Name: Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a usar calorimetria isotérmica de titulação para estudar interações ligante-macromolécula em bioquímica. Este método determina entalpia e entropia de ligação em um único experimento com E. coli dihidrofolato redutase.

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Este trabalho foi financiado pela NSF conceder MCB-0817827.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem estabelecida que pode determinar todos os parâmetros termodinâmicos (afinidade, entalpia e estequiometria) de uma interação obrigatório em um experimento 1. ITC obras de titulação um reagente em um segundo reagente sob condições isotérmicas. O sinal medido é o calor liberado ou absorvido na interação (ligação) dos dois reagentes. Uma série de injeções são realizadas eo sinal de calor abordagem zero como o reagente limitante torna-se saturado. Ajuste da isoterma dá os parâmetros termodinâmicos. Várias revisões estão disponíveis que descrevem a instrumentação, bem como as contas de coleta de dados e análise. 2,3 calorímetros Enquanto outros estão disponíveis (mais notadamente o ITC 200 com pequenos volumes), aqui nós descrevemos um protocolo geral para a VP-ITC fabricados por MicroCal (agora parte da GE Healthcare). 1. Amostras preparar <ol><li> A fim de preparar a macromolécula e ligante no buffer, algumas possíveis questões precisam ser abordadas. Se encaixa rigorosos exigem concentrações adequadas da macromolécula, a espécie que normalmente entra na célula amostra do ITC, e ligante, as espécies na seringa de injeção. Porque algumas proteínas agregadas à alta concentração necessária para a espécie na seringa de injeção, na maioria das vezes a proteína é carregada para dentro da célula da amostra. A concentração macromolécula ideal é determinada a partir de "c", o produto da afinidade previsto do sistema, que pode ser estimada utilizando métodos ortogonais antes de usar ITC, ea concentração macromolécula total, onde c = K a * [M]. Valores ótimos de gama c 1-10, 1 embora seja possível obter dados precisos para a fraca ligação de sistemas sob condições específicas experimental com c-valores abaixo do limite inferior. 4 Assim, a concentração deve ser determinada macromolécula com esta gama de c valores em mente (ou seja, para um K a de 10 6 M -1, as concentrações de macromolécula de 1-10 mM deve ser usado). Conhecimento prévio da afinidade de ligação do sistema pode ajudar a minimizar a proteína utilizada para ITC através de uma melhor concepção da experiência ITC. A concentração do ligante deve ser suficientemente grande (7-25 vezes mais concentrado do que o K d para o site mais fraca ligação do ligando), de modo que a saturação ocorre no primeiro terço a metade da titulação. Montagem precisa dos dados também requer a saturação do sinal. Para sistemas com maior afinidade de ligação, uma menor concentração de ligante deve ser usado para evitar a saturação muito cedo na titulação, o que dará se encaixa imprecisas. Uma vez que o calor de controle de diluição (ou seja, a titulação do ligante em buffer) foi subtraído da titulação, a entalpia de saturação deve ser quase nula. </li><li> Porque impurezas pequena molécula pode dar origem a sinais artifactual nas medições ITC, é melhor, se possível, que a macromolécula e ligante ser exaustivamente dialisadas contra tampão. Alternativamente, cromatografia de coluna, dessalinização colunas spin, ou filtros de buffer troca centrífuga (por exemplo, Centricons) pode ser usado para alterar o buffer da macromolécula. Se o ligante é uma molécula pequena, ela pode ser preparado usando o buffer de diálise após a macromolécula dialisada foi ou por diálise contra membranas de diálise com cortes adequados para pequenas moléculas (ou seja, 100-500 Da para um Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e soluções macromolécula pode levar ao sinal de artefatos a partir do calor da diluição de impurezas nas amostras. Após o preparo, certifique-se o pH da partida macromolécula buffer, e ligante (± 0,05 unidades de pH) como artefatos na entalpia podem surgir devido ao buffer efeitos protonação. 5 Certifique-se de preparar o suficiente de cada espécie. Para experimentos triplicado e um controle de diluição, a quantidade de material necessário vai depender do ITC usado. Mas, para instrumentos mais ITC que têm aproximadamente 2 ml de células da amostra de volume, pelo menos 6-7 ml de solução de macromolécula serão necessários, e pode ser convenientemente preparadas em tubos de 15 ml falcão. Para 300 mL seringas de injeção, 1-2 ml de solução deve ser adequada, e pode ser preparado em tubos ou falcon ou tubos de microcentrífuga. </li><li> , Poeira e outras partículas, pode causar artefatos na linha de base do thermogram ITC. É imperativo que eles sejam removidos antes de executar o experimento. Após a preparação das soluções de reserva da amostra, as amostras devem ser centrifugadas em tubos de microcentrífuga por cinco minutos em 8000 para 14.000 RPM a partículas de pelotas na solução. Remover o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e colocá-lo em um novo tubo falcon / microcentrífuga. Se redutores são necessários para manter cisteínas reduzidas, use baixas concentrações e estoques fresca de β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxila) fosfina) ou ditiotreitol para minimizar qualquer tipo de artefato devido à oxidação redutor. Além disso, a presença de solventes orgânicos no tampão (comum para alguns ligantes pequena molécula que pode precisar de metanol ou DMSO, a fim de ser solúvel) pode causar artefatos de sinal. Se solventes orgânicos são necessários para o ligante, então a solução macromolécula também deve conter a mesma concentração para evitar qualquer sinal decorrentes do calor de diluição do solvente orgânico. Pequenas diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e macromolécula devido à cosolventes, sais ou pH são possíveis durante a preparação das amostras. É melhor para verificar a diluição do ligante para o buffer de amostras ou o tampão de amostra para a macromolécula para garantir que os sinais de calor resultantes de diferenças no conteúdo de buffer não causar dados decorrentes exclusivamente de artefatos. </li><li> Verificar a concentração da macromolécula e ligante cuidadosamente usando técnicas adequadas ao seu sistema (como as medidas de absorbância, HPLC, ensaios colorimétricos, ensaios BCA para proteínas, etc) para gravar as suas concentrações exatas. Diferenças na concentração real ea concentração usada para se ajustar à isoterma irá causar erros no estequiometria, entalpia e afinidade de ligação determinado a partir da experiência. É comum degas as amostras para evitar artefatos de sinal devido a bolhas de ar ou a liberação de gases dissolvidos durante a titulação, especialmente em altas temperaturas. </li></ol> 2. Configurando o Experimento <ol><li> Verifique se a célula de amostra e uma seringa de injeção são limpos de acordo com o protocolo do fabricante antes de carregar o macromolécula e ligante. Lavar a célula de amostra duas ou três vezes com 1,8 ml de água destilada utilizando a seringa Hamilton (use o cuidado com a seringa de Hamilton como o barril é facilmente quebrada ou a inclinação da agulha). Em seguida enxaguar a célula de amostra várias vezes com 1,8 ml de tampão. Carregar a célula de amostra com 1,8 ml de solução de macromolécula, tomando cuidado para evitar formação de bolhas. </li><li> Preencher a célula de referência com água destilada. Para a maioria dos buffers, água destilada é bom para usar como a solução de referência. No entanto, para buffers com particularmente elevada força iônica ou osmolaridade, é melhor usar o buffer como uma referência. </li><li> Remover bolhas de ar a partir das células de referência e de exemplo usando a seringa Hamilton. Suavemente move a agulha da seringa para cima e para baixo os lados da célula batendo as bolhas que podem estar no fundo da célula e anexado ao poço para o topo da célula. Remova qualquer excesso de volume da amostra e células de referência. </li><li> Anexar uma seringa de plástico para o porto de preenchimento da seringa utilizando tubos. Enxágüe a seringa com água destilada. Siga por um buffer de enxaguar. Certifique-se a seringa de injeção é completamente evacuado por ar através do desenho do sistema. Coloque a agulha da seringa na solução ligante e desenhar a solução ligante com a seringa de injeção até que a seringa inteira está cheia. Continuar a desenhar um pequeno volume em excesso (aproximadamente 50 mL ou mais) à porta e tubos em anexo. Imediatamente fechar a porta de preenchimento de a seringa e retire a seringa tubo e plástico. Purge e reabastecer a seringa de injeção mais duas vezes para remover as bolhas da seringa. Retire a seringa com a solução ligante e limpe o lado com uma kimwipe para remover todas as gotas, tomando cuidado para não tocar a ponta da seringa na kimwipe, pois isso pode remover o volume da seringa. Além disso, tenha cuidado para não bater ou jar a seringa como este também pode causar perda de volume da ponta da seringa. Coloque a seringa dentro da célula da amostra. </li><li> Configurar os parâmetros para a execução do ITC. Para os sistemas de ligação com sinais de calor forte, um grande número de injeções de baixo volume vai dar mais pontos de dados para a montagem (por exemplo, 75 injeções de 3 mL). Para sistemas que têm sinais de calor fraco, um pequeno número de injeções de grande volume são preferíveis (por exemplo, 33 injeções de 8 mL). Mais comumente, menos injeções com maiores volumes de injeção são utilizados. Pode levar várias titulações para otimizar as condições que são melhores para seu sistema. É importante notar que a entalpia de ligação pode ser exotérmico ou endotérmico, dependendo do sistema que está sendo estudado. Infelizmente, alguns sistemas têm sinais de fogo baixo, fazendo com que o calor de reação difícil de determinar. Problemas com tais sistemas podem potencialmente ser superado pelo aumento da concentração da macromolécula, alterar a temperatura do experimento (dependendo da capacidade de calor do sistema de ligação), e / ou alterar o pH ou força iônica do buffer. </li><li> Considere também o espaçamento de tempo entre cada injeção. É imperativo que após cada injecção de ligante, o sistema é dado tempo para o equilíbrio e o sinal de calor retorna à linha de base antes da próxima injeção ocorre. Para a maioria dos sistemas, 3-5 minutos deve ser adequada. O tempo entre as injeções deve ser aumentada para sistemas onde o equilíbrio não ocorre em cinco minutos. </li><li> Porque haverá alguma mistura entre a macromolécula e soluções de ligante na seringa de injeção, uma vez que é inserido na célula de amostra, a primeira injecção dará resultados espúrios. É melhor usar pequenos volumes (eg 2 mL) para o primeiro ou duas injeções (para que eles possam mais tarde ser descartado) e manter as injeções subseqüentes os valores desejados. </li><li> Escolha a temperatura do experimento (com 25 ° C sendo o mais comum, embora as temperaturas entre 2 e 80 ° C pode ser usada). O melhor é escolher uma temperatura que corresponde outros experimentos (ligação, cinética, etc) realizadas no sistema ligante macromolécula. O ITC pode ser configurado para equilibrar a uma temperatura diferente da temperatura do experimento. Se a experiência vai ser realizada a uma temperatura superior a 10 ° C, longe de temperatura ambiente, então é melhor para definir a temperatura de equilíbrio para o instrumento no prazo de 5 ° C da temperatura experimental. Isto irá diminuir o tempo que o instrumento vai demorar para atingir a temperatura do experimento. A velocidade de agitação da seringa também precisa ser considerado. Agitação é necessária para a mistura adequada do ligante e macromoléculas durante a titulação, mas algumas proteínas são desestabilizadas por meio de agitadores rápidos. Para esses casos, a velocidade de agitação deve ser fixado em uma taxa relativamente baixa. Depois que todos os parâmetros experimentais foram criados, em seguida, o experimento pode ser iniciado. </li><li> Uma vez que o experimento tenha terminado, a ITC podem ser limpos de acordo com o protocolo do fabricante. A solução na célula de amostra no final do experimento pode ser mantida se experimentos adicionais sobre a mistura macromolécula-ligante complexos são desejados. </li><li> Repita a titulação, pelo menos, uma ou duas vezes mais para obter dados reprodutíveis. Executar um controle onde o ligante é titulada no buffer na célula de amostra para determinar o calor de diluição para o ligante. Para alguns sistemas onde há cooperativas de informação, de ligação adicionais sobre o processo de ligação pode ser obtida através da injeção da macromolécula no ligante. As orientações de injecção diferentes pode dar informações adicionais, que podem ser úteis para a montagem global. 6 </li></ol> 3. Analisando os dados <ol><li> Ajuste dos dados pode ser facilmente realizada utilizando macros em qualquer programa de ajuste de dados (normalmente fornecido pelo fabricante juntamente com o instrumento). Carregar o arquivo de dados em primeiro lugar. Verifique o termograma-prima para todos os sinais de bolhas de ar ou outros artefatos no sinal. Se houver qualquer tipo de artefato (como picos na linha de base ou picos, quando não havia injeção naquele ponto do tempo), em seguida, observe esses pontos dados como eles devem ser removidos. Em seguida, carregar o ligante dados de controle de diluição, e subtrair os dados ligante de diluição a partir da isoterma de ligação. Neste momento, remova todos os pontos de dados espúrios, incluindo o primeiro de um ou dois pontos de dados da titulação, onde artefatos de diluição ocorrer (consulte a etapa 7). </li><li> Selecione o modelo de dados apropriado (um sítio de ligação, dois / múltiplos sítios de ligação, ligação cooperativa, etc) a ser utilizado para ajustar os dados. Os dados podem ser inseridos com estimativas iniciais dos parâmetros de ajuste, estequiometria (n), entalpia (DH) e afinidade de ligação (K a). Se o conhecimento prévio da afinidade de ligação, ou outros parâmetros, é conhecida a partir de experimentos ortogonal, então estes valores podem ser inseridos. Isso ajuda a evitar o ajuste de ficar preso em mínimos locais durante a montagem. Depois que os dados estejam em boa forma para a primeira titulação, repita os passos 15 e 16 para o resto das isotermas. Alternativamente, os dados podem estar em forma globalmente usando programas como o SEDPHAT 6. SEDPHAT pode ser particularmente útil na montagem global de conjuntos de dados complexos binários (isto é, moléculas de A + B) em combinação com conjuntos de dados complexos ternários (moléculas de A + B + C). Por exemplo, na ligação da molécula de C a um complexo AB, nem sempre é claro se pode haver qualquer sinal devido à ligação de C para A ou de B para A (se A não é totalmente saturado). </li><li> Para garantir que os dados não são artifactual ITC, a afinidade de ligação e estequiometrias obtidas ITC deve ser comparado com um método ortogonal. 7,8 Além disso, o valor de entalpia ITC pode ser comparada com a entalpia a partir de uma trama van't Hoff 9. Também pode ser útil usar diferentes concentrações do ligante ou macromolécula como o valor absoluto do sinal de calor deve aumentar com o aumento da concentração de macromoléculas. Artefatos são mais susceptíveis de ocorrer se o buffers na célula e seringa não são correspondidos. Outra possibilidade para artefatos surge a partir de amostras impuras. </li><li> Recomendamos que o usuário começar com simples binário titulações complexo para o qual há informações anteriores disponíveis no K d e stoichiometry. Então, se ligantes adicionais de ligação, o usuário pode tentar titulações complexo ternário mais complicado, variando as concentrações de ligante, e talvez mudar a seringa e componentes celulares. A comparação das entalpias de ambos os caminhos para a formação de complexos ternários devem ser aditivo como entalpia é uma função de estado. 10 Novamente, SEDPHAT 6 é provável que seja muito útil aqui. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Um exemplo representativo de uma titulação bem-comportado para a ligação do cofator NADPH para E. coli cromossômicas diidrofolato redutase (ecDHFR). Painel (A) mostra o termograma-primas; (B), a isoterma de ligação entre as pessoas aptas thermogram integrada utilizando o modelo de um local no software Origin, e (C) o ajuste da isoterma usando o modelo de um sítio de ligação a partir SEDPHAT junto com resíduos em forma. A partir do software Origin, utilizando o modelo de site de uma ligação, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 mM, DH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, e ÄG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Acessos de dados usando Sedphat pagar um n de 0,94 ± 0,01, um K d de 0,195 ± 0,013 ΔM, a DH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol e ÄG de -9,15 kcal / mol.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

ITC tem sido amplamente utilizado no estudo de interações ligante macromolécula, 11 com estudos olhando para proteína-ligante, 12 DNA ligante-13 e RNA-macromolécula 14 estudos. ITC pode até mesmo ser executado com materiais sólidos, tais como nanopartículas, que formam suspensões uniforme. 15 Além disso, sistemas ternários, onde um ligante já está ligado à macromolécula e um ligante segundo é titulada, pode ser usado para determinar a termodinâmica, por exemplo, a ligação do substrato a um sistema de enzima cofator. 7 Estudos também pode ser realizada por moléculas com alta afinidade de ligação que, normalmente, exceder o limite de detecção do ITC através da realização de ensaios de competição de ligação com ligantes mais fracos de ligação. 16 Informações sobre a fraca ligação ligantes também podem ser obtidas através dos ensaios de competição. 17 O papel da água na ligação pode ser explorado pela ITC, 18, ​​juntamente com a dependência da entalpia na reorganização do solvente. 19 Recentemente, a termodinâmica de mudança conformacional de variantes DNAK foram medidos sobre ligação de ADP e ATP. 20 associação proteína-proteína pode ser estudada pelo ITC, gerando informações sobre complexos hetero 21, bem como sobre homo-associação. 22 Os efeitos da temperatura na entalpia de ligação dará a capacidade térmica do evento vinculativo. 2 O número de prótons absorvidos ou liberados mediante ligação também pode ser determinada a partir de experimentos realizados em buffers com diferentes entalpias de ionização. 5 Se ITC estudos adicionais são feitas em diferentes valores de pH, em seguida, o pKa do grupo envolvido pode, potencialmente, ser determinada. 23 Para resumir, medidas precisas da concentração da macromolécula e ligante são imperativos para uma experiência boa ITC. Concentrações das amostras também precisa estar dentro de um intervalo adequado para obter dados confiáveis. Cuidados devem ser tomados com a reserva como impurezas pequenas moléculas e inadequações pH causará artefatos no termograma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1,7 mL tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 mL falcon tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49b </td></tr><tr><td> 2,5 mL seringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

calorimetria isotérmica de titulação para medição de macromoléculas-ligand affinity

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma ferramenta útil para a compreensão da imagem termodinâmico completo de uma reação de ligação. Em ciências biológicas, as interações macromoleculares são essenciais para a compreensão da maquinaria da célula. Condições experimentais, como tampão e temperatura, pode ser adaptado para o sistema particular de ligação em estudo. No entanto, um planejamento cuidadoso é necessária uma vez que certas ligante e faixas de concentração macromolécula são necessários para obter dados úteis. Concentrações das macromoléculas e ligante necessidade de ser determinado com precisão para resultados confiáveis. Cuidado também deve ser tomado ao preparar as amostras como impurezas podem afetar significativamente a experiência. Quando experimentos ITC, juntamente com os controles, são realizados de forma adequada, informações úteis de ligação, tais como a estequiometria de afinidade, e entalpia, são obtidos. Executando experimentos adicionais com tampão ou condições diferentes de temperatura, informações mais detalhadas podem ser obtidas sobre o sistema. Um protocolo para a configuração básica de um experimento ITC é dado.

Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma ferramenta útil para a compreensão do quadro termodinâmico completo de uma reação de ligação. Em contextos biológicos...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar uma técnica geral para estudar a ligação entre ligante e macromolécula utilizando calorimetria de titulação isotérmica, ou ITC. Isso é realizado primeiramente preparando soluções de ligante e macromolécula livres de impurezas e com composição de tampão e pH idênticos. As concentrações finais das soluções de ligante e macromolécula são então determinadas.Em seguida, são configurados os parâmetros experimentais do ITC, seguidos pela coleta de dados. O passo final do procedimento é analisar e ajustar os dados. Por fim, os resultados que mostram as interações entre ligante e macromolécula são obtidos por meio da análise gráfica dos dados de titulação, para determinar os parâmetros de ligação e termodinâmicos.A principal vantagem dessa técnica de ligação em comparação com métodos existentes, como titulações por absorção e fluorescência, é que a entalpia e, consequentemente, a entropia da ligação, podem ser determinadas a partir do mesmo experimento. O preparo da amostra começa com a determinação das concentrações adequadas tanto para a macromolécula quanto para o ligante. Uma etapa crítica para obter ajustes precisos de ITC é a informação a ser considerada durante o cálculo dessas concentrações, que pode ser encontrada no procedimento escrito.Nesta demonstração, investiga-se a ligação do cofator NADPH à enzima di-hidro-folato redutase cromossômica de e coli. Primeiro, reconstitua a macromolécula liofilizada em tampão até a concentração desejada, depois dissolva o ligante no volume necessário de tampão. Em seguida, verifique se os valores de pH das amostras da macromolécula e do ligante estão dentro de ±0,05 unidades de pH em relação ao tampão e entre si; centrifugue, por cinco minutos, ambas as soluções — di-hidro-folato redutase cromossômica e NADPH — em tubos de microcentrífuga.Entre 8.000 e 14.000 rpm, isso irá pelotizar quaisquer partículas na solução, as quais podem causar artefatos na linha de base do termograma de ITC. Após a centrifugação, verifique cuidadosamente as concentrações das soluções do macromolécula e do ligante por espectroscopia UV-Vis e registre suas concentrações exatas.Em seguida, prepare o volume apropriado de cada solução para ITC diluindo as soluções estoque preparadas do macromolécula e do ligante até as concentrações experimentais necessárias. Por fim, desgaseifique as amostras para evitar artefatos de sinal devidos a bolhas de ar ou à liberação de gases dissolvidos durante a titulação, antes de carregar a macromolécula e o ligante no ITC. Limpe a cubeta da amostra e a seringa de injeção de acordo com o protocolo do fabricante.Em seguida, enxágue a cubeta duas ou três vezes com 1,8 mililitros de água destilada utilizando uma seringa Hamilton. Tenha cuidado ao manusear a seringa, pois a ponta longa pode entortar facilmente. Depois, enxágue a cubeta várias vezes com o mesmo volume de tampão.Uma vez que a cubeta esteja limpa, carregue 1,8 mililitros da solução da macromolécula na cubeta. Tendo o cuidado de evitar a formação de bolhas, interrompa a adição da amostra no momento em que a solução começar a emergir do tubo da cubeta. Remova quaisquer bolhas de ar utilizando a seringa Hamilton, movendo suavemente a agulha para cima e para baixo ao longo das laterais da cubeta para desalojar as bolhas presentes.Retire a seringa e remova qualquer volume em excesso do poço na parte superior da célula. Em seguida, preencha a célula de referência com água destilada. Depois, conecte uma seringa plástica ao orifício de enchimento da seringa de injeção usando tubulação.Abra a porta de enchimento no console do VP Viewer 2000. Enxágue a seringa de injeção com água destilada, seguido por uma lavagem com tampão. Certifique-se de que a seringa de injeção esteja completamente esvaziada, puxando ar através do sistema.Coloque a agulha da seringa de injeção na solução do ligante e aspire a solução para dentro da seringa até preenchê-la completamente. Continue aspirando um pequeno volume excedente pela porta e desconecte o tubo logo após o fechamento da porta de enchimento. Desconecte o tubo e o purgador de seringa plástico e reencha a seringa de injeção duas vezes para eliminar quaisquer bolhas da seringa.Retire a seringa de injeção da solução de ligante e limpe com um lenço químico quaisquer gotas laterais. Tenha cuidado para não tocar a ponta da seringa no lenço químico nem bater na seringa, pois isso pode causar perda de volume da seringa. Em seguida, coloque cuidadosamente a seringa de injeção na célula de amostra.Configure os parâmetros para a execução da ITC utilizando o programa V VP Viewer 2000 fornecido pela Micro Cal para sistemas de ligação. Com sinais térmicos fortes, como o sistema cromossômico DIHYDROFOLATE redutase N-A-D-P-H, um grande número de injeções de baixo volume fornecerá mais pontos de dados para o ajuste. Inversamente, para sistemas com sinais térmicos fracos, é preferível utilizar um pequeno número de injeções de grande volume.Para as primeiras uma ou duas injeções, defina o volume de injeção em dois microlitros. Essas injeções serão eventualmente descartadas, pois podem gerar resultados espúrios devido à mistura entre as soluções de ligante e macromolécula. Ao inserir o tempo entre injeções, permita vários minutos para que o sistema atinja o equilíbrio e o sinal térmico retorne à linha de base.Em seguida, escolha a temperatura do experimento e insira a velocidade de agitação da seringa necessária para uma mistura adequada do ligante e da macromolécula durante a titulação após a configuração dos parâmetros experimentais; inicie o experimento. Após a conclusão do experimento, o sinal final de calor deve estar próximo à saturação. Limpe o ITC de acordo com o protocolo do fabricante e repita as titulações pelo menos mais uma ou duas vezes para obter dados reprodutíveis.Por fim, realize um controle em que o ligante é titulado no tampão na cubeta da amostra para determinar o calor de diluição do ligante. O ajuste dos dados pode ser facilmente realizado usando macros em qualquer programa de ajuste de dados. O Origin 7 fornecido pela Micro Cal é utilizado aqui para demonstrar o ajuste dos dados. Para começar, carregue o primeiro arquivo de dados.Verifique o termograma bruto em busca de sinais de bolhas de ar ou outros artefatos no sinal, caso haja artefatos como picos na linha de base ou picos na ausência de um ponto de injeção. Anote esses pontos de dados, pois eles devem ser removidos. Em seguida, carregue os dados de controle da diluição do ligante e subtraia-os do isoterma de ligação neste momento.Remova todos os pontos de dados espúrios, incluindo os primeiros pontos da titulação onde normalmente ocorrem artefatos de diluição. Em seguida, selecione o modelo de ajuste dos dados. Uma vez selecionado o modelo, os dados podem ser ajustados inserindo manualmente valores iniciais estimados para os parâmetros de ajuste, incluindo estequiometria, entalpia e afinidade de ligação.No entanto, se houver conhecimento prévio de quaisquer parâmetros obtidos a partir de experimentos ortogonais, esses valores devem ser inseridos, pois ajudarão a evitar que os dados fiquem presos em mínimos locais durante o ajuste. Após ajustar os dados da primeira titulação, repita as etapas de análise de dados para o restante dos isotermos. Alternativamente, os dados podem ser ajustados globalmente utilizando um programa como o said fat; para iniciar um ajuste global, salve os dados no Origin como um arquivo dot dat.Em seguida, importe os dados para a gordura mencionada. Escolha um modelo para ajuste e realize um ajuste global dos dados, alternando entre as opções de ajuste simplex e Mark HAR Leven, até que o valor global de qui-quadrado atinja um mínimo. O procedimento representativo de ITC demonstrado neste vídeo monitora a ligação de N-A-D-P-H à diidrofolato redutase cromossômica de e coli.A ligação exotérmica do NADPH à di-hidrofolato redutase é evidente no termograma bruto, pois o calor é liberado. A diminuição dos sinais térmicos em cada injeção sucessiva indica saturação da ligação, o que ocorre na primeira metade da titulação. A pureza dos componentes e a boa correspondência dos tampões são observadas na porção saturada do gráfico, onde há apenas sinais térmicos mínimos decorrentes do calor de diluição do ligante.Os dados foram ajustados a um modelo de sítio único utilizando o software Origin para revelar a isoterma de ligação. Em seguida, dois conjuntos de dados foram ajustados a um modelo de sítio único utilizando o referido software. Os pequenos valores e o padrão aleatório dos resíduos indicam que os parâmetros termodinâmicos são razoáveis. Esses parâmetros também são validados pela comparação com valores da literatura obtidos por métodos ortogonais.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a ligação de macro mo ligantes, utilizando um ITC VP da MicroCal, preparando adequadamente as soluções, configurando os parâmetros experimentais e analisando os dados.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

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