vermelha no vacúolo durante um curso de tempo de 48 horas. A porcentagem de células mostrando acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo foi gravado em 0, 6, 12, 24 e 48 horas após o início privação de nitrogênio.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nas imagens representativas apresentado na fig. 2B e 2C, pode ser visto claramente que o uso de organela específica repórteres fluorescentes e microscopia de fluorescência fornece evidências da localização mitocondrial / distribuição em ambos os crescentes e nitrogênio de fome as células e permite mitophagy a ser visualizada. É preciso enfatizar que este método não é restrito a mitophagy seguinte. Autofagia de outros componentes celulares ou organelas (por exemplo, os ribossomos, gotículas lipídicas, peroxissomos, retículo endoplasmático e núcleo) pode ser monitorada com uma rotulagem adequada. Detalhes da construção de biossensor Rosella, as condições de cultura de células e os resultados típicos para o volume de negócios do núcleo (nucleophagy) têm sido relatados 11,12 ilustrando a aplicação mais ampla do método. Uso de organela específica repórteres fluorescentes para autofagia monitoramento exige várias considerações de design construto a ser mantido em mente. Estas incluem: (1) seleção e fusão com o sinal adequado direcionamento para alcançar organela específica focalização; (2) seleção de uma proteína fluorescente apropriado (s), (3) forte emissão de fluorescência; (4) organela localização correta e / ou distribuição dentro da célula. Uma vez que o repórter organela específica foi expressa com sucesso no hospedeiro levedura escolhida estirpe um segundo grupo de ponderações tornam-se: (1) as condições de crescimento do fermento, (2) a preparação de amostras de células, (3) parâmetros de imagem como é importante que os parâmetros selecionados para CLSM (por exemplo, a intensidade do laser, velocidade de varredura e modo, o valor pinhole, o valor de zoom, objectivos utilizados ou de exposição para CCD-câmera) são mantidas durante todo um experimento assegurar que as comparações podem ser feitas entre o controle (células de crescimento) e amostras de fome; ( 3) entrega autofagia indução e bem-sucedida do repórter no vacúolo. No geral, este método de microscopia fluorescente é fácil, relativamente rápido, e tem potencial de aplicação para a triagem de alto rendimento para novas drogas que aumentam ou inibir a autofagia, e também para genes que regulam ou modulam a autofagia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformação Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos e sulfato de amônio </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Lâminas de microscopia (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas de microscópio (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Laser Confocal Scanning Microscope FluoView FV500 </td><td> Olimpo </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Sondas-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Todas as concentrações são dadas w / v, salvo indicação em contrário. Média mínima de levedura (YMM): base de nitrogênio 0,67% de levedura sem aminoácidos, glicose 2%, ágar 1,5% (apenas adicionado ao fazer meios sólidos) e todos os suplementos necessários auxotróficos (0,01%)]. Sais Saccharomyces (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MGC1 2 0,6%, H2O 0,07; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Meio de crescimento: SS e etanol 2% (v / v) e suplementos auxotróficas apropriado. Nitrogênio fome médio: base de nitrogênio 0,17% de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônio (Difco), 2% de etanol (v / v).

um ensaio de microscopia de fluorescência para mitophagy monitoramento no fermento saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autofagia é importante para o volume de negócios de componentes celulares em uma série de condições diferentes. Serve uma função essencial homeostáticos, assim como um mecanismo de controle de qualidade que podem degradar-alvo e seletivamente material celular incluindo organelles1-4. Por exemplo, danificadas ou redundantes mitocôndrias (Fig. 1), não eliminados por autofagia, pode representar uma ameaça à homeostase celular e sobrevivência da célula. Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, a privação de nutrientes (por exemplo, privação de nitrogênio) ou danos pode promover a rotatividade seletiva da mitocôndria por autofagia em um processo denominado mitophagy 5-9. Descrevemos uma abordagem de microscopia de fluorescência simples para avaliar a autofagia. Para maior clareza nós restringimos nossa descrição aqui para mostrar como a abordagem pode ser usada para monitorar mitophagy em células de levedura. O ensaio faz uso de um repórter fluorescente, Rosella, que é um biosensor dupla emissão compreendendo um pH relativamente estável proteína fluorescente vermelha ligada a um pH-sensíveis proteína verde fluorescente. A operação deste repórter se baseia em diferenças de pH entre o (pH ~ 5,0-5,5) e vacúolo (pH ~ 8,2) mitocôndrias nas células vivas. Sob condições de cultivo, as células do tipo selvagem exibem tanto fluorescência vermelha e verde distribuída em uma maneira característica da mitocôndria. Emissão de fluorescência não é associado com o vacúolo. Quando submetido a privação de nitrogênio, uma condição que induz mitophagy, além de fluorescência vermelha e verde rotulagem das mitocôndrias, as células apresentam o acúmulo de vermelho, mas não de fluorescência verde, na luz ácida vacuolar representando a entrega das mitocôndrias para o vacúolo. Marcar células com vermelho, verde, mas não vacúolos fluorescente pode ser usado como uma medida de atividade em células mitophagic 5,10-12.

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

A autofagia é importante para a renovação de componentes celulares sob diversas condições. Ela desempenha uma função homeostática essencial, bem como uma ...

O objetivo geral do experimento a seguir é acompanhar a captação de mitocôndrias pelo vacúolo como um meio de estudar a autofagia de mitocôndrias, um processo conhecido como mitofagia. Isso é conseguido pela expressão em células de levedura de um biossensor de pH fluorescente, codificado geneticamente e direcionado às mitocôndrias, com emissão dupla denominado Mt Rosea, que marca as mitocôndrias com fluorescência vermelha e verde. Como segundo passo, as células de levedura são submetidas à privação de nitrogênio para induzir a autofagia.Em seguida, observamos as células por microscopia de fluorescência ou microscopia confocal a laser para visualizar a captação de mitocôndrias pelo VA. Os resultados obtidos mostram acúmulo de fluorescência vermelha, mas não verde, nos VAs de células privadas de nitrogênio. A pontuação indicativa de autofagia em uma população de células permite determinar o grau de mitofagia.Utilizar a rosea para monitorar a captação de mitocôndrias no vacúolo de células de levedura pode fornecer insights mecanicistas sobre o processo de mii. A abordagem pode ser adaptada para monitorar a autofagia de outros compartimentos celulares, como o núcleo, demonstrando que o procedimento será dalibor alica, um pesquisador pós-doutorando do nosso laboratório. Neste protocolo, utilizamos a linhagem selvagem BY 4 7 41 e uma linhagem mutante de deleção delta A TG três, derivada do mesmo background genético, para visualizar a localização das mitocôndrias.Nessas linhagens, eles são marcados com um repórter fluorescente. Rosea Rosea é um biossensor de emissão dupla composto por uma proteína fluorescente vermelha relativamente estável em relação ao pH e uma proteína fluorescente verde sensível ao pH. A sequência-alvo mitocondrial é utilizada para direcionar o biossensor Rosea à matriz mitocondrial.Este biossensor foi denominado Mt.Rosea, pois em pH elevado o biossensor apresenta fluorescência vermelha e verde. No entanto, em pH baixo, ele fluoresce apenas na cor vermelha. A linhagem selvagem é um controle para indicar os níveis de autofagia normalmente esperados como controle negativo.Uma linhagem nula para a expressão de um gene essencial de autofagia é adequada. Como tal linhagem não pode entregar mitocôndrias para a vacuola, procedimentos padrão são utilizados para transformar as linhagens de levedura com o plasmídeo que carrega o repórter rosala direcionado à mitocôndria. As placas de crescimento são incubadas por dois a quatro dias a 28 a 30 graus Celsius até o aparecimento de colônias com cerca de dois a três milímetros de diâmetro. Para cultivar células para indução de autofagia, inocular, para cada linhagem, uma única colônia de levedura em 10 mililitros de meio de crescimento contendo uma fonte de carbono não fermentável.Neste caso, etanol e os suplementos atróficos apropriados. Culturas duplicadas são cultivadas para cada linhagem, resultando em um total de quatro culturas. Incube as culturas de levedura por aproximadamente 48 horas a 28 a 30 graus Celsius com agitação orbital, momento em que as culturas deverão estar na fase logarítmica média de crescimento.Após o período de incubação, transfira duas amostras de um mililitro de cada cultura para tubos plásticos de centrífuga com tampa de encaixe de 1,7 mililitro. Peline as células suavemente por centrifugação em baixa velocidade. Após a centrifugação, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo sem perturbar o pellet celular.Lave as células com um mililitro de água destilada estéril por meio de ressuspensão, seguida por centrifugação. Repita a lavagem mais duas vezes para remover o meio residual. Após a terceira lavagem, ressuspender as células em 100 microlitros de meio de crescimento ou de privação de nitrogênio.O meio de privação de nitrogênio contém a fonte de carbono etanol, mas não possui suplementos de nitrogênio e induzirá autofagia nas células. Em seguida, repique as células ressuspendidas em 10 mililitros de meio de crescimento fresco ou em 10 mililitros de meio de privação de nitrogênio.Incube as culturas com agitação orbital por seis a 12 horas após a indução da autofagia. É útil confirmar a entrega de Mt Rosea aos vacúolos ácidos utilizando microscopia de fluorescência. Os vacúolos ácidos podem ser localizados por marcação com um corante fluorescente azul derivado da cumarina, como sete amino quatro cloro metil cumarina, L arginina mi cmac arg, abreviado.A marcação com ARG cmac não precisa ser realizada rotineiramente, mas é recomendada para aqueles que não estão familiarizados com a localização e aparência da vacúolo em leveduras. Para iniciar o procedimento de marcação do vacúolo, transfira amostras de um mililitro de cada cultura para tubos plásticos de centrífuga de tampa de encaixe separados de 1,7 mililitro. Em seguida, adicione ARG cmac a cada tubo.Incube os tubos a 28 a 30 graus Celsius com agitação orbital por 30 minutos. Após 30 minutos, pelotize as células por centrifugação, descarte o sobrenadante, lave as células com um mililitro de água destilada estéril por meio de suspensão, seguido de centrifugação. Lave as células mais duas vezes com água destilada estéril.Esta etapa remove o meio residual e o excesso de cmac arg die. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em 100 microlitros de água destilada estéril. As células estão agora prontas para serem montadas para imagem por microscopia de fluorescência.Ao realizar este protocolo, é muito importante utilizar culturas de levedura recentemente transformadas para garantir a obtenção de células T com mitocôndrias altamente fluorescentes. Para preparar células de levedura vivas para imagem por microscopia fluorescente, primeiro derreta dois miligramas de agarose de ponto de fusão baixa em alíquotas separadas de um mililitro de meio de crescimento e meio de privação de nitrogênio, incubando a 70 graus Celsius por uma hora; a agarose fundida é mantida a 70 graus Celsius. Para montar as células, coloque 20 microlitros de agarose fundida sobre uma lâmina de microscópio de vidro de 76 por 26 milímetros identificada.Coloque imediatamente 10 microlitros da suspensão celular lavada sobre o leito de aros. Cubra o leito de aros com uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros. As células se espalharão pela superfície de agros sob a lamínula.Em seguida, feche cuidadosamente as bordas da lamínula com uma fina camada de esmalte. Isso evitará a desidratação e o movimento da lamínula durante a aquisição de imagens. Quando o esmalte estiver completamente seco, as lâminas estarão prontas para serem observadas por microscopia de fluorescência. Células montadas usando esta técnica podem ser observadas por até uma hora após o montagem, sem quaisquer efeitos adversos aparentes sobre as células.Como as células de levedura são relativamente pequenas, você precisará de um microscópio de fluorescência de boa qualidade equipado com filtros de excitação e emissão adequados para a visualização separada da emissão de GFP e da emissão de RFP, além de uma objetiva de imersão em água de 60x com abertura numérica de 1,2. Os resultados típicos obtidos utilizando MT Rosea expressa em células selvagens e usando microscopia confocal a laser de varredura são mostrados aqui em condições não privadas de nutrientes, com etanol como fonte de carbono, enquanto as células selvagens exibem uma distribuição celular típica de mitocôndrias na periferia das células de levedura, que apresentam fluorescência vermelha e verde.A emissão de fluorescência vermelha e verde não é detectada no vacúolo. Quando células selvagens expressando MT.Rosea são submetidas à privação de nitrogênio por seis horas ou mais, elas exibem, além da fluorescência vermelha e verde correspondente às mitocôndrias, o acúmulo de fluorescência vermelha, mas não verde, no va.Esse sinal mitocondrial é indicativo de autofagia. A captação autofágica das mitocôndrias ocorre. A localização da rosea pode ser confirmada separadamente usando CMAC arg.Em contraste, as células controle negativo para mitofagia que expressam MT.Rosea observadas antes da privação nutricional e após seis horas ou mais de privação não mostram acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo. Embora a marcação mitocondrial permaneça forte para avaliar o nível de autofagia nas linhagens selvagem e mutante A TG three, mais de 200 células por linhagem foram analisadas quanto ao acúmulo de fluorescência vermelha no vacúolo antes da indução da autofagia e em pontos de tempo selecionados após a indução da autofagia. A representação gráfica da proporção de células que exibem acúmulo vacuolar revela que o grau de captação vacuolar aumenta com o tempo nas células selvagem, mas não nas células mutantes delta ATG three, que não conseguem entregar mitocôndrias ao vacúolo após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de autofagia explorarem a entrega de mitocôndrias e outros organelos, como o núcleo, ao VA e as diversas condições de crescimento nessas células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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