Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a captação de nanopartículas por tumores utilizando imagemagem intra-vital. Isso é realizado primeiramente removendo a casca e cultivando embriões aviários. O segundo passo consiste em estabelecer tumores xenógrafos na membrana corioalantoide ou CAM, e permitir que cresçam por aproximadamente uma semana.

O terceiro passo do procedimento é injetar nanopartículas por via intravenosa no camundongo e realizar imagem confocal intravital em tempo real do tumor xenograft. O passo final do procedimento é ressecar e seccionar o tumor. Em última análise, a captação de nanopartículas pelo tumor é quantificada a partir das imagens e pode-se realizar análises secundárias do tumor.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite a geração de imagens de alta resolução para avaliar a dinâmica de acúmulos de nanopartículas em tumores ao nível microscópico. Além disso, utilizando este sistema modelo, é possível que um único pesquisador analise um número muito grande de grupos experimentais dentro de duas semanas. Adicionalmente, a membrana corioalantoide dos embriões de Shells é facilmente acessível para manipulação física e para imagens não invasivas.

O meu laboratório concentra-se no desenvolvimento de nanopartículas para imagem molecular direcionada e entrega de fármacos no câncer. A nossa busca por um modelo de xenoenxerto rápido e de baixo custo para realizar análises detalhadas de captação levou-nos aos embriões de galinha com casca. Aqui, utilizamos imagem intravital de alta resolução para avaliar a captação de nanopartículas em xenoenxertos de tumores humanos em um modelo modificado de embrião de galinha com casca.

Para este protocolo, prepare e identifique ovos com embriões de galinha fertilizados no quarto dia. Utilizando o método padrão, assegure-se de que os embriões estão fertilizados e viáveis mediante a verificação da presença de batimento cardíaco, e incube-os a 38 graus Celsius com umidade relativa de pelo menos 60% até o nono dia embrionário, quando os embriões estarão prontos para a inoculação de células tumorais.

Monte um microinjetor conectando uma agulha de calibre 18 a uma seringa de um mililitro com um pedaço de tubo de tigon de cinco a seis polegadas. Insira cuidadosamente a bisel da agulha no tubo. Aproximadamente quatro a cinco polegadas do tubo devem se estender a partir da ponta da agulha.

Agora, aspire a suspensão de células tumorais através da tubulação até a seringa e inverta. Bata cuidadosamente na lateral da seringa e pressione o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar. Em seguida, insira uma agulha de microinjeção de vidro na extremidade da tubulação e pressione o êmbolo até que a suspensão celular alcance a ponta da agulha.

Agora, sob um microscópio de dissecação, injete lentamente e com cuidado entre 10.000 e 100.000 células cancerígenas no espaço intersticial dentro da membrana corioalantoide. As células devem formar um bolo visível dentro da membrana; células depositadas na superfície da membrana podem ser removidas com leves toques usando um lenço de papel absorvente ou aplicador de algodão. Agora, retorne os embriões a uma incubadora a 38 graus Celsius com umidade de pelo menos 60%.

Permitiu-se que o tumor crescesse e se vascularizasse por até sete dias, atingindo um diâmetro de pelo menos cinco milímetros antes da imagem. Antes da imagem, as nanopartículas devem ser marcadas com um corante fluorescente compatível com o microscópio intravital e armazenadas a quatro graus Celsius em PBS, onde permanecem estáveis por pelo menos um ano. Em seguida, centrifugue as nanopartículas por um minuto para formar um pellet e remover quaisquer agregados antes de serem aspiradas para dentro do microinjetor. Agora, usando PBS para diluir as nanopartículas, prepare uma concentração de trabalho de um miligrama por mililitro para, por fim, injetar 50 microgramas de nanopartículas em um volume de 50 microlitros.

Agora prossiga com as injeções no dia 16 do desenvolvimento embrionário. Verifique se os tumores estão suficientemente vascularizados para selecionar os embriões portadores de tumor mais adequados para injeção intravenosa. Injete uma dextrina fluorescente de baixo peso molecular, espectralmente distinta das células tumorais e das nanopartículas.

Em seguida, visualize a dextrina em um microscópio fluorescente e selecione os embriões com tumores mais vascularizados. Após a seleção dos embriões, utilize um microinjetor preparado para aplicar pelo menos 200 microlitros das nanopartículas preparadas. Inverta a seringa.

Toque cuidadosamente na lateral e pressione o êmbolo para remover quaisquer bolhas de ar. Agora, insira uma agulha longa e fina de vidro para microinjeção na extremidade da tubulação e pressione o êmbolo até que a solução de nanopartículas alcance a ponta da agulha. Uma agulha romba não perfurará o ectoderma, e uma agulha excessivamente fina e afiada quebrará ao ser inserida no tecido.

A seguir, injete intravenosamente entre 30 e 200 microlitros de nanopartículas nos embriões, distalmente do lado desejado para ser visualizado imediatamente após a injeção das nanopartículas. Os tumores, conforme descritos na próxima seção, começam com o preparo da unidade de imagem do embrião. Primeiro, aplique uma camada fina de graxa a vácuo ao redor da circunferência da porta de imagem na parte inferior da tampa.

Em seguida, acople uma lamínula de vidro de 18 milímetros na porta. Agora, carregue o embrião na unidade de modo que a lamínula fique acima da área desejada para a aquisição de imagens. Abaixe lentamente a tampa da unidade até que a lamínula entre em contato com o embrião e parafuse a tampa no lugar.

Agora, preencha o recipiente contendo o embrião com água a 37 graus Celsius na unidade de imagem. Esta unidade manterá o embrião fixo sob o microscópio confocal de disco giratório no microscópio de fluorescência confocal de disco giratório. Verifique se a câmara ambiental está a 37 graus Celsius.

Agora, posicione a unidade de imagem sobre a platina de modo que a lamínula fique diretamente abaixo do objetivo do microscópio e prossiga com a aquisição de imagens. Adquira pilhas de imagens de alta resolução do tumor e da vasculatura circundante imediatamente após a injeção e em intervalos horários.

Posteriormente, as imagens refletirão alterações estruturais detalhadas ocorrendo na vasculatura tumoral. O embrião pode ser imagiado continuamente por até 36 horas sem necessidade de trocar o banho de água. Para quantificar a captação de nanopartículas virais a partir das imagens, utilize um pacote de software como o Velocity.

Primeiro, selecione o tumor e delimite-o a partir do estroma circundante. A seleção é facilitada pela marcação do tumor com dextrina fluorescente. Agora, calcule o sinal fluorescente médio proveniente das nanopartículas no tumor e em áreas representativas do estroma adjacente.

Em seguida, calcule a razão do sinal médio. Reforce a seleção do tumor em relação ao sinal médio. Reforce a seleção do estroma.

Uma razão maior que um indica que as nanopartículas estão preferencialmente localizadas no tumor. Células de câncer de cólon HT29 foram injetadas para formar um bolus de aproximadamente um milímetro de diâmetro dentro da câmara de dia nove. Embriões de galinha após sete dias de incubação foram injetados intravenosamente com uma dextrina de baixo peso molecular para confirmar a vascularização tumoral.

A administração intravenosa de nanopartículas de CPMV LOR 6 47 ou CPMV LOR 6 47 pegilado, seguida por imagem confocal em tempo real de alta resolução, revelou que tanto as nanopartículas de CPMV quanto as de CPMV pegilado marcaram rapidamente toda a vasculatura. A quantificação do sinal fluorescente em regiões tumorais versus estromais, realizada 12 horas após a injeção, revelou que a captação de CPMV pegilado pelo tumor foi aproximadamente três vezes maior do que a do CPMV. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imagens intravitais de alta resolução para avaliar a captação de nanopartículas em xenoenxertos tumorais em um modelo de embrião aviário, desde o preparo dos embriões aviários até o enxerto de células tumorais, injeção intravenosa de nanopartículas e avaliação da captação de nanopartículas nos tumores por meio de imagem confocal intravital em tempo real.