Name: Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprenda a visualizar neurônios fluorescentes em fatias grossas de cérebro usando limpeza óptica com gradiente de glicerol. Este método rápido permite imagens de alta resolução por microscopia epifluorescente ou confocal.

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Este trabalho foi financiado pelo apoio através da Fundação McNair, NARSAD, e conceder NINDS R00NS064171-03.

1. Na fixação do cérebro situ * Prepare uma seringa de 10 ml (28 agulha) preenchido com tampão fosfato salino (PBS). * Prepare uma seringa de 10 ml (28 agulha) preenchido com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Reserve um adicional de 50-10 ml de PFA / PBS para fixação post. <ol><li> Injetar por via intraperitoneal rato experimental com uma dose letal de Avertin ou Nembutal. </li><li> Uma vez que o mouse está sedado, molhar o abdômen com etanol e segura o mouse para a parte inferior de uma bandeja em camadas com a cortiça, a cera, ou elastômero de silicone utilizando os pinos de dissecação. Com abdômen virado para cima, segura as quatro patas para a superfície - espalhando-os o mais amplo possível. </li><li> Agarrar a pele com uma pinça ao nível do esterno, e cortado transversalmente para expor o fígado. Corte lateral e depois para cima através das costelas e diafragma. Remover o retalho de tecido costela e continue cortando até que o coração está acessível. </li><li> Furar ou cortar o átrio direito para drenar o sangue circular. </li><li> Lave sangue residual do sistema circulatório por perfusão de PBS através do ventrículo esquerdo. </li><li> Acessando o buraco mesma agulha, corrigir rato inteiro por perfusão subsequente de PBS / PFA através do ventrículo esquerdo. </li></ol> 2. Dissecção e extração de cérebro <ol><li> Retire a pele da cabeça, pescoço e crânio, reduzindo em torno de canal auditivo e as órbitas dos olhos, seguida puxando a pele anteriormente para expor o crânio. * Veja a Figura 2 para uma ilustração de passos 2.2) a 2.5) </li><li> Usando uma tesoura osso, cortado transversalmente do olho do soquete através do corneto nasal ossos. Faça isso para cada lado. O crosscut deve ser anterior aos olhos e bulbos olfatórios. </li><li> Corte longitudinal de cada canal de orelha a cavidade ocular. </li><li> Usando uma tesoura pequena dissecção, corte a placa de osso occipital que cobre o cerebelo de um canal do ouvido para o outro. </li><li> Com a tesoura mesmo dissecção, corte anteriormente ao longo da linha média ao nível dos bulbos olfativos. </li><li> Usando pinça, retire cada placa óssea a partir do cérebro, tendo o cuidado de remover qualquer tecido conjuntivo para que o cérebro permanece intacto ao levantar fora do osso. </li><li> Nervos cranianos e Snip óptica, corte as vértebras cervical superior e remova o cérebro em fixador. </li><li> Pós-fix por 1-2 horas a 4 ° C. Lavar 3 vezes 15 min cada em PBS. </li></ol> 3. Incorporação de agarose <ol><li> Derreta 2% de alta resistência, com baixo ponto de gel de agarose tipo IB (Sigma número de catálogo: A0576) em PBS salina com forno de microondas. </li><li> Transferência de agarose fundida a um tubo de ensaio. Coloque o tubo de ensaio em um banho de água morna ou incubadora (40 ° -41 ° C) até a temperatura de equilíbrio. </li><li> Cola tecido cerebral fixa para o êmbolo da seringa amostra com cola de cianoacrilato (Figura 3A). Pincel uma fina camada de solução de sacarose-PBS saturada na superfície do tecido cerebral para facilitar a liberação posterior do anel de agarose as fatias de cérebro. </li><li> Sacar o êmbolo com o tecido do cérebro dentro do alojamento de êmbolo (Figura 3B). </li><li> Pipeta ou derramar agarose quente dentro da caixa do êmbolo, cobrindo o tecido cerebral. Evite bolhas de interceptação no agarose. Bolhas de ar no agarose irá comprometer a qualidade fatia. </li><li> Grampo da seringa com uma amostra de frio (° C a -25 ° C 0) bloco de refrigeração por 1 minuto para definir a agarose (Figura 3C). </li></ol> 4. Seccionamento fatia do cérebro com o Compresstome <ol><li> Monte a seringa contendo a amostra de tecido cerebral no Compresstome (Figura 3D). </li><li> Alinhe a extremidade da lâmina de barbear em estreita colaboração com a saída da seringa de amostra (Figura 3E). </li><li> Encher o tanque com a solução tampão PBS. </li><li> Gire o micrômetro de espessura uma fatia para a frente a extrusão do bloco de tecido cerebral agarose-out da seringa espécime. </li><li> Pressione o botão "iniciar" na unidade de controle do Compresstome para iniciar o processo de corte. </li><li> Repita os passos 4.4) a 4.5) até fatias desejados são obtidos em determinar a espessura. </li><li> Colheita fatias de cérebro com pincel ou pipeta para frascos ou poços coloração preenchido com PBS (Figura 3F). </li></ol> 5. Clearing óptica <ol><li> Prepare um 75% vol: vol solução de glicerol: PBS. </li><li> Pour (ou pipeta) off metade do volume de PBS de lavagem dos fatias de cérebro coletados. </li><li> Adicionar novamente o volume removido com glicerol / PBS. </li><li> Deixar equilibrar com a mistura suave a 4 ° C até a pia fatias. </li><li> Repita os passos 6.2) a 6,4) até uma concentração de glicerol final atinja os 75%. </li><li> Substituir solução com 90% de glicerol em PBS e deixar equilibrar. * Nota: Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar, enquanto a adição de soluções de glicerol. Despeje lentamente soluções e misture delicadamente, uma vez que as bolhas de ar irá interferir com uniforme equilibração e será transferido para montagem de carros. </li></ol> 6. Fatia de montagem para imagens <ol><li> Corte de dupla face adesiva de vedação (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) em um retângulo aberto para se ajustar à área visível de um slide micro (Superfrost Plus, 25 X 75 X 1 gato mm,. # 48311-703, VWR ) com lados 2-3 mm de largura. </li><li> Coloque fatias de cérebro dentro do centro do retângulo de fita adesiva, utilizando uma pipeta ou pincel. Remover o glicerol em excesso com a aspiração suave. </li><li> Arrume as fatias de cérebro em slide na ordem desejada com um pincel. </li><li> Tampa de vidro delicadamente mais baixo (24 X 60 mm, gato. # 48383-139, VWR) sobre a fita adesiva, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Aplique uma suave pressão sobre tampa de vidro para garantir o contato com fita adesiva. </li><li> Aspirar glicerol em excesso das bordas entre lâmina e lamínula. </li><li> Selo de slides e lamela utilizando unha polonês claro. </li><li> Deixar secar antes de imagem, ou armazenamento de longo prazo em caixas de slides, a 4 ° C. </li></ol> 7. Resultados representativos: Processamento, de imagem, e analisar o tecido cerebral fluorescente etiquetado tornaram-se indispensáveis ​​para o estudo da neurobiologia. Muitas dessas investigações requerem sofisticados manipulações genéticas para obter expressão repórter em subconjuntos direcionados neuronal, seguido por ambas as análises de imagem de baixa e alta resolução. Muitas vezes as limitações técnicas experimentais e torná-la impossível obter estes tipos de dados a partir do mesmo animal, ou de uma forma rápida. Preparação de opticamente-desmarcada, seções semi-grossa cérebro para lâmpadas fluorescentes imagem aids neste desafio. Um exemplo de uma fatia do cérebro intacto espessura rotulados com um vírus geneticamente modificados para expressar raiva engenharia EGFP, e fotografada por microscopia de epifluorescência e confocal é mostrado na Figura 4 e Figura 5, respectivamente. Para geração de imagens de epifluorescência usamos uma Leica M205 FA, e para aquisição de imagem confocal foi utilizada uma Zeiss LSM 510. Devido à relativa simplicidade do protocolo anexo, este método é capaz de produzir dados de imagem úteis a partir do tecido expressar repórteres fluorescente com um tempo de retorno de menos de um dia, e é compatível tanto com a microscopia de luz baixa e alta resolução. Se o pesquisador escolhe para incorporar métodos postmortem adicionais rotulagem, coloração imuno-histoquímica, ou fazer cortes mais finos, o protocolo alonga em conformidade. No entanto, o método descrito acima representa um método simples e relativamente high-throughput screening para os padrões de expressão repórter vital no cérebro intacto. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma diagramação a fixação, a dissecção, corte, limpeza e procedimento de montagem de fatias de espessura semi-cérebro. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagrama de passos seqüenciais de corte para extrair o cérebro de camundongos intactos. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Passos para montar e cortar o tecido cerebral usando o Compresstome. A) Colocação de tecido do cérebro em corte êmbolo com supercola. B) Desenho baixo do tecido cerebral montada no êmbolo para a incorporação de agarose. C) Solidificando uma ficha cérebro agarose usando um bloco de compressão refrigerados. D) Inserção de agarose ficha cérebro e êmbolo em Compresstome câmara de corte. E) O alinhamento da lâmina de barbear para o dispositivo de êmbolo. F) Corte e coleta de fatias de cérebro em Compresstome câmara de buffer. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imagens de microscopia de luz de uma grossa fatia de glicerol limpo tecido cerebral através do córtex frontal expressando a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP). Uma fatia) Coronal através de um cérebro de camundongo (200 um de espessura) marcada com um vetor viral EGFP expressar e fotografada em baixa resolução usando um estereoscópio de epifluorescência. Escala de bar, 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Ampliação de imagem de alta da camada fluorescente etiquetado 06/05 neurônios corticais em uma fatia do cérebro limpo de espessura. A) Imagem de alta resolução confocal de uma projeção máxima Z-stack (150 hm de espessura) através da região em destaque na (Figura 4). Barra de escala, 25 um.

<ol><li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPfister%2C+H+%22The+Connectome+Project%22">The Connectome Project</a>. , (2009).</li>
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<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
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<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Jian-Qiang Kong é um empregado de Precisionary Instruments, Inc., que fabrica um produto utilizado neste artigo.

Dada a aplicação generalizada do uso de proteínas fluorescentes para atingir subconjuntos neuronal para investigação por microscopia óptica, a necessidade de rapidamente de tela, imagem, e analisar as redes neurais dentro do tecido cerebral intacto tem valor inestimável. Avanços tecnológicos no desenvolvimento de user-friendly vetores virais, em técnicas de eletroporação in vivo, e linhagens de camundongos geneticamente modificados agora fornece uma fonte aparentem...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Nome do item</th&gt;<thEmpresa&gt;</th&gt;<th&gt; Número de catálogo</th&gt;<th&gt; Comments (opcional)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Osso tesoura</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt; Ou equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tesouras de dissecação</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt; Ou equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tipo IB agarose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Instrumentos Precisionary</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt;-Outros vibratomes são compatíveis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adesiva dupla face</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Além disso Superfrost slides</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tampa de vidro</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glicerol</td&gt;<td&gt; EMD Chemicals Inc.</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt; Ou equivalente</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas semi-cérebro

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Um objetivo fundamental tanto para a neurociência básica e clínica é compreender melhor a identidade, composição molecular e padrões de conectividade que são característicos para os neurônios do cérebro em ambos os normais e doentes. Para isso, um grande esforço foi colocado na construção de mapas de alta resolução neuroanatômicas 1-3. Com a expansão da genética molecular e os avanços em microscopia de luz veio a capacidade de consulta não só morfologias neuronal, mas também a composição molecular e celular dos neurônios individuais e suas redes associadas 4. Grandes avanços na capacidade de marcar e manipular neurônios através gene transgênico e tecnologias de direcionamento no roedor agora permitir que os pesquisadores subconjuntos neuronal &quot;programa&quot; à vontade 5-6. Indiscutivelmente, uma das contribuições mais influentes para a neurociência contemporânea foi a descoberta e clonagem de genes que codificam proteínas fluorescentes (PQ) em invertebrados marinhos 7-8, ao lado de seus subseqüentes de engenharia para produzir uma caixa de ferramentas cada vez maior de repórteres vital 9. Exploração de atividade do promotor de células de tipo específico para conduzir direcionados expressão FP em discretos populações neuronais agora oferece investigações neuroanatômicas com precisão genética. Engenharia expressão FP em neurônios melhorou muito nossa compreensão da estrutura e função cerebral. No entanto, os neurônios individuais de imagem e suas redes associadas em tecidos cerebral profunda, ou em três dimensões, manteve-se um desafio. Devido ao alto teor lipídico, o tecido nervoso é bastante opaco e apresenta fluorescência auto. Estas propriedades inerentes biofísicos dificultam a visualização e imagem neurônios fluorescente etiquetado em alta resolução através de microscopia confocal de epifluorescência ou padrão profundidades além de dezenas de microns. Para contornar este desafio investigadores muitas vezes empregam imagens seção fina de série e métodos de reconstrução 10, ou 2-fótons de microscopia de varredura a laser 11. Inconvenientes atuais para essas abordagens são a preparação do tecido associado de trabalho intensivo, ou de custo proibitivo de instrumentação, respectivamente. Aqui, apresentamos um método relativamente rápido e simples de visualizar células fluorescente etiquetado na fixa semi-grossas fatias de cérebro de rato, limpando óptica e de imagem. No protocolo anexo descrevemos os métodos de: 1) o tecido cerebral fixação in situ, através de perfusão intracardíaca, 2) dissecção e remoção do cérebro inteiro, 3) a incorporação do cérebro estacionário em agarose, 4) elaboração de precisão fatia semi-grossa usando instrumentação vibratome nova , 5) o tecido cerebral de compensação através de um gradiente de glicerol, e 6) de montagem em lâminas de vidro para microscopia de luz e z-stack reconstrução (Figura 1). Para preparar fatias de cérebro implementamos um pedaço relativamente novo de instrumentação chamado de &quot;Compresstome&quot; VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Este instrumento é um micrótomo semi-automatizado, equipado com um avanço motorizados e sistema de vibração da lâmina com características semelhantes em função de vibratomes outros. Ao contrário de outras vibratomes, o tecido a ser cortado é montado em um plugue de agarose dentro de um cilindro de aço inoxidável. O tecido é extrudado em espessuras desejadas do cilindro, e corte pela lâmina para a frente avançando vibrando. A ficha de agarose / sistema de cilindro permite tecido reprodutíveis de montagem, alinhamento e corte de precisão. Em nossas mãos, o &quot;Compresstome &#39;rende fatias de alta qualidade de tecidos para eletrofisiologia, imuno-histoquímica, e dirigir-tecido fixo de montagem e de imagem. Combinados com a óptica, aqui demonstrar a preparação de semi-grossas fatias de cérebro fixa de alta resolução de imagem fluorescente.

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Um objetivo fundamental tanto para a neurociência básica quanto para a clínica é compreender melhor as identidades, a composição molecular e os padrões de conectividade que são...

O objetivo geral deste procedimento é facilitar a visualização de neurônios fluorescentes em fatias espessas de cérebro. Isso é realizado primeiramente incorporando o cérebro em um suporte de plugue de aerossol. O segundo passo do procedimento consiste em seccionar o cérebro em fatias espessas no tomógrafo comprimido.O terceiro passo do procedimento é tornar as fatias cerebrais transparentes opticalmente em um gradiente de glicerol. O passo final do procedimento é montar as fatias cerebrais transparentes em lâminas para imageamento fluorescente. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram expressão de proteínas fluorescentes marcadoras com alta resolução em neurônios dentro de fatias cerebrais espessas, por meio de microscopia epifluorescente ou confocal.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como corte fino, microscopia fluorescente seriada ou imagem de múltiplos fótons, é que ela é muito mais rápida, menos trabalhosa e não requer técnicas de microscopia caras ou sofisticadas. Para começar, recupere o tecido cerebral de camundongo que passou pela fixação NC2 por perfusão cardíaca e foi pós-fixado por uma a duas horas a quatro graus Cels

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Etienne, F. et al. Imagem de dois fótons da atração de processos microgliais por ATP ou serotonina em fatias cerebrais agudas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da microscopia de dois fótons para estudar a atração de processos microgliais em direção a um composto injetado em fatias cerebrais. Ele fornece uma visão geral da preparação de fatias de cérebro de camundongo, injeção de um composto de teste quimioatraente e imagens de microglia marcada com fluorescência para...

Microscopia de dois fótons para estudar a atração do processo microglial em direção a um composto em uma fatia de cérebro de camundongo

Fonte: Shimojo, H., et al. Imagem de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização Notch durante a neurogênese murina. J. Vis. Exp. (2019)Neste vídeo, culturas de fatias corticais de embriões de camundongos transgênicos são usadas para monitorar a expressão gênica por meio de imagens tridimensionais. Imagens de bioluminescência, fluorescência e campo claro são usadas para visualizar a expressão gênica em tempo real durante a diferenciação neuronal dentro do tecido nativo.

Monitoramento da expressão gênica em tempo real em fatias cerebrais por meio de imagens tridimensionais

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Nós introduzimos um método de gravação óptica reprodutível e estável para fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível. O artigo descreve a coloração de corante sensível à tensão e a gravação de sinais ópticos usando preparações convencionais de corte hipocampal.

Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

Este protocolo demonstra um método simples e robusto para estudar na dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio. Ele descreve como preparar ex vivo fisiologicamente relevantes fatias cerebrais agudas e fornece um pipeline de análise amigável.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

O presente protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para limpeza óptica rápida e simultânea, marcação multi-redonda e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem, combinando a técnica de transformação de tecido curto (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) com imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz em um protocolo de alto rendimento de rotina.

Limpeza óptica e marcação para microscopia de fluorescência de folha de luz em imagens cerebrais humanas em larga escala

Aprenda a visualizar neurônios fluorescentes em fatias grossas de cérebro usando limpeza óptica com gradiente de glicerol. Este método rápido permite imagens de alta resolução por microscopia epifluorescente ou confocal.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

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