Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens do órgão de corti com preservação máxima da arquitetura celular. Isso é conseguido seccionando, dissecando e fixando as orelhas internas com um vibrato para obter seções espessas, minimizando o número de superfícies de corte por coclear. Os cortes de Vibram são então corados por imuno-histoquímica, que permite a identificação de vários tipos de células e estruturas celulares no órgão de corti.

Em seguida, as seções são montadas e fotografadas por microscopia confocal para obter imagens de alta resolução que definem as posições Z Ao longo de cada seção Vibram espessa são obtidos resultados que permitem a microscopia confocal das células e estruturas no órgão de corti com o mínimo de interrupção pelo processo de seccionamento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como parafina e criossecção, é que os danos físicos à cóclea são minimizados, permitindo uma melhor preservação da arquitetura celular do órgão de corda para isolar o ouvido interno. Primeiro, decapite um camundongo adulto sacrificado usando uma lâmina de barbear.

Abra o crânio ao longo da linha média e, em seguida, remova o cérebro para expor cada orelha usando uma pinça com cuidado, retire as duas orelhas internas. Mergulhe os ouvidos internos em um frasco de tubo criogênico de formaldeído fresco a 4% e balance-o suavemente durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave o fixador com três trocas de solução salina tamponada com fosfato, descalcifique o tecido adulto incubando em EDTA a 10% a quatro graus Celsius por cinco dias.

Enxágue e armazene os ouvidos internos em um PBS de uma vez até que estejam prontos para o processamento. Faça 4% de baixo ponto de fusão de aros adicionando o aros a uma vez PBS e leve ao micro-ondas até que o aros esteja em solução. Mantenha o aros fundido em banho-maria a 55 graus Celsius até a hora de usar.

Remova o ouvido interno do PBS usando uma pinça e posicione-o na parte inferior de um peeling. Incorporando o molde, pipete qualquer líquido restante e, em seguida, preencha o molde com mol e aros cobrindo completamente o ouvido interno para gerar seções transversais através do órgão de corti. Posicione o ouvido interno de forma que seja visto lateralmente com o canal semicircular lateral.

Ângulo visível, o ouvido interno, de modo que a linha formada pela região mais posterior da cóclea esteja em um ângulo de 45 graus em relação ao plano de secção pretendido. Assim que o agros solidificar, retire o molde de plástico. Use uma lâmina de barbear para aparar o excesso de aros e criar um cubo.

Certifique-se de deixar aros ao redor suficientes para manter o tecido bem suportado. Durante o corte, prenda a base do cubo agros à superfície de corte Vibram usando uma seção de super cola com 40 a 100 mícrons de espessura e colete as fatias em um prato de uma vez PBS com 0,1% Triton X 100. Usando fórceps.

Disseque o aros longe das seções de tecido. Transfira as seções para um prato seu PBS fresco com 0,1% Triton X 100, usando uma ponta de pipeta com uma abertura larga e prossiga com a coloração de anticorpos em uma placa de cultura de tecidos. Após a conclusão da coloração do anticorpo, as seções de tecido são montadas em uma lâmina de microscópio.

Para evitar o esmagamento das seções de tecido grosso, coloque uma camada de graxa a vácuo em um quadrado ao redor da seção para criar espaço entre a lamínula e a lâmina. Transfira a seção de tecido para uma lâmina de microscópio. Pressione as bordas da lamínula com firmeza para criar uma vedação.

Alternativamente, canalize ETA um ponto de microlitro de cromatografia aros, resina de tamanho de malha conhecido em cada um dos quatro cantos onde a lamínula ficará repousa, coloque a tampa, deslize e sele as bordas com esmalte antes de obter imagens na primeira imagem de um Zack confocal através de um órgão de seção cor T, as células ciliadas internas adjacentes às células ciliadas internas, células ciliadas externas e células dieter são visíveis. Quando a coloração nuclear, as células pilares são visíveis pela coloração do anticorpo S 100 e aparecem amarelas. À medida que o Zack progride pela seção em etapas de três mícrons, o número de células pilares pode ser contado observando o aparecimento e desaparecimento de seus núcleos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como seccionar o ouvido interno por vibram, realizar imuno-histoquímica nessas seções e, em seguida, obter imagens por microscopia confocal. Este procedimento simples, que é generalizável para qualquer anticorpo, garante a preservação máxima da organização celular do órgão de corde.