Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar precursores de glóbulos vermelhos diretamente em tecidos recém-colhidos em camundongos. Isso nos permite estudar suas propriedades moleculares durante os períodos em que o sistema eritropoiético nesses camundongos está passando por mudanças. Por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário ou durante a resposta ao estresse hipóxico, o primeiro tecido hematopoiético é isolado do fígado fetal de camundongo ou do baço adulto ou da medula óssea e dissociado em uma única suspensão celular.

Em seguida, as células são marcadas com anticorpos contra os marcadores de superfície celular CD 71 e TER one 19, e com quaisquer outros marcadores de interesse, por exemplo, para medir a sobrevivência celular ou o status do ciclo celular, a suspensão celular marcada é então analisada usando um analisador de citometria de fluxo e subconjuntos específicos de eritroblastos em estágios distintos de maturação são identificados. Esses subconjuntos específicos podem ser purificados por classificação de células. Posteriormente, análises celulares e moleculares podem ser realizadas para cada subgrupo de maturação eritroblástica.

A capacidade de identificar eritroblastos em estágios específicos de maturação diretamente em tecidos hematopoiéticos recém-isolados nos dá a oportunidade de estudar as células no córtex fisiológico. Este método, portanto, nos permite estudar eritroblastos altos de diferentes estágios de maturação, respondem in vivo. Quando os camundongos são submetidos a estímulos, eles aceleram a caixa eritropoiética.

Por exemplo, condições hipóxicas que imitam alta altitude ou injeção do hormônio eritropoietina. Usamos citometria de fluxo multiparâmetro para identificar um blats dentro de um ambiente de tecido complexo e, simultaneamente, estudar sua sobrevivência de sinalização e status do ciclo celular. Também podemos classificar os eritroblastos em seus estágios específicos de maturação diretamente do tecido fresco e explorar seus níveis de expressão gênica, status da cromatina ou outras funções moleculares.

A eritropoiese definitiva do camundongo ocorre no baço e na medula óssea do camundongo adulto. Portanto, esses tecidos serão colhidos de um camundongo sacrificado. Após a eutanásia do camundongo, retire sangue por punção cardíaca em tubos de coleta de sangue de EDTA ou heparina, esse sangue será usado posteriormente para contagem de hematócrito, contagem de reticulócitos ou análise de hemograma completo.

Coloque o baço e o fêmur colhidos em tubos separados contendo coloração a frio. Buffer. Mantenha os lenços colhidos no gelo, se desejar. Pese o baço.

Camundongos submetidos a uma resposta eritropoiética ao estresse provavelmente apresentarão um aumento significativo no peso do baço. Posteriormente, as células do baço e da medula óssea são preparadas a partir dos tecidos colhidos por procedimentos demonstrados anteriormente no embrião de camundongo. A eritropoiese definitiva ocorre no fígado fetal entre os dias embrionários 12,5 e 15,5.

Camundongos fêmeas grávidas cronometrados são preparados para a obtenção de células hepáticas fetais nos dias 12,5 a 14,5 da gravidez. As ratas grávidas cronometradas são sacrificadas e os chifres uterinos são removidos para uma placa de Petri contendo gelo. Meio de cultura a frio ou tampão de coloração.

Um microscópio de dissecação é necessário para dissecar o fígado fetal do dia embrionário 12,5 ou mais jovem para remover embriões do útero. Primeiro separe cada conta do chifre. Em seguida, excise suavemente a parede do útero para liberar o embrião que está dentro de seu saco amniótico.

Retire suavemente a membrana amniótica. O fígado fetal é o maior tecido abdominal vermelho localizado embaixo de um coração muito menor. Para dissecar o fígado fetal, use uma pinça para imobilizar o embrião em ambos os lados do fígado e empurre suavemente o fígado para fora do abdômen para o meio.

Transferiu suavemente o fígado para um tubo contendo tampão de coloração fresco. Depois que todos os fígados fetais foram dissecados e transferidos para um tubo contendo coloração recente. Tampão dissociar os fígados mecanicamente por pipetagem e, em seguida, filtrar as células dissociadas através de uma tela de malha de náilon de 40 mícrons, lavar as células duas vezes por centrifugação, descartar o sobrenadante e ressus, suspendendo em tampão de coloração.

Após a segunda lavagem, corar as células com azul trian e contar usando um hemocitômetro. Um fígado fetal em E 13.5 tem cerca de 10 elevado ao sétimo. As células ressuspendem as células em uma a duas vezes 10 elevado à sexta célula por amostra de 200 microlitros para análise por citometria de fluxo.

Para os fins deste protocolo de vídeo, a coloração de anticorpos para citometria de fluxo será demonstrada apenas nas células hepáticas fetais. Para iniciar este procedimento, prepare uma pré-mistura de coloração de anticorpos primários contendo o seguinte: IgG de coelho purificada para bloquear os receptores FC em células de camundongo CD 71 FETR um 19 PE e um anticorpo direcionado à proteína da superfície celular rapidamente. Misture a solução de anticorpos suavemente invertendo o tubo duas a três vezes, adicione 200 microlitros da coloração primária de anticorpos pré-misturada à amostra de células hepáticas fetais previamente preparada e pipete para cima e para baixo suavemente para ressuspender as células.

Em seguida, prepare essas seis amostras de células de controle. Uma amostra não corada na qual as células são deixadas em tampão de coloração para fornecer a autofluorescência de fundo das células, uma única cor para cada anticorpo ou cor usada no protocolo para corrigir a sobreposição espectral entre os canais, que neste experimento são TUR um 19 PE CD 71 fz rápido, biotina e estreptavidina A PC e sete fluorescência A A DA menos um controle para biotina rápida, que fornece o verdadeiro pano de fundo para aquele canal onde as células são coradas com todas as cores ou anticorpos do protocolo, exceto a biotina rápida. Incubar a amostra e os controlos relevantes na coloração primária de anticorpos no gelo durante 45 minutos a uma hora no escuro.

No final da incubação, lave as células adicionando três mililitros de tampão de coloração a cada tubo de amostra e gire por três a cinco minutos a aproximadamente 400 vezes a gravidade a quatro graus Celsius. Em seguida, aplique o estreptococo ávido em um PC e incube os tubos no gelo por 30 a 45 minutos. No final da incubação, lave as células como para a primeira coloração de anticorpos.

Finalmente, ressuspenda as células em solução de coloração contendo a célula impermeável, corante de DNA sete a a d para excluir células mortas. As amostras agora estão prontas para análise de citometria de fluxo. O aspecto mais difícil deste procedimento é a análise correta dos eventos de citometria de fluxo, permitindo a identificação confiável de subconjuntos de eritroblastos.

Requer uma configuração cuidadosa da máquina de todas as amostras de controle corretas, compensação cuidadosa para sobreposição espectral e subsequente gating que exclui células mortas, agregados e eventos muito pequenos. No início da análise dos dados. A amostra não corada e as amostras de controle de cor única são usadas para configurar a compensação de sobreposição espectral para cada combinação de cores.

Neste exemplo, mostraremos como a fluorescência e se encaixa no canal PE e como essa sobreposição espectral é corrigida após a compensação. Primeiro, usando o controle não corado, definimos uma região E positiva e PE negativa. Em seguida, usando o controle de cor única E de ajuste, podemos visualizar o transbordamento espectral para o canal PE.

Após a compensação digital com o software FlowJo, o sinal E de ajuste de transbordamento no canal PE é minimizado. Uma vez compensadas as células mortas, agregados e pequenos eventos podem ser removidos. Agregados e dublês de células são removidos plotando a altura de dispersão direta versus a área de dispersão direta e selecionando eventos dentro de uma porta diagonal estreita.

As células mortas são removidas selecionando células negativas para dapi A cell impermeable DNA die. A porta celular viável negativa DAPI também exclui eventos muito pequenos, como núcleos ou detritos, que têm uma dispersão direta muito baixa. A seguir, mostraremos a estratégia de gating para células hepáticas fetais.

As células recém-colhidas foram marcadas para CD 71 TUR one 19 e um coquetel de anticorpos marcados com ZI direcionados a marcadores de linhagem não eritróides. Neste exemplo, as amostras já foram compensadas pela sobreposição espectral e, em seguida, fechadas para excluir células mortas agregadas e eventos muito pequenos. Usamos a amostra FMO que contém todas as cores, exceto a coloração fitzy positiva da linhagem para traçar um histograma fitzy e definir a porta celular negativa da linhagem, em seguida aplicamos essa porta à amostra de células hepáticas fetais que foi corada com marcadores de linhagem conjugados ZI.

As células de linhagem negativa são selecionadas e plotadas com CD 71 no eixo Y e TER um 19. No eixo A, as células agora estão prontas para serem divididas em subconjuntos S zero a S cinco. O subconjunto S zero empobrecido de Lin contém em grande parte células com potencial CFUE antes do início da dependência de EPO.

O subconjunto S um contém células CFUE dependentes de EPO em grande parte na fase S do ciclo celular. As células do subconjunto S dois perderam o potencial de formação de colônias e estão começando a expressar hemoglobina As células do subconjunto S3 são em grande parte basofílicas Os subconjuntos S quatro e S cinco contêm eritroblastos tardios. Aqui é mostrada a estratégia de análise seguindo a aquisição de dados de células do baço processadas e marcadas com anticorpos direcionados a CD 71 e TER one 19, bem como o histograma rápido do receptor de morte.

Um mostra todos os eventos adquiridos onde a porta diagonal representa eventos que provavelmente são células únicas, excluindo dupletos ou agregados maiores. As células nesta porta são analisadas no histograma dois aqui. Eventos muito pequenos, provavelmente núcleos ou detritos são excluídos.

As células fechadas são mostradas no histograma três, onde as células DAPI positivas que provavelmente são células apoptóticas permeáveis à membrana são excluídas de análises posteriores. O histograma quatro mostra a população resultante de células viáveis do baço. O pro eGate contém CD 71 TER alto um 19 Células intermediárias tur R um 19 células altas são analisadas posteriormente no histograma cinco.

Aqui, as células altas do CD 71 são subdivididas em eritroblastos de área grande menos madura, a e eritroblastos A B menores e mais maduros. O subconjunto de eritroblastos mais maduro é o ARI C. A expressão de proteínas de superfície celular pode ser medida simultaneamente para cada um desses subconjuntos, adicionando os anticorpos relevantes ao mesmo tempo que TER R um 19 e CD 71. O histograma de coloração seis mostra a expressão da superfície celular do receptor de morte rapidamente, especificamente na área, subconjunto A em camundongos no estado basal e camundongos injetados com uma dose única de E ppo.

Os resultados indicam que a EPO suprime a expressão rápida na área. Uma expressão in vivo de proteínas intracelulares ou status do ciclo celular também pode ser medida para células em cada subconjunto. Nesta análise representativa do ciclo celular, os camundongos foram injetados intraperitoneal com BRDU e a medula óssea foi colhida 30 a 60 minutos depois.

Além de serem coradas para CD 71 e TER one 19, as células foram coradas para incorporação de BRDU em suas células positivas replicantes D-N-A-B-R-D-U estão na fase S do ciclo. As células de interface são negativas para BRDU e podem ser resolvidas em fases G um ou G dois M. Usando o DNAD, sete células AA D podem ser classificadas de cada um dos subconjuntos PRO E da área A, AB e A EC.

Aqui eles são mostrados em preparações de citosina mostrando maturação sequencial com diminuição do tamanho da célula, condensação nuclear e aumento da coloração marrom, refletindo a expressão da hemoglobina. Finalmente, uma análise representativa do ciclo celular do subconjunto S3 no fígado fetal E 13.5 é mostrada aqui. Camundongos prenhes foram injetados com BRDU.

Os fígados fetais foram colhidos 30 a 60 minutos depois, fixados em perme e corados com anticorpos contra CD 71, TER one 19 e BRDU. O status do ciclo celular das células S3 é analisado onde estão as células da fase S. O conteúdo de BRDU positivo e de DNA é quantificado por coloração para o corante de DNA sete A a d.

A abordagem citométrica que descrevemos permite a investigação simultânea de funções celulares, como expressão de marcadores de superfície celular e outras proteínas, sobrevivência celular, sinalização celular usando anticorpos específicos do fosso e status do ciclo celular. Portanto, nos permite investigar as respostas moleculares dos eritroblastos, um estágio de maturação diferente de uma ampla gama de estímulos ou o efeito de mutações genéticas. Deve-se notar que os subconjuntos de maturação por citometria de fluxo são definidos em termos de expressão de marcadores de superfície celular e dispersão direta.

Descobrimos que, em geral, as células em cada subconjunto correspondem a um estágio morfológico semelhante de eritroblastos em uma ampla variedade de modelos de camundongos. No entanto, recomendamos verificar isso ao examinar um novo modelo de mouse. Ao classificar as células de cada subconjunto e examinar sua morfologia, as células de cada subconjunto também podem ser classificadas para análise de RNA ou transcriptoma, experimentos de classificação usam baixas pressões de classificação e narizes largos para minimizar o estresse absoluto nas células.

Também recomendamos verificar a pureza e a viabilidade da célula após cada experimento de classificação. Finalmente, ao detectar uma mudança na frequência de um determinado subconjunto, é importante determinar se isso se deve a uma mudança real no número de células nesse subconjunto ou se é devido a mudanças em outros subconjuntos. Portanto, além de medir as frequências dos subconjuntos, é sempre necessário medir também o número absoluto de células em cada subconjunto.