Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

O objetivo geral deste procedimento é facilitar a visualização de neurônios fluorescentes em fatias espessas de cérebro. Isso é realizado primeiramente incorporando o cérebro em um suporte de plugue de aerossol. O segundo passo do procedimento consiste em seccionar o cérebro em fatias espessas no tomógrafo comprimido.

O terceiro passo do procedimento é tornar as fatias cerebrais transparentes opticalmente em um gradiente de glicerol. O passo final do procedimento é montar as fatias cerebrais transparentes em lâminas para imageamento fluorescente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram expressão de proteínas fluorescentes marcadoras com alta resolução em neurônios dentro de fatias cerebrais espessas, por meio de microscopia epifluorescente ou confocal.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como corte fino, microscopia fluorescente seriada ou imagem de múltiplos fótons, é que ela é muito mais rápida, menos trabalhosa e não requer técnicas de microscopia caras ou sofisticadas. Para começar, recupere o tecido cerebral de camundongo que passou pela fixação NC2 por perfusão cardíaca e foi pós-fixado por uma a duas horas a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare uma solução de agarose a 2% de alta resistência e baixo ponto de gelificação em PBS e aqueça no micro-ondas até dissolver.

Transfira o agar fundido para um tubo de ensaio e coloque-o em um bloco térmico a 40 graus Celsius para equilibrar a temperatura enquanto o agar equilibra. Cole o tecido cerebral fixado no êmbolo da seringa de espécime. Com cola Sano Aate, submerja o tecido montado em uma solução saturada de sacarose em PBS para revestir a superfície do cérebro e, em seguida, puxe o êmbolo para dentro da câmara do êmbolo. Pipete o agar morno para dentro do êmbolo, cobrindo completamente o tecido cerebral, certificando-se de não introduzir bolhas de ar.

Finalmente, prenda a seringa com a amostra em um bloco refrigerador frio por cerca de um minuto. Para ajustar os aros, monte a seringa com a amostra contendo o tecido cerebral embutido na base comprimida. Alinhe a borda da lâmina cuidadosamente com a saída da seringa com a amostra e, em seguida, encha o tanque de buffer com PBS.

Gire o micrômetro. Uma vez definida a espessura do corte, avance para extrair o tecido cerebral embutido da seringa de amostra. Para gerar o primeiro corte, pressione o botão de início na unidade de controle.

Repita o processo de avançar o tecido embutido e pressione o botão de início para gerar o número desejado de fatias. Colete as fatias com uma pipeta de transferência e transfira-as para um frasco de vidro contendo PBS. Remova a maior parte do PBS das fatias coletadas com uma pipeta e substitua por uma solução de 10% de glicerol em PBS. Agite suavemente o frasco a quatro graus Celsius em um agitador rotativo de bancada até que as fatias afundem.

Continue a clareação gradual repetindo o processo de decantação e reenchimento com soluções de glicerol a 25, 50 e depois 75%. Pipete a solução de glicerol a 75% e substitua por glicerol a 90%. Tenha cuidado para não introduzir bolhas e equilibre a quatro graus Celsius com movimento suave de balanço.

Agora que as fatias foram totalmente clareadas, elas não afundarão mais, mas mostrarão uma flutuabilidade neutra. Corte a fita adesiva dupla-face em um retângulo aberto com uma borda de dois a três milímetros, ajustando-a à área visível de uma lâmina de microscópio de 25 por 75 milímetros, utilizando uma pinça. Organize as fatias cerebrais dentro da borda sobre a lâmina.

Coloque cuidadosamente a lamínula sobre a fita adesiva. Tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar, aplique pressão para criar um selo, aspire qualquer excesso de glicerol e, em seguida, vede as bordas da lamínula aplicando esmalte incolor. Uma vez que o selo esteja seco, a lâmina pode ser armazenada em uma caixa de lâminas a quatro graus Celsius ou utilizada para imageamento.

Utilize imediatamente a microscopia fluorescente de epifluorescência. O padrão de expressão de um vetor viral que expressa GFP melhorado pode ser observado em uma seção coronal de 200 micrômetros de espessura de tecido cerebral de camundongo. Aqui, a área destacada da imagem de epifluorescência é mostrada em alta resolução utilizando microscopia confocal para revelar neurônios corticais individuais da camada cinco.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias espessas de cérebro fixadas para imageamento fluorescente rápido e de alta resolução.