Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens do órgão de Corti com preservação máxima da arquitetura celular. Isso é alcançado por meio do corte de ouvidos internos dissecados e fixados com um vibrátomo, obtendo-se seções espessas enquanto se minimiza o número de superfícies cortadas por cóclea. As seções obtidas com o vibrátomo são então coradas por imunohistoquímica, o que permite a identificação de diversos tipos celulares e estruturas celulares no órgão de Corti.

Em seguida, as secções são montadas e analisadas por microscopia confocal para obter imagens de alta resolução que definem as posições em Z ao longo de cada secção espessa de Vibram. Os resultados obtidos permitem a microscopia confocal das células e estruturas do órgão de Corti com mínima perturbação pelo processo de corte. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a inclusão em parafina e a criossecção, é que os danos físicos à cóclea são minimizados, permitindo uma melhor preservação da arquitetura celular do órgão de Corti. Para isolar a orelha interna, primeiro decapite um camundongo adulto eutanasiado utilizando uma lâmina de barbear.

Abra o crânio ao longo da linha média e, em seguida, remova o cérebro para expor cada ouvido usando pinça cuidadosamente, retirando ambos os ouvidos internos. Mergulhe os ouvidos internos em um tubo criogênico com paraformaldeído fresco a 4%, e agite suavemente durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave o fixador com três trocas de solução salina tamponada com fosfato uma vez, descalcifique o tecido adulto incubando em EDTA a 10% a quatro graus Celsius por cinco dias.

Lave e armazene os ouvidos internos em PBS 1× até o momento do processamento. Prepare agarose de baixo ponto de fusão 4% adicionando a agarose ao PBS 1× e aquecendo em forno de micro-ondas até que a agarose esteja em solução. Mantenha a agarose fundida em banho-maria a 55 graus Celsius até o momento do uso.

Remova o ouvido interno do PBS usando pinças e posicione-o na parte inferior de uma molde de inclusão descartável. Aspire qualquer líquido remanescente e, em seguida, preencha o molde com mol e aros, cobrindo completamente o ouvido interno para gerar cortes transversais através do órgão de Corti. Posicione o ouvido interno de modo que seja visualizado lateralmente, com o canal semicircular lateral.

Ângulo visível, a orelha interna de modo que a linha formada pela região mais posterior da cóclea esteja em um ângulo de 45 graus em relação ao plano pretendido de corte. Uma vez que o aros tenha solidificado, retire o molde plástico. Use uma lâmina de barbear para remover o excesso de aros e criar um cubo.

Certificando-se de deixar arros suficientes ao redor para manter o tecido bem sustentado. Durante o corte, fixe a base do cubo de agros à superfície de corte do Vibram usando cola instantânea, seccionando com espessura de 40 a 100 mícrons e coletando as fatias em uma placa contendo PBS uma vez com 0,1% de Triton X-100. Utilizando pinça.

Disseque os aros afastando-os das seções de tecido. Transfira as seções para um recipiente com PBS fresco 1x contendo 0,1% de Triton X-100, utilizando uma ponteira de pipeta com abertura ampla, e prossiga com a coloração por anticorpos em uma placa de cultura de tecidos. Após a conclusão da coloração por anticorpos, as seções de tecido são montadas sobre uma lâmina de microscópio.

Para evitar esmagar os cortes espessos de tecido, coloque uma camada de graxa de vácuo em um quadrado ao redor do corte para criar espaço entre a lamínula e a lâmina. Transfira o corte de tecido para uma lâmina de microscópio. Pressione firmemente as bordas da lamínula para criar um selo.

Alternativamente, aplique por pipeta um ponto de um microlitro de cromatografia ETA, resina de tamanho de malha conhecido em cada um dos quatro cantos onde a lamínula irá repousar, posicione a lamínula e vede as bordas com esmalte antes da aquisição da primeira imagem em um microscópio confocal Zack através de uma seção transversal de um órgão de Corti. As células ciliadas internas, células ciliadas internas adjacentes, células ciliadas externas e células de Dieters são visíveis. Com a coloração nuclear, as células de suporte são visíveis pela coloração com anticorpo S-100 e aparecem amarelas. À medida que o Zack avança pela seção em etapas de três mícrons, o número de células de suporte pode ser contado observando o aparecimento e desaparecimento de seus núcleos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como seccionar a orelha interna por vibram, realizar imunohistoquímica nestes cortes e, em seguida, obter imagens por microscopia confocal. Este procedimento simples, que pode ser generalizado para qualquer anticorpo, garante a preservação máxima da organização celular do órgão de Corti.