Name: Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a técnica de mPCR/RLB para detecção simultânea de múltiplos patógenos em amostras clínicas. Este método de alta vazão e baixo custo utiliza hibridização reversa em membrana de nylon reutilizável.

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Mateus O&#39;Sullivan e Fei Zhou são destinatários da Australian National Saúde e Pesquisa Médica do Conselho de Pós-Graduação Bolsas de Investigação Médica.

Consideração cuidadosa deve ser dada a cartilha eo projeto da sonda. Todas as seqüências disponíveis dos alvos de interesse de bancos de dados, tais como GenBank devem ser utilizados para identificar as áreas de conservação que são alvos adequados. Onde um grande número de alvos estão sendo amplificado em um ensaio mPCR única, cada seqüência amplificada deve ser de comprimento similar, e não deve exceder 300 pares de base para evitar a concorrência. Uma aplicação alternativa do método é para amplificar um alvo usando primers mais para as regiões conservadas e usar sondas múltiplas para identificar a variação de seqüência dentro do amplicon. Neste caso, o produto amplificado PCR pode ser mais longo. Temperaturas de recozimento Primer devem ser todos semelhantes, com condições de PCR ajustados em conformidade. Primers que formam estrutura secundária forte ou dímeros de primer deve ser evitado. A Sigma Aldrich DNA calculadora ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) pode ser usado para prever com segurança esses recursos. Sondas de DNA deve ser projetado para ter annealing temperaturas próximas a 60 ° C. Para maximizar a especificidade, duas sondas para cada alvo de interesse podem ser incluídos no ensaio, uma hibridação para a cadeia de DNA para a frente junto ao local de primer reverso de ligação, ea outra para a vertente inversa adjacente ao local da cartilha frente vinculativo. Neste caso, ambos os primers para a frente e reversa deve ser biotina-modificados. Se apenas uma sonda por alvo amplificado está sendo usado, então, apenas um primer precisa ser modificado biotina. Ao projetar primers e sondas para o ensaio mPCR / RLB é altamente recomendável para uso em métodos para prever silico produtos de PCR e hibridização da sonda para correlacionar com os resultados in vitro. Idealmente isto é feito utilizando isolados para os quais a seqüência do genoma inteiro está disponível. Software, tais como FastPCR (disponível em http://primerdigital.com/fastpcr.html) pode ser usado para esta finalidade. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser previsto quando da análise silico indica descasamentos de pares de bases resultando em temperaturas baixas sonda recozimento. Técnicas de extração de DNA irá variar de acordo com as amostras sendo testadas, e as condições de PCR será dependendo do desenho de primer. Os leitores são referidas publicações sobre ensaios individuais para obter mais informações sobre a extração de DNA e reagentes PCR e condições 1-19. Cada ensaio é executado com controles adequados para fornecer pelo menos um sinal da sonda positivo e um negativo para cada sonda na membrana, bem como um DNA sem controle. Além disso, é benéfico para incluir uma sondagem na parte superior da membrana que se espera que seja positiva para todas as amostras (por exemplo: uma espécie ou gênero sonda específica no caso de um microrganismo). Isto serve como uma sonda de controlo positivo, mas também permite a fácil orientação dos resultados. 1. Preparação de Membrana <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> 100ml NaHCO3 0,5 M (pH 8,4) </li><li> 100 ml NaHCO 3 0,5 M </li><li> 20 ml EDAC 16% </li><li> 250 ml NaOH 0,1 M </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - realizada em banho-maria a 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pré-aquecer o forno a 60 ° C. </li><li> Limpe o Miniblotter Immunetics com etanol 70%. </li><li> Diluir a sondas de oligonucleotídeos em 0,5 M NaHCO 3 para uma concentração final de 2 pmol / mL e um volume de 200 mL. </li><li> Corte de uma membrana de nylon BiodyneC para cm 15x15. Com um lápis e régua, regra fora de um espaço de 0,5 cm através da parte superior da membrana e escrever detalhes aqui. </li><li> Membrana de vedação em saco plástico com 20 ml solução EDAC acabado de fazer 16% e rock em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Lavar membrana em água desionizada por 30 segundos. </li><li> Membrana lugar em miniblotter com canais que atravessam a membrana (paralela à linha de lápis). Coloque almofada de apoio no lugar e mata-borrão perto. Aspirado de secreção dos canais. </li><li> Preencha raias 1 e 45 com 150 mL 0,5 M NaHCO 3. Usar 150 mL de cada solução de sonda para encher pistas 2-44 em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Se uma bolha de ar aparece no canal, mantendo a pipeta no lugar, rapidamente aspirar a solução para permitir que a bolha de ar para flutuar para o topo da pipeta, tente novamente. Incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Aspirar soluções sonda, retirar e lavar membrana em 250 ml de NaOH 0,1 M à temperatura ambiente durante 9 minutos. </li><li> Lavar membrana em 250 ml 2xSSPE por 30 segundos. </li><li> Lavar membrana em 250 ml pré-aquecido SDS 2xSSPE/0.1% em estufa a 60 ° C por 5 minutos. </li><li> Se não estiver sendo usado para a hibridização de imediato, lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 20 minutos (reservando 10 ml restantes), então selo membrana em saco plástico com 10 ml restantes 20 mM EDTA e store em geladeira a 4 ° C. </li><li> Lavar com miniblotter Pyroneg detergente e escova. Enxaguar e deixar secar. </li></ol> 2. Hibridação e Detecção <ol><li> Prepare as seguintes soluções: <ul><li> 250 ml SDS 2xSSPE/0.1% - loja em banho-maria a 60 ° C. </li><li> 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - loja em banho-maria a 60 ° C </li><li> 500 ml SDS 2xSSPE/0.5% - armazenamento em estufa a 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - manter a temperatura ambiente </li><li> 500 ml SDS 1% - loja em banho-maria a 60 ° C, inicialmente (para o passo 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - armazenar à temperatura ambiente (para o passo 3). </li></ul></li><li> Ligue uma estufa a 60 ° C e um forno a 42 ° C. Trazer a água para ferver em um copo grande numa placa de aquecimento. </li><li> Immunetics Miniblotter limpa com etanol a 70%. </li><li> Alíquota de 10 ml de SDS 2xSSPE/0.1% em um pequeno frasco. Adicionar 20 l de cada produto de PCR de 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% em tubos numerados. </li><li> Ferva produtos de PCR por 10 minutos a 100 ° C usando titulares de isopor. Colocar no gelo imediatamente para pelo menos 5 minutos. </li><li> Lavar membrana em 240 ml restantes SDS 2xSSPE/0.1% em 60 ° C forno por 5 minutos. </li><li> Membrana lugar em miniblotter com almofada de apoio. Orientar para que os canais correm verticalmente (perpendicular à linha de lápis). </li><li> Líquido de sucção excesso de canais miniblotter. </li><li> Adicionar restantes 150 mL SDS 2xSSPE/0.1% a canais primeiro e último. Adicionar produtos cozidos PCR para os canais restantes (2-44) em seqüência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. </li><li> Miniblotter lugar apartamento em 60 ° C forno por 1 hora para permitir a hibridação a ter lugar. </li><li> Líquido aspirado de cada canal, em seguida, remover membrana de miniblotter. </li><li> Lavar duas vezes na pré-aquecido 250 ml SDS 2xSSPE/0.5% em 60 C ° forno por 10 minutos. </li><li> Umedeça com malha de nylon separando SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e usá-lo para enrolar membrana. </li><li> Lugar de membrana enrolada em tubo de rolo, e desfraldar para garantir membrana confina com a superfície interior. Adicione 3 conjugado estreptavidina-peroxidase mL (Roche Applied Science) a 15 ml SDS 2xSSPE/0.5% a 42 ° C e adicionar ao tubo de rolo. Parafuso da tampa firmemente e incubar em estufa de rolos a 42 ° C por 60 minutos. Garantir a direção do rolo é tal que a membrana não aperte. Verifique periodicamente se há vazamentos. </li><li> Lavar miniblotter Pyroneg em água e detergente, enxaguar e deixar secar. </li><li> Remover membrana de tubo cilíndrico. Lavar duas vezes em permanecer 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C por 10 minutos. </li><li> Lavar duas vezes em 2xSSPE em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Ligue o forno até 80 ° C e colocar 500ml SDS 1% em forno pré-aquecido. </li><li> Compõem 15 ml Amersham solução de detecção ECL (7,5 ml da solução A e 7,5 ml de solução B). Descartar 2xSSPE e adicione solução de detecção. Rocha suavemente com a mão durante 2 minutos garantir a cobertura completa da membrana com a solução. Eliminar a solução quimioluminescente. </li><li> Corte duas folhas de plástico transparente para caber cartucho de exposição. Membrana lugar entre as duas folhas e coloque em cartucho de exposição. </li><li> Proceder à câmara escura. Sob luz vermelha, adicione filme detecção ECL para cartucho e expor por 5 minutos. Da orelha do cão-canto inferior direito do filme após a remoção para permitir a orientação correta ao ver. </li><li> Desenvolver filme com desenvolvedor automatizado ou banhos químicos como os sentidos do fabricante. </li><li> Repita exposição com tempos de exposição mais longos ou mais curtos, se necessário. </li></ol> 3. Regeneração da membrana <ol><li> Lavar membrana em 250 ml SDS 1% a 80 ° C por 30 minutos duas vezes. </li><li> Lavar membrana em 240 ml 20 mM EDTA à temperatura ambiente por 15 minutos. </li><li> Membrana de vedação em saco plástico com 10 ml de EDTA 20 mM e refrigerar a 4 ° C para futura reutilização. </li></ol> 4. Resultados representativos: Os resultados são melhores vistos por colocar o filme sobre uma grade impressa, ou digitalizar a imagem e importar para software, tais como BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Cada resultado sonda deve ser interpretada com referência à sonda de controlo positivo e negativo. Os resultados são os melhores classificados como negativo, fraco ou positivo. Resultados positivos são o lugar onde o sinal é tão forte quanto ou mais forte que a sonda de controlo positivo. Resultados negativos são o lugar onde o sinal está ausente ou igual ao controle negativo (no caso de sinal de fundo). Resultados fracos são o lugar onde o sinal é mais fraco do que a sonda de controlo positivo, mas mais forte do que o controle negativo. Resultados fracos pode ser o resultado de mutações pontuais levando a sonda de ligação fraca, ou devido a sinais não-específicos da formação de dímero primer. Usando duas sondas por alvo de interesse pode melhorar a especificidade, onde um único resultado fraco pode seguramente ser interpretado como não-específica do sinal. Se subsistirem dúvidas, a única reação de PCR-plex pode ser realizada com gel com base em detecção e seqüenciamento de qualquer amplificadorlified produto para determinar se o resultado é verdadeiramente positivo. Um resultado representativo é mostrado na figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Passo Os princípios mPCR / RLB (P1) 1.9. Sondas amina modificados são obrigados covalentemente a uma membrana de nylon. (P2) Passo 2,10. Produtos biotina modificada PCR são cruzados para as sondagens. (P3) Passo 2,14. Estreptavidina, marcado com peroxidase, é incubado com a membrana e se liga a biotina. (P4) Passos 2,19-2,21. Peroxidase catalisa uma reação no reagentes de detecção ECL, produzindo luz a que filme sensível à luz é exposta. A membrana é lavada para reutilização. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante resultado mPCR / RLB. Amostras de 1 a 6 representam os controles positivo - entre eles há pelo menos um sinal positivo para a sonda de cada uma das 43 sondas. Cada seqüência alvo (de A a U) é detectado com duas sondas diferentes para maximizar a especificidade. Sondas A1 e A2 representam sondas espécie-específicos que devem ser positivos para cada amostra e ajudar com orientação do filme. Sonda A1 é repetido na parte inferior da membrana. Amostras 7 e 8 são controles negativos. Note-se que Q1 Sondas, Q2, T1 e T2 têm sinal nos controles negativos, indicando provável ligação não específica de primers ou produto dímero primer. Re-design dessas sondas ou primers seria necessário. Sondas C1, D1 e mostrar F1 cruzando a membrana provavelmente devido a alguma absorção não-específica do conjugado estreptavidina-peroxidase e substrato quimioluminescente, porém isso é facilmente distinguida da verdadeira sonda sinais positivos. Sondas D1 e D2 têm sinal relativamente fraco em comparação com outras sondas, isto pode ser devido ao maior amplicons levando a amplificação menos eficiente. Sonda J2 é negativo é várias amostras (1, 3, 4, 6, 39) onde sonda J1 é positivo. Esta provavelmente representa uma mutação no site J2 ligação para esses exemplos.

<ol><li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li>
<li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li>
<li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li>
<li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li>
<li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%2C+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li>
<li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li>
<li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li>
<li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li>
<li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+%28mPCR%2FRLB%29+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+%28mPCR%2FRLB%29+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método mPCR / RLB permite a detecção simultânea de um grande número de amplicons PCR. Devido à alta sensibilidade de detecção da sonda baseada quimioluminescente, a única reação de PCR multiplex com grande número de pares de primers podem ser usados ​​para amplificar o modelo de DNA. Se não houver sinais de sonda são obtidos com uma ou mais amostras, realização de eletroforese em gel com qualquer produto PCR restantes podem ajudar a distinguir se o problema é com a amplificação ou a hibridização da sonda. Onde todos os sinais da sonda na membrana são fracos ou ausentes, mas indica eletroforese em gel de amplificação por PCR de sucesso, possibilidades incluem problemas com a rotulagem de membrana, a regeneração incorreta da membrana após o uso anterior, as temperaturas incorretas durante a incubação de hibridação ou estreptavidina, ou com defeito estreptavidina- conjugado peroxidase ou reagente de detecção. Se as amostras de controle indicam que as sondas individuais podem estar produzindo falsos sinais negativos, a PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subseqüente pode ser realizado para verificar a amplificação do produto de PCR e de olhar para a variação de seqüência no local da sonda de ligação. Sinal da sonda fraco ou ausente pode ser devido ao tamanho do amplicon grande: se possível todos os amplicons deve ser de comprimento similar e menos de 300 bp. Estruturas secundárias de DNA amplicons também pode produzir vinculativo sonda pobres, e pode necessitar de re-design de primers. Cartilha individuais ou concentrações de teste também pode ser variado para otimizar a força do sinal. Falso-positivos devido à ligação dos primers sonda não amplificados ou primer dimer-produto pode ser investigado através da realização de PCR simples com gel com base em seqüenciamento de detecção e subsequente. Se isso ocorrer, o redesenho das sondas podem ser necessárias. Mutações pontuais em locais de ligação da sonda pode levar a sinais fracos ou ausentes. Permitindo duas sondas para cada produto amplificado torna isso fácil de detectar. Esta característica pode ser explorada com primer cuidadoso e design sonda para detectar variações na seqüência pequena do DNA alvo. Em resumo, embora existam muitos métodos de detecção de produto seguintes reações multiplex PCR disponíveis, mPCR / RLB tem a vantagem de ser de alto rendimento e baixo custo de instalação com baixo-custo. A flexibilidade do método permite a sua utilização em uma ampla gama de aplicações.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 5 &#39;amina C6 modificada sondas de oligonucleotídeos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> Solução 0,5 M feitas até pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M solução </td></tr><tr><td> 20xSSPE tampão </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Compõem solução estoque 10%, não autoclave, deve ser mantida por 1 semana no máximo antes de usar </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Compõem solução 0,5 M ajustada a pH 8,0 e autoclave </td></tr><tr><td> N-(3-dimetilaminopropil)-N &#39;ethylcarbodiimide-cloridrato (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Compõem a 20 ml de solução 16% pouco antes de usar usando 3,2 g EDAC e 18 ml de água Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 mM centímetros de membrana de nylon 20x20 </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionizada, água purificada </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Detergente líquido Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-peroxidase conjugada </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detecção de reagentes </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL detecção de reagentes </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Transparências OHP </td><td> Corporate Express </td><td> OHP EXP 504 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham hyperfilm ECL alto desempenho filme quimioluminescente 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Gelo </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Consumíveis utilizados no ensaio mPCR / RLB. <table border="1"><tbody><tr><th> Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Hybaid Fornos Shake&#39;n&#39;Stack (2) garrafa rolando e tela de náilon que separa </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Método pode ser realizado com um único forno, desde que haja facilidade para manutenção de soluções a 42 ° C e 60 ° C antes do uso </td></tr><tr><td> A plataforma de balanço Belly Dancer </td><td> Stovall ciências da vida </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sucção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chapa elétrica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cartucho de exposição </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> X-ray desenvolvedor filme </td><td></td><td></td><td> Também pode usar fixador desenvolvedor, e água em bandejas, em quarto escuro em vez de automáticodesenvolvedor. Lumino-imager também pode ser usado em vez do filme de Raio X </td></tr></tbody></table> Equipamentos tabela 2. Necessárias para o ensaio mPCR / RLB.

multiplex pcr e hibridação reversa linha assay blot (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR / Reverse Linha ensaio de hibridação Blot permite a detecção de até 43 alvos moleculares em 43 amostras, utilizando uma reação de PCR multiplex seguida de hibridização da sonda em uma membrana de nylon, que é reutilizável. Sondas são 5 &#39;amina modificada para permitir a fixação à membrana. Primers são 5 &#39;biotina modificados que permite a detecção de produtos hibridizados PCR usando estreptavidina-peroxidase e um substrato quimioluminescente via filme fotossensível. Com uma configuração baixa e custos de consumíveis, esta técnica é barata (cerca de EUA $ 2 por exemplo), alta taxa de transferência (membranas múltiplas podem ser processadas simultaneamente) e tem um tempo de resposta curto (cerca de 10 horas). A técnica pode ser utilizada em um número de maneiras. Sondas múltiplas podem ser projetados para detectar variação da seqüência dentro de um único produto amplificado, ou vários produtos podem ser amplificados simultaneamente, com uma (ou mais) sondas utilizadas para a detecção subseqüente. A combinação das duas abordagens também podem ser usados ​​dentro de um único ensaio. A capacidade de incluir sondas múltiplas para uma seqüência alvo único torna o ensaio altamente específico. Publicado em aplicações de mPCR / RLB incluem a detecção de antibióticos 1,2 genes de resistência, a digitação de Staphylococcus aureus resistente à meticilina 3-5 e Salmonella sp 6, sorotipagem molecular de Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 e enterovírus 10,11, a identificação de Mycobacterium sp 12, detecção de 13-15 genital e do trato respiratório 16 e outros 17 agentes patogênicos e detecção e identificação de molicutes 18. No entanto, a versatilidade da técnica significa as aplicações são praticamente ilimitadas e não se restringe à análise molecular de microrganismos. As cinco etapas em mPCR / RLB é um Primer) e design Probe, b) extração do DNA e amplificação c) Preparação da membrana, d) Hibridação e detecção e e) Regeneração da membrana.

Um barato, o método de elevada capacidade para detecção simultânea de até 43 alvos moleculares é descrito. Aplicações de mPCR / RLB incluem digitando microbiana e detecção de patógenos múltiplos a partir de amostras clínicas.

Multiplex PCR e hibridação reversa Linha Assay Blot (mPCR / RLB)

O ensaio de PCR multiplex/hibridização por reverse line blot permite a detecção de até 43 alvos moleculares em 43 amostras utilizando uma única reação de PCR multiplex...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a presença ou ausência de um painel de sequências específicas de ácidos nucleicos previamente amplificadas em uma reação de PCR multiplex. Isso é realizado fixando-se primeiramente sondas de DNA marcadas com amina em uma membrana de náilon reutilizável. Em seguida, os produtos da PCR marcados com biotina são hibridizados às sondas ligadas à membrana e à estreptoavidina conjugada à peroxidase.O conjugado é adicionado aos produtos da PCR ligados. Em seguida, os produtos da PCR ligados são detectados pela adição de reagentes de detecção quimioluminescentes e pela exposição da membrana a filme radiográfico de alta sensibilidade. Por fim, a membrana é lavada para remover os produtos da PCR hibridizados, permitindo seu reuso em ensaios futuros.No final, podem-se obter resultados que demonstram a hibridização dos produtos de PCR com as sondas ligadas à membrana, visíveis no filme de raios X. As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como PCR multiplex com eletroforese em gel, PCR em tempo real ou microarranjos, são seu alto rendimento, velocidade relativamente rápida, ausência de necessidade de equipamentos especializados e, mais importante, seu baixo custo. Antes de iniciar, prepare as seguintes soluções de acordo com a parte escrita deste protocolo.Para preparar a membrana, preaqueça o forno a 60 graus Celsius. Limpe o miniblotter com etanol 70%, dilua as sondas de oligonucleotídeos em bicarbonato de sódio 0,5 molar até uma concentração final de dois picomoles por microlitro e um volume de 200 microlitros. Corte a membrana de nilon em 15 por 15 centímetros, use lápis e régua para marcar um espaço de 0,5 centímetro ao longo da parte superior da membrana e anote ali os detalhes do experimento.Selar a membrana em um saco plástico com 20 mililitros de solução recém-preparada de EDAC 16% e agitar em temperatura ambiente por 10 minutos. Lavar a membrana com água desionizada por 30 segundos. Em seguida, colocar a membrana em um mini blotter com canais dispostos transversalmente à membrana.Em seguida, coloque a almofada de suporte no lugar e feche o blotter. Aspire completamente qualquer fluido dos canais. Encha as pistas 1 e 45 com 150 microlitros de bicarbonato de sódio 0,5 molar.Use 150 microlitros de cada solução de sonda para preencher as linhas de dois a 44 em sequência, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. Se uma bolha de ar aparecer no canal, mantenha a pipeta no lugar e aspire rapidamente a solução para permitir que a bolha de ar suba até o topo da ponteira da pipeta, depois tente novamente. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos.Aspire as soluções do marcador. Remova a membrana e lave-a em 250 mililitros de hidróxido de sódio 0,1 molar, à temperatura ambiente, durante nove minutos. Lave a membrana em 250 mililitros de SSPE 2X por 30 segundos.Em seguida, lave-o em 250 mililitros de SSPE 2x pré-aquecido com 0,1% de SDS em estufa a 60 graus Celsius por cinco minutos, caso não vá ser usado imediatamente para hibridização. Lave a membrana em 240 mililitros de EDTA 20 milimolar à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, conserve a membrana em um saco plástico com os 10 mililitros restantes de EDTA 20 milimolar e armazene a quatro graus Celsius.Por fim, lave o mini blosser com detergente para pescoço piró e uma escova, enxágue e deixe secar em multiplex. A amplificação por PCR dos alvos de interesse não é descrita nesta demonstração, mas deve ser realizada antes da hibridização. Antes de iniciar o procedimento de hibridização, prepare as seguintes soluções de acordo com a parte escrita deste protocolo.Ligue um forno e ajuste para 60 graus Celsius e outro forno para 42 graus Celsius. Aqueça a água até a fervura em um béquer grande sobre uma placa aquecedora. Limpe o mini blotter com etanol 70%.A seguir, retire uma alíquota de 10 mililitros de SSPE 2× com 0,1% de SDS em um recipiente pequeno. Em seguida, adicione 20 microlitros de cada produto de PCR a 150 microlitros de SSPE 2× com 0,1% de SDS em tubos numerados. Ferva os produtos de PCR por 10 minutos a 100 graus Celsius, utilizando suportes de isopor, e coloque imediatamente no gelo por pelo menos cinco minutos.Lave a membrana nos 240 mililitros restantes de SSPE 2x com 0,1% de SDS no forno a 60 graus Celsius por cinco minutos. Coloque a membrana no mini blotter com a almofada de suporte. Oriente-a de modo que os canais fiquem na vertical.Aspire o líquido excedente dos canais do mini blotter. Adicione os 150 microlitros restantes de SSPE 2x com 0,1% de SDS aos canais primeiro e último. Adicione os produtos de PCR fervidos sequencialmente aos canais de 2 a 44, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.Coloque o miniblotter plano no forno a 60 graus Celsius por uma hora para permitir que a hibridização ocorra. Pulverize o líquido de cada canal. Em seguida, remova a membrana do miniblotter.Lave duas vezes com 250 mililitros de SSPE 2X, 0,5% de SDS, em forno a 60 graus Celsius por 10 minutos. Umedeça o suporte de náilon com SSPE 2X, 0,5% de SDS a 42 graus Celsius e utilize-o para enrolar a membrana. Coloque a membrana enrolada em um tubo rotativo e gire para garantir que a membrana fique aderida à superfície interna.Adicione três microlitros de strept AD em conjugado com peroxidase a 15 mililitros de SSPE duas vezes, 0,5% SDS a 42 graus Celsius e adicione ao tubo. Parafuse a tampa firmemente e incube no forno rotativo a 42 graus Celsius por 60 minutos. Certifique-se de que o sentido da rotação seja tal que a membrana não fique tensionada.Verifique periodicamente vazamentos. Lave o mini blotter com detergente pyro neck e enxágue com água, deixando secar. Remova a membrana do tubo rolo e lave duas vezes no restante SSPE 0,5% SDS a 42 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, lave duas vezes em SSPE duas vezes à temperatura ambiente por cinco minutos. Aumente a temperatura dos dois fornos para 80 graus Celsius e coloque 500 mililitros de SDS 1% em um dos fornos para pré-aquecer. Prepare a solução de ECL e incube a membrana na solução de detecção ECL por dois minutos.Em seguida, exponha a membrana ao filme e desenvolva. Repita a exposição com tempos mais longos ou mais curtos, se necessário, para regenerar a membrana. Lave-a duas vezes com 250 mililitros de SDS 1% a 80 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, lave com 240 mililitros de EDTA 20 milimolar à temperatura ambiente por 15 minutos. Sobre o papel de filtro, adicione 10 mililitros de EDTA 20 milimolar, coloque em um saco plástico fechado e armazene sob refrigeração a quatro graus Celsius para reutilização futura. Esta figura mostra os resultados de um ensaio de hibridização multiplex por PCR em linha reversa. As amostras de um a seis representam controles positivos entre si.Existe pelo menos um sinal positivo de sonda para cada uma das 43 sondas. Cada sequência-alvo de A a U é detectada com duas sondas diferentes para maximizar a especificidade das sondas. A uma e a dois representam sondas específicas de espécie, que se espera serem positivas para cada amostra e auxiliam na orientação da sonda em filme.Um é repetido na parte inferior da membrana. As amostras sete e oito são controles negativos. Observe que as sondas Q1, Q2, T um e T dois apresentam sinal nos controles negativos, indicando ligação inespecífica provável dos iniciadores ou dímero de iniciadores.Seria necessário o redesenho dos produtos dessas sondas ou iniciadores, C um, D um e F1 mostram manchas ao longo da membrana, provavelmente devido à alguma captação não específica da estreptavidina conjugada à peroxidase ou ao substrato quimioluminescente. No entanto, isso é facilmente distinguido das sondas verdadeiramente positivas. As sondas D um e D dois apresentam sinais relativamente fracos em comparação com as demais sondas.Isso pode ser devido a amplicons maiores que levam a uma amplificação menos eficiente. Por fim, a sonda J dois é negativa em várias amostras em que a sonda J um é positiva. Isso muito provavelmente representa uma mutação no sítio de ligação da J dois para essas amostras.Uma vez dominada esta técnica, desde a extração de DNA até a hibridização por PCR Pro, interpretação dos resultados e regeneração da membrana, tudo pode ser realizado em menos de 10 horas.

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Research

JoVE Journal

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