Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar diretamente precursores de eritrócitos em tecido recém-coletado de camundongos. Isso nos permite estudar suas propriedades moleculares durante períodos em que o sistema eritropoiético desses animais está passando por alterações. Por exemplo, durante o desenvolvimento embrionário ou em resposta ao estresse hipóxico, o tecido hematopoético inicial é isolado do fígado fetal de camundongo ou do baço adulto ou da medula óssea e dissociado em uma suspensão de células simples.

Em seguida, as células são marcadas com anticorpos contra os marcadores de superfície celular CD 71 e TER um 19, e com quaisquer outros marcadores de interesse; por exemplo, para medir a sobrevivência celular ou o estado do ciclo celular. A suspensão de células marcadas é então analisada usando um analisador de citometria de fluxo, e subpopulações específicas de eritroblastos em estágios distintos de maturação são identificadas. Essas subpopulações específicas podem ser purificadas por ordenação celular. Posteriormente, análises celulares e moleculares podem ser realizadas para cada subconjunto de maturação de eritroblastos.

A capacidade de identificar eritroblastos em estágios específicos de maturação diretamente em tecidos hematopoiéticos recém-isolados nos dá a oportunidade de estudar essas células no contexto fisiológico. Este método, portanto, nos permite estudar altas quantidades de eritroblastos em diferentes estágios de maturação, respondendo in vivo. Quando os camundongos são submetidos a estímulos, eles aceleram a taxa eritropoiética.

Por exemplo, condições hipóxicas que simulam altitude elevada ou injeção do hormônio eritropoietina. Utilizamos citometria de fluxo multiparamétrica para identificar eritroblastos dentro de um ambiente tecidual complexo e simultaneamente estudar seus sinais de sobrevivência e estado do ciclo celular. Também podemos classificar eritroblastos em estágios específicos de maturação diretamente a partir de tecido fresco e explorar seus níveis de expressão gênica, estado da cromatina ou outras funções moleculares.

A eritropoiese definitiva em camundongos ocorre no baço e na medula óssea do camundongo adulto. Portanto, esses tecidos serão coletados de um camundongo eutanasiado. Após a eutanásia, realize a punção cardíaca para coletar sangue em tubos de coleta contendo EDTA ou heparina; esse sangue será utilizado posteriormente para contagem de hematócrito, contagem de reticulócitos ou análise de hemograma completo (CBC).

Coloque o baço e o fêmur colhidos em tubos separados contendo tampão de coloração frio. Mantenha os tecidos colhidos em gelo, se desejar. Pese o baço.

Ratos submetidos a uma resposta de estresse eritropoiético tendem a apresentar um aumento significativo no peso do baço. Posteriormente, células do baço e células da medula óssea são preparadas a partir dos tecidos coletados por procedimentos demonstrados anteriormente no embrião de camundongo. A eritropoiese definitiva ocorre no fígado fetal entre os dias embrionários 12,5 e 15,5.

Camundongos fêmeas prenhes com tempo controlado são preparados para obtenção de células do fígado fetal entre os dias 12,5 e 14,5 de gestação. Os camundongos fêmeas prenhes com tempo controlado são eutanasiados e os cornos uterinos são removidos para uma placa de Petri contendo gelo. Meio de cultura frio ou tampão de coloração.

Um microscópio estereoscópico é necessário para dissecar o fígado fetal do dia embrionário 12,5 ou mais jovem, a fim de remover os embriões do útero. Primeiro, separe cada embrião do corno uterino. Em seguida, excise cuidadosamente a parede do útero para liberar o embrião contido em seu saco amniótico.

Remova cuidadosamente a membrana amniótica. O fígado fetal é o maior tecido abdominal vermelho localizado sob um coração muito menor. Para dissecar o fígado fetal, use pinças para imobilizar o embrião em ambos os lados do fígado e empurre suavemente o fígado para fora do abdômen, direcionando-o para o meio.

Transferiu-se suavemente o fígado para um tubo contendo tampão de coloração fresco. Após todos os fígados fetais terem sido dissecados e transferidos para um tubo contendo tampão de coloração fresco, dissociaram-se os fígados mecanicamente por pipetagem, em seguida filtraram-se as células dissociadas através de uma peneira de malha de náilon de 40 mícrons, lavando as células duas vezes por centrifugação, descartando o sobrenadante e ressuspendendo-as no tampão de coloração.

Após a segunda lavagem, corar as células com azul de trian e contá-las utilizando um hemocitômetro. Um fígado fetal em E 13,5 possui cerca de 10 elevado à sétima. Suspender as células novamente a uma concentração de um a dois vezes 10 elevado à sexta células por amostra de 200 microlitros para análise citométrica de fluxo.

Para os fins deste protocolo em vídeo, a coloração com anticorpos para citometria de fluxo será demonstrada apenas em células do fígado fetal. Para iniciar este procedimento, prepare uma mistura prévia de coloração com anticorpo primário contendo os seguintes componentes: IgG de coelho purificada para bloqueio de receptores Fc em células de camundongo, CD 71 FETR um 19 PE e um anticorpo direcionado à proteína da superfície celular fast. Misture suavemente a solução de anticorpos invertendo o tubo duas a três vezes, adicione 200 microlitros da mistura prévia de coloração com anticorpo primário à amostra de células do fígado fetal previamente preparada e pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células.

Em seguida, prepare estas seis amostras-controle de células. Uma amostra não corada, na qual as células são mantidas no tampão de marcação para fornecer a autofluorescência de fundo das células; uma cor única para cada anticorpo ou cor utilizada no protocolo, a fim de corrigir a sobreposição espectral entre os canais, que neste experimento são TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotina e estreptavidina A PC e sete A A DA; e um controle de fluorescência menos um para fast biotina, que fornece o fundo verdadeiro para esse canal, no qual as células são coradas com todas as cores ou anticorpos do protocolo, exceto o fast biotina. Incube a amostra e os controles relevantes com o anticorpo primário no gelo por 45 minutos a uma hora, no escuro.

No final da incubação, lave as células adicionando três mililitros de tampão de marcação a cada tubo de amostra e centrifugue por três a cinco minutos a aproximadamente 400 ×g a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione a estreptavidina em um PC e incube os tubos no gelo por 30 a 45 minutos. Ao final da incubação, lave as células como no caso da coloração com o primeiro anticorpo.

Por fim, re-suspenda as células em solução de coloração contendo o corante de DNA impermeável à célula, seven a a d, para excluir células mortas. As amostras estão agora prontas para análise por citometria de fluxo. O aspecto mais difícil deste procedimento é a análise correta do dimensionamento de eventos citométricos de fluxo, permitindo a identificação confiável de subpopulações de eritroblastos.

É necessário um cuidadoso ajuste do equipamento, todos os controles corretos, uma compensação cuidadosa para a sobreposição espectral e um subsequente gateamento que exclua células mortas, agregados e eventos muito pequenos. No início da análise de dados, a amostra não corada e as amostras controle de cor única são utilizadas para configurar a compensação da sobreposição espectral para cada combinação de cores.

Neste exemplo, mostraremos como a fluorescência do fit e se derrama no canal PE e como essa sobreposição espectral é corrigida após a compensação. Primeiro, utilizando o controle não corado, definimos uma região positiva para fit E e negativa para PE. Em seguida, usando o controle monocromático de fit E, podemos visualizar o vazamento espectral no canal PE.

Após a compensação digital com o software FlowJo, o sinal de sobreposição E no canal PE é minimizado. Após a compensação, podem ser removidas as células mortas, agregados e eventos pequenos. Agregados e duplos celulares são removidos ao plotar a altura do espalhamento frontal versus a área do espalhamento frontal e selecionar os eventos dentro de uma porta diagonal estreita.

Células mortas são removidas ao selecionar células que são negativas para DAPI, um corante de DNA impermeável a células. O gate de células viáveis negativas para DAPI também exclui eventos muito pequenos, como núcleos ou debris, que apresentam uma dispersão para frente muito baixa. Em seguida, mostraremos a estratégia de gate para células de fígado fetal.

Células recém-colhidas foram marcadas para CD71 TUR-um-19 e um coquetel de anticorpos marcados com ZI direcionados contra marcadores de linhagem não eritróide. Neste exemplo, as amostras já foram compensadas para sobreposição espectral e então selecionadas para excluir agregados, células mortas e eventos muito pequenos. Utilizamos a amostra FMO que contém todas as cores, exceto a coloração fitzi positiva para linhagem, para traçar um histograma fitzi e definir o gate de células linhagem-negativas; em seguida, aplicamos este gate à amostra de células de fígado fetal marcada com marcadores de linhagem conjugados ao ZI.

Células negativas para linhagem são selecionadas e plotadas com CD71 no eixo Y e TER119 no eixo X. No eixo A, as células estão agora prontas para serem divididas em subconjuntos de S0 a S5. O subconjunto S0 esgotado para linhagem contém principalmente células com potencial CFUE antes do início da dependência de EPO.

O subconjunto S1 contém células CFUE dependentes de EPO, predominantemente na fase S do ciclo celular. As células do subconjunto S2 perderam o potencial de formação de colônias e estão começando a expressar hemoglobina. As células do subconjunto S3 são predominantemente eritroblastos basófilos. Os subconjuntos S4 e S5 contêm eritroblastos tardios. Aqui é mostrada a estratégia de análise após a aquisição de dados de células do baço processadas e marcadas com anticorpos direcionados contra CD71 e TER119, bem como o histograma do receptor de morte FAST.

Um mostra todos os eventos adquiridos, em que o portão diagonal representa eventos que provavelmente são células únicas, excluindo dupletas ou agregados maiores. As células nesse portão são analisadas mais detalhadamente no histograma dois aqui. Eventos muito pequenos, provavelmente núcleos ou detritos, são excluídos.

As células selecionadas são mostradas no terceiro histograma, onde as células positivas para DAPI, que provavelmente são células apoptóticas com membrana permeável, são excluídas da análise subsequente. O quarto histograma mostra a população resultante de células viáveis do baço. O pro eGate contém células CD71 alta TER119 intermediária, enquanto as células R119 alta são analisadas adicionalmente no quinto histograma.

Aqui, as células CD71 altas são subdivididas em eritroblastos menos maduros de grande área e eritroblastos A B menores e mais maduros. O subconjunto de eritroblastos mais maduros é o ARI C. A expressão de proteínas de superfície celular pode ser medida simultaneamente para cada um desses subconjuntos mediante a adição dos anticorpos relevantes ao mesmo tempo que TER R one 19 e CD71. O histograma de coloração seis mostra a expressão na superfície celular do receptor de morte fast, especificamente no subconjunto A, em camundongos no estado basal e em camundongos injetados com uma única dose de E ppo.

Os resultados indicam que a EPO suprime a expressão rápida na área. A expressão populacional in vivo de proteínas intracelulares ou o estado do ciclo celular também podem ser medidos para células em cada subconjunto. Nesta análise representativa do ciclo celular, camundongos foram injetados intraperitonealmente com BRDU e a medula óssea foi coletada entre 30 e 60 minutos depois.

Além de serem coradas para CD71 e TER19, as células foram coradas para a incorporação de BrdU em seu DNA. As células positivas para BrdU estão na fase S do ciclo. As células de interface são negativas para BrdU e podem ser resolvidas nas fases G1 ou G2/M. Utilizando o DNAD7, as células AAD podem ser separadas de cada um dos subconjuntos PROE, área AAB e AEC.

Aqui eles são mostrados em preparações de citosinas, demonstrando maturação sequencial com redução do tamanho celular, condensação nuclear e aumento da coloração marrom, refletindo a expressão de hemoglobina. Por fim, é apresentada aqui uma análise representativa do ciclo celular do subconjunto S3 no fígado fetal de E 13,5. Camundongos grávidos foram injetados com BRDU.

Fígados de fetos foram coletados 30 a 60 minutos depois, fixados, permeabilizados e corados com anticorpos contra CD71, TER119 e BrdU. O estado do ciclo celular de células S3 é analisado, onde as células em fase S são positivas para BrdU e o conteúdo de DNA é quantificado por meio da coloração com o corante de DNA 7-AAD.

A abordagem citométrica que descrevemos permite a investigação simultânea de funções celulares, como a expressão de marcadores de superfície celular e outras proteínas, sobrevivência celular, sinalização celular utilizando anticorpos fosso-específicos e o estado do ciclo celular. Assim, permite-nos investigar as respostas moleculares de eritroblastos, em diferentes estágios de maturação, frente a uma ampla gama de estímulos ou ao efeito de mutações genéticas. Deve-se notar que os subconjuntos de maturação por citometria de fluxo são definidos em termos de expressão de marcadores de superfície celular e dispersão para a frente.

Descobrimos que, em geral, as células em cada subconjunto correspondem a estágios morfológicos semelhantes de eritroblastos em uma grande variedade de modelos de camundongos. No entanto, recomendamos verificar isso ao examinar um novo modelo de camundongo. Ao separar as células de cada subconjunto e analisar sua morfologia, as células de cada subconjunto também podem ser separadas para análise de RNA ou transcriptoma; experimentos de separação devem usar baixas pressões de separação e bocais largos para minimizar o estresse de cisalhamento nas células.

Recomendamos também verificar a pureza e a viabilidade celular após cada experimento de separação. Por fim, ao detectar uma alteração na frequência de um subconjunto específico, é importante determinar se isso se deve a uma alteração real no número de células desse subconjunto ou se é decorrente de mudanças em outros subconjuntos. Portanto, além de medir as frequências dos subconjuntos, é sempre necessário também mensurar o número absoluto de células em cada subconjunto.