Name: Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliais ovarianas e tubárias em hidrogéis de alginato tridimensionais. Este método preserva a arquitetura nativa das células para estudar eventos iniciais na formação do câncer de ovário.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa do Câncer de ovário [conceder LT/UIC/01.2011], o Centro para a Ciência UIC clínica e translacional, do Centro de Câncer UIC, e os Institutos Nacionais de Saúde conceder C06RR15482. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo AAALAC ao abrigo de protocolos de cuidados animais aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use a UIC. Animais para este projeto estão alojados em salas de barreira no Laboratório de Recursos Biológicos (BRL) da Universidade de Illinois em Chicago. O BRL tem uma equipe totalmente veterinária que monitora os animais pelo menos duas vezes por dia e fornece conselhos sobre cuidados com animais.

1. Dissecção e isolamento do tecido ovariano <ol><li> Preparar uma solução 0,5% (w / v) de alginato de sódio, prepare de uma versão modificada do protocolo descrito anteriormente 5, usando PBS estéril e calor a 37 ° C. Misture por inversão ou de balanço, mas não vortex. Desenhe o alginato em uma seringa de 1 ml com agulha 25 G e manter a 37 ° C. </li><li> Prepare estéril 10mM CaCl 2 solução para o alginato de reticulação em encapsulamento dos tecidos e quente a 37 ° C. </li><li> Prepare 1mL de meio de cultura (αMEM + 5 unidades de penicilina e estreptomicina 5 mg / ml) por bem em uma placa de 24 poços para cada experimento. Incluem vários fármacos, peptídeos ou vírus no meio de cultura. Para transfecção antes de encapsulamento de órgãos, tecidos incube com Lipofectamine 2000 e DNA plasmidial por quatro horas a 37 ° C. </li><li> Dissecar os órgãos do animal, remover qualquer tecido adiposo ou residual, puxe fora da membrana bursa redor do ovário, e cortar o ovário ou oviduto em quatro pedaços por que atravessa o órgão. Animais foram sacrificados por asfixia CO 2 seguido por deslocamento cervical. Para o oviduto, gentilmente desenrolar o tecido puxando para além das membranas de ligação e estendendo as extremidades do tubo em direções opostas com a pinça antes de cortar. </li><li> Coloque uma gota de alginato única (~ mL 1-3) em um de malha de fibra esterilizados. </li><li> Utilizando uma pinça estéril, mover uma peça de órgão no gota de alginato e do centro da gotícula usando uma pinça ou uma agulha esterilizada. </li><li> Inverter a gota contendo o pedaço de órgãos (organóides) segurando os de malha de fibra com uma pinça estéril e transformá-lo de cabeça para baixo para permitir que a gravidade para forçar o alginato em uma gota de suspensão. </li><li> Toque a pinça na borda de um prato de petri contendo 10 centímetros 10mM CaCl 2 solução de modo que a gota cai em solução. </li><li> Incubar por 2 minutos, retire com uma colher estéreis, contendo poros para liberar extras 10mM CaCl 2, e transferir para o meio de cultura. Até quatro géis de alginato podem ser transferidos para um único poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura. Cultura por um período de tempo definido. </li></ol> 2. Degradação de alginato e coleta de células <ol><li> Para a solubilização do gel de alginato, incubar as culturas em liase alginato (3,4 mg / ml) dissolvido em L-15 Leibovitz media a 37 ° C por 30 minutos ou até gel é completamente dissolvido. </li><li> Remover o tecido da liase alginato. </li><li> Para a coleta da OSE, incubar os organóides com 500 unidades de colagenase em L-15 Leibovitz da mídia por 1 hora 8. Vortex em 2 pulsos segundo (2 segundos vortex e 2 segundos de descanso) em potência média por 1 minuto, seguido por um segundo pulsos (1 vortex segundo e um resto segundo) por 1 minuto. Deixe pedaços de órgãos caem ao fundo do tubo de microcentrífuga e sobrenadante pipeta no tubo de microcentrífuga estéril fresco. Centrífuga 3 minutos a 3000 rpm para sedimentar epitélio de superfície do ovário. </li><li> Para a coleta do epitélio tubário, cortar o tubo comprido e coloque em plástico de cultura de tecidos em DMEM com 5 unidades de penicilina e 5 mg / ml de estreptomicina e 4% (v / v) FBS. Mais de 3-5 dias, as células vão "arrastar" para fora do estroma tubária e crescer em cultura de tecidos plastic9. </li></ol> 3. Fixação de culturas alginato encapsulado órgão para parafina <ol><li> Recolher o alginato encapsulado pérola do meio de cultura no ponto de tempo selecionado. </li><li> Recrosslink o alginato para endurecer o gel, largando a cultura estéril em 10mM CaCl 2 solução por dois minutos. </li><li> Corrigir o órgão alginato encapsulado em paraformaldeído 2% contendo 50 mM de sacarose, 10 mM CaCl 2 e 50 mM cacodilato de sódio para garantir que o gel permanece sólida e totalmente encapsula tecido durante a fixação. </li><li> Após processamento de tecidos, incorporar todo o alginato encapsulado pedaço da cultura de órgãos em parafina e corte com um micrótomo para gerar 5 seções mM. </li><li> O alginato será dissolvido e removido do slide se realizar imunohistoquímica devido ao calor recuperação antigênica baseada. O alginato permanecerá e mancha de eosina compreensão hematoxilina e eosina. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um exemplo de uma cultura de órgãos em três dimensões do ovário e oviduto é mostrado na Figura 1. Ovários podem ser cortados em pedaços de tamanhos diferentes, e OSE proliferar e migrar para reparar a superfície que foi ferido a partir da incisão com o bisturi. Durante este processo, a orientação correta da OSE em relação ao estroma subjacente é mantida, com a OSE encapsular o ovário. Conforme mostrado na Figura 2, a OSE dos ovários cortado ao meio encapsular o ovário de forma mais completa em comparação com ovários cortado em quartos ou oitavos. O reparo de feridas do ováriosuperfície podem ser estudadas no contexto do ovário inteiro e pode lançar luz sobre como reparar a ovulação ea superfície induz a transformação da superfície do ovário. O ponto final do experimento depende da informação que é necessário. Arquitetura do tecido, a morfologia celular, e taxas específicas de crescimento celular são facilmente monitoradas utilizando-se secções de parafina. Por exemplo, uma única camada de epitélio de superfície do ovário é observada após o cultivo em soro livre de αMEM por 7 dias (Figura 3A) enquanto que a adição de 5 mg / ml de insulina por 7 dias induz hiperproliferação do epitélio de superfície ovariano e formação de camadas múltiplas de células (Figura 3B). Adicionando bromodeoxiuridina para as culturas em uma concentração final de 10 mM 24 hr antes da fixação, a proliferação de células pode ser medido (3A e 3B inset). Para culturas mantidas em soro livre de αMEM, cerca de 3-5% da OSE sofrem proliferação durante o período de rotulagem 24 horas (3A inset), enquanto uma porcentagem maior de células da granulosa proliferam. Além de insulina para a cultura de mídia aumenta a porcentagem de proliferação OSE a aproximadamente 30% da OSE total (3B inset). Imunofluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) podem ser visualizados através do gel de alginato com microscopia seguinte norma transfecção cDNA (Figura 3C). Enquanto a cultura de órgãos alginato prevê crescimento e análise de superfície epitélio ovariano e folículos primários, deve-se notar que a madura, folículos secundários não sobreviver neste sistema de cultivo (Figura 3D). Cultura de folículos individuais de maturidade dentro de uma matriz de hidrogel de alginato tem sido descrito em outros lugares 10. Alterações na proteína ou RNA pode ser analisado a partir de todo o órgão ou a partir de tipos específicos de células usando degradação enzimática (Figura 4). Tratamento de ovário Organóides cultivados com colagenase deixa o estroma subjacente intacto (Figura 4C), permitindo para o enriquecimento da OSE na célula pellet obtido após o tratamento, apesar de algumas células do estroma também estão isolados (Figura 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rato ovário sistema de cultura tridimensional usado para propagar OSE após ferindo. A) Sob o microscópio, a bursa ea almofada de gordura ao redor foram removidos. B) ovário intacto (O) com tubo oviductal (T) e gordura pad (F). C) Ovário com bursa e gordura abdominal removido (à esquerda) e desenrolado oviduto (direita). D) Organóides ovário ou oviductal foram colocados em uma gota de alginato. E) Organóides alginato envolto foram lançadas em uma solução de CaCl 2 crosslinking do alginato para formar um gel. F) alginato encapsulado organóides de ovário. G) alginato encapsulado organóides oviductal. H) Organóides alginato encapsulado incubadas em meio de cultura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Superfície regenerado pela superfície do ovário medido pelo citoqueratina 8. Encapsulamento de Organóides ovário pela OSE depois de ser cortado em oitavos, quartos e metades, cultivadas em meio BSA, e medido pela análise imuno-histoquímica usando citoqueratina 8 (CK8) de anticorpos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Alginato sistema de cultura permite a passagem de fatores de crescimento e transfecção de cDNA para a OSE, mas não suporta o rápido crescimento e maturação dos folículos. A) organóides ovário cultivadas por 7 dias em meio basal analisadas para CK8 expressão, que marca o OSE. Seção, Inset série coradas para incorporação de BrdU. B) Adição de insulina ao meio de cultura induz hiperplasia da OSE. Seção, Inset série coradas para incorporação de BrdU. C) organóides ovário transfectadas com cDNA para expressar GFP. D) sistema de cultura alginato suporta o crescimento de folículos primordiais (vermelho ponta de seta), mas não maduro folículos secundários (seta preta). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. OSE pode ser isolado para a cultura seguinte análise. A) organóides cultivadas em meio por até duas semanas. B) organóides Encapsulated é tratada com liase alginato de deixar organóides intacta. Ovário é manchada com CK8 para marcar OSE. C) organóides é tratada com colagenase a OSE separado do estroma subjacente. Pedaço de tecido remanescente foi corado com CK8 para destacar a remoção da superfície do ovário. D) as células coletadas após o tratamento são enriquecidos por OSE como coradas para CK8 (vermelho). Células são contracorados com DAPI para marcar núcleos.

<ol><li>Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2009.</a> CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+ovarian+carcinomas%3A+a+developmental+view%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The origin of ovarian carcinomas: a developmental view.</a> Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).</li>
<li>Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distal+fallopian+tube%3A+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).</li>
<li>Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ovarian+organ+culture+as+a+tool+to+study+normal+ovarian+surface+epithelial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair.</a> Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20, 45-53 (1999).</li>
<li>Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as biomaterials.</a> Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).</li>
<li>Amsden, B., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+characteristics+of+calcium+alginate+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Diffusion characteristics of calcium alginate gels.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).</li>
<li>Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methoxychlor+and+estradiol+on+cytochrome+p450+enzymes+in+the+mouse+ovarian+surface+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium.</a> Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).</li>
<li>Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+newly+established+clonal+oviductal+cell+lines+and+differential+hormonal+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li>
<li>Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+preventing+infection+after+abdominal+vascular+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma%22%5BJournal%5D)">Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries.</a> J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Oocyte+Maturation+and+Preantral+Follicle+Culture+from+the+Luteal+Phase+Baboon+Ovary+Produce+Mature+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes.</a> Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).</li>
<li>Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Hydrogels+for+cell+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Review: Hydrogels for cell immobilization.</a> Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).</li>
<li>Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bifunctional+alginate+lyase+from+Alteromonas+sp.+strain+no.+272+and+its+action+on+saturated+oligomeric+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).</li>
<li>Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cultured+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+phenotypic+plasticity+and+premalignant+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes.</a> Lab Invest. 71, 510-518 (1994).</li>
<li>Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+ovarian+epithelial+carcinogenesis%3A+progress+and+problems+in+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches.</a> Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).</li>
<li>Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+human+ovarian+surface+epithelial+cells+and+adjacent+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix.</a> Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).</li>
<li>Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropins+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropins and ovarian cancer.</a> Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).</li>
<li>Fathalla, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incessant+ovulation--a+factor+in+ovarian+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia.</a> Lancet. 2, 163-163 (1971).</li>
<li>Espey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+hypothesis+that+mammalian+ovulation+is+comparable+to+an+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction.</a> Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).</li>
</ol>

Não há nada a revelar.

O desenvolvimento de um sistema de cultura tridimensional de órgãos utilizando hidrogéis de alginato representa um método versátil para a análise de muitos tipos de tecidos diferentes de uma grande variedade de organismos. O uso de culturas 3D pode ser estendido para os campos da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois proporciona um andaime sobre o qual as células podem crescer 11. Atualmente, nosso laboratório está passando por estudos iniciais usando de ovário e de tecidos humanos trompa de Fal...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Leibovitz L-15 de médio </td><td> Gibco </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM médio </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Alginato de sódio </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cacodilato de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> Malha de fibra de polipropileno </td><td> McMaster Carr </td><td></td><td> 45 &quot;roll de largura; 0,0041&quot; abertura </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Liase alginato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9697 </td><td> De Clostridium histolyticum </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Biomedicals MP </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> Sua solução </td><td> Roche </td><td> 11074547001 </td><td> Insulina / transferrina / selenito de sódio </td></tr><tr><td> Citoqueratina de anticorpos 8 </td><td> Estudos do Banco de desenvolvimento Hibridoma </td><td> Troma-1 </td><td> Use a 1:200 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeoxiuridina </td><td> Sigma </td><td> B50002-1G </td><td> Concentração final 10 mM </td></tr></tbody></table>

hidrogéis alginato para tridimensional cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Câncer de ovário é a quinta causa de morte por câncer em mulheres e tem uma taxa de mortalidade de 63% nos Estados Unidos 1. O tipo de célula de origem para o câncer de ovário ainda está em questão e pode ser tanto o epitélio de superfície do ovário (OSE) ou do epitélio distal do fímbrias tuba uterina 2,3. Cultura as células normais como uma cultura primária in vitro permitirá aos cientistas modelo de mudanças específicas que podem levar ao câncer de ovário no epitélio distintas, assim, definitivamente determinar o tipo de célula de origem. Isto irá permitir o desenvolvimento de biomarcadores mais precisos, modelos animais com alterações de tecidos específicos de genes, e das melhores estratégias de prevenção específicas para esta doença. Manter as células normais em hidrogéis de alginato promove a curto prazo na cultura in vitro de células no seu contexto tridimensional e permite introdução de DNA plasmídeo, siRNA, e pequenas moléculas. Pelos órgãos de cultura em pedaços que são derivados de cortes estratégicos usando um bisturi, várias culturas a partir de um único órgão podem ser gerados, aumentando o número de experimentos a partir de um único animal. Estes cortes aspectos do modelo da ovulação levando a proliferação da OSE, que está associado com a formação de câncer de ovário. Tipos de células, como a OSE, que não crescem bem em superfícies de plástico podem ser cultivadas usando este método e facilitar a investigação sobre os processos celulares normais ou os primeiros eventos na formação do câncer 4. Hidrogéis de alginato pode ser usado para suportar o crescimento de muitos tipos de tecidos 5. Alginato é um polissacarídeo linear composto por unidades repetitivas de ácido D-mannuronic β e α-L-ácido gulurônico que podem ser reticulados com íons de cálcio, resultando em uma ação gelificante suave que não danificar os tecidos 6,7. Como outras matrizes tridimensionais de cultura de células, tais como Matrigel, alginato fornece suporte mecânico para os tecidos, no entanto, as proteínas não são reativos com a matriz de alginato e, portanto, funções de alginato como uma matriz extracelular sintética que não inicia sinalização celular 5. O hidrogel de alginato flutua no meio padrão de cultura celular e suporta a arquitetura do crescimento de tecidos in vitro. Um método é apresentado para a preparação, separação e incorporação de ovário e pedaços de órgãos oviductal em hidrogéis de alginato, que pode ser mantidas em cultura por até duas semanas. A liberação enzimática de células para análise de proteínas e amostras de RNA a partir da cultura de órgãos é também descrito. Finalmente, o crescimento de tipos de células primárias é possível sem imortalização genética de ratos e permite que os pesquisadores de usar nocaute e camundongos transgênicos.

Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

O câncer de ovário é a quinta principal causa de mortes por câncer em mulheres e apresenta uma taxa de mortalidade de 63% nos Estados Unidos1. O tipo celular de origem para ...

Este procedimento descreve a propagação de células epiteliais normais do ovário e do ducto uterino como uma cultura tridimensional de órgãos. Primeiro, dissecar o coxim adiposo do ovário, do UCT e parte do útero de um camundongo. Em seguida, remover a bursa e separar as membranas ductais uterinas com uma pinça e cortar cada ovário ou UCT em dois a quatro pedaços denominados organoides.Por fim, encapsule o organoide em uma gota de alginato sobre um pedaço de fibra de malha. Como as OSC e as TEC cultivadas em meios definidos mantêm características celulares normais em sua arquitetura tridimensional nativa, a imuno-histoquímica em cortes de tecido, análise de RNA e análise de proteínas podem fornecer informações sobre o impacto das OSC e das TEC no câncer de ovário.A principal vantagem desta técnica, em comparação com a cultura celular imortalizada tradicional bidimensional, é que as células podem ser cultivadas em contato com a matriz extracelular subjacente e com células estromais, sem imortalização genética que poderia alterar vias celulares. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do câncer de ovário, como definir os eventos iniciais na formação do cânc

alginate-hydrogels-for-three-dimensional-organ-culture-ovaries

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

Este vídeo descreve os protocolos para encapsular complexos cumulus-oócitos suínos (COCs) em esferas de fibrina-alginato para estabelecer uma cultura 3D. Este sistema de maturação in vitro mantém a comunicação normal célula a célula, garantindo a maturação do oócito e mantendo a viabilidade.

Cultura 3D de COCs suínos: um procedimento para encapsular complexos de oócitos cumulus em esferas de hidrogel de polímero de fibrina-alginato

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para o encapsulamento de oócitos suínos em microbiorreatores hidrofóbicos.

Sistema de Microbiorreator de Mármore Líquido: Um Protocolo de Cultura 3D para Encapsulamento de Oócitos Suínos

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.

Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo

Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

Este protocolo descreve metodologias para estabelecer organoides epiteliais endometriais de camundongos para expressão gênica e análises histológicas.

Estabelecendo organoides endometriais 3D do útero do rato

Este protocolo descreve um novo modelo de cultura tridimensional (3-D) usando um hidrogel de hialuronano ligado à tiramina para encapsular e cultivar folículos pré-antrais do ovário de camundongo. Também detalhamos duas abordagens para a criopreservação do folículo ovariano por vitrificação.

Aplicação de um novo hidrogel de hialuronano para cultura de folículos tridimensionais e metodologia para criopreservação de folículos ovarianos de camundongos

Descrevemos métodos para cultura de folículos ovarianos em um novo molde de agarose livre de andaimes que complementa a gametogênese in vitro .

Produção e uso de moldes de agarose personalizáveis para cultura de folículos ovarianos de camundongos sem andaimes

Descrevemos métodos para isolar células somáticas ovarianas de camundongos a partir de uma fração rica em estroma do ovário e para gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes.

Sondando o Microambiente Ovariano: Métodos para Isolamento, Cultura 2D e Cultura Organoide de Células Somáticas Ovarianas de Camundongos

Aprenda a cultivar células epiteliais ovarianas e tubárias em hidrogéis de alginato tridimensionais. Este método preserva a arquitetura nativa das células para estudar eventos iniciais na formação do câncer de ovário.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Explorar mais vídeos