Name: Análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de Embrião aviária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a avaliar quantitativamente a metástase de células tumorais humanas utilizando o modelo de membrana corioalantoica de embrião de galinha. Este método permite analisar a disseminação metastática com PCR específico.

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Queremos reconhecer Tyson Foods Inc. para fornecer generosamente os ovos fertilizados. Shanna Arnold foi fundamental durante as filmagens deste protocolo. Trenis Palmer foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde sob a Kirschstein Ruth L. Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (F31 Instituto Nacional do Câncer). Este trabalho foi parcialmente suportado pelo CCSRI Grant # 700537 para JDL e NIH / NCI conceder # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 a AZ.

1. Preparar os ovos para xeno (metástase espontânea) <ol><li> Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 10 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora. </li><li> No dia 10 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado. </li><li> A veia corioalantóicas está localizado e marcado. Esta veia é localizada na parte superior da casca do ovo onde é a junção de vários grandes vasos sanguíneos. Neste ponto de ramificação do vaso sanguíneo cai, longe do CAM e atribui ao embrião. A caixa quadrada um centímetro é desenhado com lápis na casca de ovo de aproximadamente um centímetro de distância do ponto de ramificação na veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo. </li><li> Usando uma ferramenta de corte rotativa (Dremel) equipado com uma pedra de carboneto de silicone de moagem (Dremel parte # 84922) de um buraco é perfurado através da extremidade sem corte do ovo para dentro do saco de ar. Usando esta ferramenta mesmo um buraco é perfurado dentro do quadrado previamente desenhado na parte superior do ovo, parando curto da membrana da casca. A agulha da seringa de calibre 25 com uma broca fina na ponta é usada para fazer um pequeno furo na membrana da casca com cuidado para não rasgar o CAM subjacente. O CAM é posteriormente separada da membrana da casca na região da praça usando sucção gentil criado com uma ajuda pipeta automática equipada com um pedaço de tubo de tygon ¼ "colocado contra o buraco na airsac. Após a aplicação de sucção, um bolsão de ar deve debaixo do buraco na praça significando que o CAM foi removida com sucesso longe da casca de ovo. Depois que o CAM é descartado, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60%, em antecipação de enxertia das células tumorais. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial. </li></ol> 2. Preparar os ovos para injecção intravenosa (metástase experimental) <ol><li> Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 12 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora. </li><li> No dia 12 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado. </li><li> A veia corioalantóicas está localizado e marcado. A um centímetro por 0,5 centímetro retângulo é desenhado com lápis na casca de ovo diretamente acima da veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo. </li><li> Uma pequena janela é criada na casca de ovo no local desenhado usando a broca dremmel (# 118). A janela é removida para expor a membrana de casca de ovo subjacente que é posteriormente prestados transparente com gota de óleo mineral. Ver figura 5A para uma representação gráfica. </li><li> Neste ponto, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60% na expectativa de injetar as células do tumor. </li></ol> 3. Preparar as células tumorais para enxertia ou injeção. <ol><li> Para xeno, as células do tumor são separadas de seus pratos de cultura usando Tripsina / EDTA e lavada com 10 volumes de tampão fosfato (PBS), a fim de remover qualquer mídia residual, Tripsina, ou EDTA. </li><li> Por via intravenosa, as células cultivadas são destacadas usando uma solução de células-dissociação não enzimática, e lavados com soro livre de DMEM. e) </li><li> As células são contadas com um hemocitômetro e ressuspendidas em PBS a 1-40 células / ml para enxertia, ou, alternativamente, ressuspenso em DMEM sem soro, 1 milhão de células / ml solução injectável IV. </li></ol> 4. Enxerto as células do tumor para o CAM recém-expostas (Metástase espontânea) <ol><li> Os ovos são retirados da incubadora e uma pequena janela é cortado no local da praça previamente elaborado, onde a bolsa de ar novo formou. Isso é mais facilmente feito com uma ferramenta rotativa equipada com uma roda de corte (ferramenta Dremel com a roda de corte # 409 circular). Um par de agulha nariz fórceps é usado para remover a seção pequena de casca de ovo e expor o CAM subjacente. </li><li> Usando um aplicador de algodão (Fisher Marca # 23-400-001) a CAM é abrasiva 5 vezes. Um pouco de sangue deve ser evidente no algodão. Imediatamente após o dano ao CAM, 25μl da suspensão de células é colocado sobre a área danificada. O número ideal de células e é determinadampirically mas pode variar de 5 a 0.5X10 1X10 6. A janela em que o ovo é hermeticamente fechadas com fita adesiva e os filhotes ficam em pé por 10-15 minutos, a fim de permitir que as células de resolver. Após 15 minutos os ovos são devolvidos à incubadora estacionário. </li><li> Os tumores são permitidos a crescer por 5-8 dias, dependendo da aplicação específica ea natureza da linha de células tumorais utilizados. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial. </li></ol> 5. Injeção intravenosa de células tumorais (metástases Experimental) <ol><li> Usando um calibre 30 100μl seringa de insulina de suspensão de células é injetado na veia alantóide de cada embrião, os ovos foram devolvidos para uma incubadora e lá permaneceu estacionária por mais 1-7 dias. </li><li> Em momentos distintos, o pulmão ou menor CAM são colhidas de cada embrião e processados ​​para a detecção de células tumorais, como descrito abaixo. </li></ol> 6. Tumores colheita e tecidos pinto <ol><li> A área de dissecção é preparado. O ensaio detecta células metastáticas através da quantificação de DNA humano através de um método altamente sensível PCR. Por isso é muito importante para evitar a contaminação com DNA exógeno. Dissecção é realizada em uma área dedicada e em todo o dissecções as ferramentas são limpos entre cada animal. , A fim de evitar a contaminação cruzada de suas amostras durante todo o processo de dissecação 3 conjuntos separados de ferramentas são utilizadas: um conjunto para cortar o ovo, um conjunto para remover o tumor primário e um conjunto para remover os órgãos internos. Além disso, quatro recipientes de lavagem são usados ​​para lavagem de ferramentas seqüenciais entre cada animal. Na seqüência estas lavagens são: 1) de água bidestilada, 2) de água bidestilada, 3) cloro, e 4) de etanol 70%. </li><li> Os ovos são retirados da incubadora estacionária e colocado em gelo por 15 minutos para anestesiar e sacrificar os animais. As janelas são abertas de tal forma que os tumores se tornam visíveis. Abrir as janelas maiores, removendo algumas das casca de ovo pode ser necessária. Os tumores primários são ressecadas do CAM, pesados ​​e processados ​​para histologia. </li><li> O filhote é removido da casca de ovo, cortando a casca radialmente em metades iguais. O embrião é decantada a partir do shell de corte e transferido para um lado limpo da mama pesar barco para cima. O animal é dissecado com o uso de um conjunto fresco e limpo de ferramentas. O animal é aberta cortando o esterno. Uma vez que o embrião é aberta, um pedaço do fígado de qualquer lobo direita ou esquerda é coletado. Os órgãos internos são subseqüentemente removidos puxando suavemente sobre o esôfago ligado à moela e corte a visera que ligam os órgãos. A fim de recolher os pulmões cortar a caixa torácica é aberta a placa de mama é separado eo coração é removido. Neste ponto, é possível cortar em torno dos quatro lados do pulmão (parte superior mais próximo à cabeça do lado esquerdo ao longo da caixa torácica, a parte inferior perto do diafragma eo lado direito ao longo da traquéia). Por uma questão de coerência, mesmo pulmão são coletadas em cada animal. Colhidas amostras de tecido são armazenadas a -20 ° C para uso posterior, ou pode ser processado imediatamente para o isolamento de DNA. </li></ol> 7. Isolamento do DNA genômico e Análise de PCR quantitativo <ol><li> DNA genômico é extraído de tecidos utilizando o SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). O DNA extraído pode ser transferido para um tubo eppendorf limpo e armazenado a -20 ° C ou usado imediatamente. É importante para diluir o DNA 1:50 em água livre de nuclease antes de o utilizar na reação de PCR subseqüente. Alternativamente, o DNA pode ser extraído usando qualquer número de protocolos padrão de extração de DNA (Zijlstra et al., 2002). </li><li> DNA humano é detectada nos tecidos específicos pinto usando PCR quantitativo para seqüências Alu humana. PCR quantitativo utilizando Alu-primers específicos é realizada utilizando a amplificação SYBR verde do kit Exract-N-Amp. O kit PCR vem com um mix de reação contendo SYBR 2x verde, tampão, dNTPs sais, polimerase Taq Antibody eo Jumpstart Taq. A mistura de reação é feita em um volume final de 15μl, com 0.4μM de cada primer. Para a maioria dos casos, usando o DNA extraído diluído 1:50 irá fornecer dados quantitativos, no entanto, a quantidade ideal de DNA modelo pode precisar de ser otimizado empiricamente. Primers GAPDH de frango são usados ​​como um controle interno da PCR é executado sob as seguintes condições para seqüências Alu: ativação da polimerase a 95 ° C por 2 min, seguido por 30 ciclos de 95 ° C por 30 s., 63 ° C por 30 s. , 72 ° C por 30 s. As condições de reação para a galinha GAPDH são idênticos aos descritos para Alu no entanto pode ser necessário estender o PCR para 40 ciclos. </li><li> Análise quantitativa de metástase é realizada usando o método ΔΔCt comparando grupos experimentais com um grupo controle (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativamente, uma curva padrão pode ser gerada através de uma série de diluição de células tumorais humanas extraídas usando o kit Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). Significância estatística é avaliada utilizando teste t de Student ou Anova análise dos grupos controle e experimental. </li></ol> 8. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A galinha modelo de metástase embrião. A) Um diagrama de painel de quatro ilustrando a aparência do modelo em corte transversal em etapas fundamentais: 1. Após 10 dias de incubação. O CAM chegou próxima do máximo tamanho. As artérias e veias são claramente visíveis com a veia alantóide posicionado contra a parte superior do ovo. 2. O ovo imediatamente após a perfuração de dois furos na casca de ovo: uma para o airsac e um ao lado do ponto de fixação para a veia alantóide. 3. A aparência depois de um leve vácuo tem sido usada para evacuar o airsac e solte o CAM. Células tumorais (azul) são aplicadas ao CAM caiu. 4. Após permitir que a célula tumoral enxertados a crescer, o tumor, juntamente com os tecidos do embrião da galinha são colhidas para análise B) A representação de série do modelo: 1.. Incubar os ovos., 2. Marcando a localização da veia alantóide., 3. Furos na casca de ovo., 4. Deixar cair o CAM., 5. Cortar uma abertura para células tumorais enxertia., 6. Aplicar as células do tumor., 7. Refrigeração dos ovos em gelo antes da coleta de tecido., 8. Colhendo o tumor após 7 dias de crescimento. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Histologia dos tumores CAM. Tecidos retirados de membrana tendo tumor corioalantóicas foi fixada em formalina, seccionados e processados ​​com uma mancha tricrômico. A) tumor HEp3 após sete dias de crescimento sobre a CAM. B e C mostram regiões ampliada de A mostra estroma e neoplásico. D) normals CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análise longitudinal quantitativa de metástase. Variantes para a cabeça e pescoço com carcinoma HEp3 alta ou baixa capacidade metastática (HEp3 M (High) e HEp3 M (Baixo), respectivamente) foram analisados ​​por sua capacidade de disseminar o uso Alu PCR. Dez animais foram analisados ​​em cada momento para a duração de 7 dias. Estas amostras foram quantificadas contra uma curva padrão e, posteriormente, expressa como # cells/50mg tecido. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. A inibição de células metástase espontânea nos animais tratados com a metástase 1A5 anticorpos inibidores. Tumores foram formados com 5x10 5 células HEp3 aplicada ao CAM do dia 10 embriões. Três dias após a aplicação das células do tumor de metade dos animais foram tratados com o anticorpo anti-CD151 1A5. Os pulmões dos animais portadores de tumor foram colhidos dois dias depois e submetida a quantitativa em tempo real alu PCR. Por outro lado quantitativo PCR em tempo real de chGAPDH foi usado para confirmar a presença de quantidades equivalentes de DNA genômico host (O método ΔΔCt foi usado para comparar os dois grupos quantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Avaliar prisão, crescimento e intravasation na cascata metastática. Fundamentalmente, a metástase para um órgão secundário é definido pelas contribuições de três aspectos: taxa de detenção, de crescimento e taxa de intravasation. Estes podem ser quantificados utilizando uma combinação de metástase experimental (A) e metástase espontânea (B). Usando metástase experimental (A) prisão é definido como o número de células detectadas após a injeção 2hr. Sobrevivência e crescimento das células preso é determinada como a mudança na célula pós-injeção número 24h. Crescimento é definida como a taxa de proliferação durante os dias 3-7. Intravasation é determinada utilizando metástase espontânea (B), onde as células intravasated número é definido como o presente ônus metastático no dia 7 que exceda o valor previsto pelo crescimento da carga metastático presentes no dia 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Expansão visualização do metastática no CAM. HEp3 células expressando GFP foram injetados por via intravenosa em 12 dias de desenvolvimento. No dia 1, 3 e 5 um ovo foi sacrificado e uma seção de CAM foi fotografada com um microscópio estéreo fluorescente. O fundo verde escura é criado por casca do ovo, a vascularização é visível como linhas pretas, e as células do tumor são visíveis como pontos luminosos verdes.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
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<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
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<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
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<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
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<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O CAM pinto tem sido utilizada há décadas como um sistema modelo para estudar vários aspectos da biologia e progressão do câncer metastático. Avaliação princípio da capacidade metastática foram realizados neste modelo por uma variedade de grupos, incluindo a análise de dormência (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), remodelação do tecido (Deryugina et al, 2005;. Hahn-DANTONA . et al, 1999), e metástase (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Ele contin...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Modificado 1X Dulbecco Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco tampão fosfato (D-PBS) (1X), líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4NA, líquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman nascedouro </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Estas incubadoras são alguns dos mais prontamente disponíveis. No entanto, o vídeo vai mostrar diferentes equipamentos. </td></tr><tr><td> Sportsman incubadora </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Ferramenta rotativa Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodas de corte Dremel não. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Ajuda Pipetar portáteis </td><td> Pescador </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Derrubado Aplicadores de algodão </td><td> Pescador </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Ovos fertilizados </td><td> Vários </td><td></td><td> Fornecedor diferente muitos podem ser usados. Os ovos devem ser de aproximadamente 35-55 gramas. As galinhas que estabelece-los deve ser entre 36 e 55 semanas de idade. </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Scientific, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Iluminador de fibra óptica de microscópio </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 25 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de embrião aviária

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Durante as células do câncer disseminar metástases do tumor primário, invade os tecidos em volta, e se espalhou para órgãos distantes. Metástase é um processo complexo que pode envolver muitos tipos de tecido, períodos de tempo variável extensão, e muitas vezes ocorrem profundamente dentro dos órgãos, o que torna difícil para investigar e quantificar. Além disso, a eficácia do processo metastático é influenciado por várias etapas da cascata metastática que torna difícil avaliar a contribuição de um único aspecto do comportamento de células tumorais. Como conseqüência, os ensaios metástases são freqüentemente realizados em animais experimentais para fornecer um contexto necessariamente realistas para estudar metástase. Infelizmente, estes modelos são ainda mais complicada pela sua complexa fisiologia. O embrião de galinha é um exclusivo modelo in vivo que supera muitas limitações para estudar metástase, devido à acessibilidade da membrana corioalantóide (CAM), um tecido bem vascularizado extra-embrionárias localizado por baixo da casca do ovo que está receptivo à xeno-enxerto de células tumorais (figura 1). Além disso, desde o embrião de galinha é, naturalmente, imunodeficientes, o CAM prontamente suporta o enxerto de tecidos normais e tumorais. Mais importante, a CAM aviária com sucesso suporta características celulares mais câncer incluindo o crescimento, invasão, angiogênese e remodelação do microambiente. Isso faz com que o modelo extremamente útil para a investigação das vias que levam à metástase do câncer e para prever a resposta do câncer metastático de novas terapêuticas potenciais. A detecção de células divulgada pela espécie-específicos Alu PCR torna possível avaliar quantitativamente a metástase em órgãos que são colonizados por apenas 25 células. Usando a linha de células carcinoma epidermóide Humanos (HEp3) usamos esse modelo para analisar a metástase espontânea de células cancerosas para órgãos distantes, incluindo o fígado e pulmão pinto. Além disso, usando o protocolo Alu-PCR que demonstram a sensibilidade ea reprodutibilidade do ensaio como uma ferramenta para analisar e quantificar intravasation, parada, extravasamento, colonização e como elementos individuais de metástases.

Usando PCR quantitativo, demonstramos como o bem-estabelecida pinto modelo CAM pode ser usado para analisar quantitativamente a metástase de células tumorais para órgãos distantes.

Análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de Embrião aviária

Durante a metástase, as células cancerígenas disseminam-se a partir do tumor primário, invadem os tecidos circundantes e espalham-se para órgãos distantes. A metástase é um processo complexo...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar quantitativamente a capacidade metastática de células cancerígenas utilizando a membrana corioalantoide ou CAM como modelo de xenoenxerto. Isso é realizado primeiramente incubando ovos fertilizados até que desenvolvam uma CAM madura. O segundo passo do procedimento consiste em injetar intravenosamente ou enxertar topicamente células tumorais na CAM.Após um intervalo de tempo definido experimentalmente, o tecido é coletado para análise, em seguida a metástase é quantificada utilizando PCR específica para humanos direcionada à sequência do alelo humano e os resultados são analisados. Meu nome é Trent Palmer. Sou aluno de pós-graduação no laboratório do Dr. Andre Zilstra.Vou demonstrar o modelo de xenoenxerto e de metástase espontânea, enquanto meu orientador, Dr. Zilstra, demonstrará a injeção intravenosa e o modelo de metástase experimental. A principal vantagem dessa técnica em relação aos modelos existentes é a rapidez e facilidade com que um pesquisador pode realizar estudos quantitativos. A metástase de células tumorais humanas pode ser analisada, e os pesquisadores podem preparar aproximadamente 120 animais e concluir todo o protocolo, do início ao fim, em um período de duas semanas.Devido à acessibilidade do embrião de galinha e à facilidade de manipulação, o sistema é prontamente estendido a outras aplicações X ovo. Isso foi realizado por nós nos últimos anos e é o tema de outros verticais do JoVE. Ovos de galinha fertilizados recém-postos são incubados em uma incubadora rotativa quatro vezes por hora durante 10 dias.No 10º dia, coloque os ovos de lado em uma bandeja para ovos e direcione uma fonte de luz intensa e direta para a casca do ovo na extremidade arredondada, onde se localiza o saco de ar. Em seguida, localize o ponto de bifurcação da veia choica. Ele é identificado mais facilmente girando o ovo em até 20 graus em torno de seu eixo longo.Para visualizar o ponto em que o vaso se afasta da casca, a um centímetro do ponto de ramificação da veia cória, desenhe uma caixa quadrada de um centímetro. Em seguida, limpe a área ao redor da caixa com um cotonete embebido em iodo. Usando uma dremel equipada com uma pedra de moagem de carbeto de silício, primeiro faça um furo na extremidade romba do ovo até atingir o saco de ar, e depois faça um furo dentro do quadrado, parando antes da membrana da casca do ovo.Agora, use cuidadosamente uma agulha de 25 mm com uma borda fina na extremidade para puxar para trás a membrana da casca do ovo corretamente. Isso não rasgará a câmara subjacente nem a descolará da membrana subjacente. Utilize uma pipeta automática acoplada a um pedaço de tubo de tigon de um quarto de polegada.Aplique sucção suave no orifício da bolsa de ar e verifique a presença de um bolsão de ar sob o orifício no quadrado, indicando sucesso. Se o came for danificado durante a ruptura da membrana da casca do ovo, a lata não cairá de maneira evidente. Quando a bolsa de ar é sugada durante a rotação do ovo, o ar visível logo abaixo da casca é o que é puxado para dentro e sob o came danificado.Esses ovos não podem ser utilizados após a queda do came. Tape ambas as aberturas com um pedaço de fita laboratorial e devolva os ovos a uma incubadora estacionária. Os ovos estão agora prontos para xenotransplante.Inicie o preparo das células tumorais para xenotransplante. Primeiro, desprenda as células dos seus frascos de cultura utilizando tripsina EDTA. Finalize o preparo das células medindo sua densidade com um hemocitômetro e re suspenda-as em PBS a 10 a 40 milhões de células por mililitro.Agora, após esterilizar a cabine e a ferramenta dremmel com etanol, remova os ovos do incubador. Abra uma janela na parte superior da casca do ovo e, com um aplicador de algodão, passe o cam cinco vezes; um pouco de sangue deve ficar evidente no algodão na área danificada. Imediatamente, injete 25 microlitros da suspensão celular entre meio milhão e um milhão de células.Agora, feche a janela com fita adesiva laboratorial e deixe as células sedimentarem por 10 a 15 minutos. Após 15 minutos, devolva os ovos ao incubador estacionário, onde os tumores poderão crescer por cinco a oito dias. Utilizando a mesma incubação demonstrada na seção dois, colete ovos com 12 dias de idade.Posicione um ovo diante da fonte de luz para localizar e marcar a veia corioalantoide e a veia tóica diretamente acima da veia. Faça um retângulo de um centímetro por 0,5 centímetro e limpe a área com um cotonete embebido em iodo. Agora, usando um dremel equipado com uma broca, faça uma pequena janela na casca do ovo no retângulo.Remova cuidadosamente a janela da casca do ovo para expor a membrana subjacente. Adicione uma gota de óleo mineral sobre a membrana exposta, tornando-a transparente. Retire os ovos do incubador e utilize uma seringa de insulina com agulha de 30 graus.Injete 100 microlitros de suspensão celular na veia auicular de cada embrião. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva laboratorial sobre as membranas expostas e devolva os ovos a uma incubadora estacionária pelos próximos um a sete dias. O pulmão ou a câmara inferior é coletado para a detecção de células tumorais conforme demonstrado na seção a seguir.É fundamental realizar esta etapa do procedimento em uma área dedicada a dissecações e com chance absolutamente mínima de contato com DNA. Para prevenir contaminação cruzada das amostras, utilize três conjuntos separados de instrumentos para cortar o ovo, remover o tumor primário e remover os órgãos internos, antes de iniciar e entre as dissecações. Lave cada conjunto de instrumentos uma vez com água sanitária, uma vez com etanol 70% e duas vezes com água destilada duplamente. Os ovos são removidos do incubador estacionário e colocados sobre gelo por 15 minutos. Para anestesiar e eutanasiar os animais, as janelas são abertas de modo que os tumores fiquem visíveis. Pode ser necessário ampliar as janelas para expor completamente os tumores.Agora, remova os tumores primários da câmara. Usando um conjunto limpo de instrumentos, pese os tumores e processe-os para histologia. Em seguida, prossiga com a coleta dos órgãos.Inicie removendo o embrião de galinha da casca do ovo. Para fazer isso, corte a casca radialmente em duas metades iguais. Em seguida, despeje o embrião de galinha a partir do corte.Retire também duas peças de cório-alantóide de cada lado da casca do ovo utilizando uma ferramenta de perfuração e coloque-as em um tubo eppendorf. Transfira o pintinho para um barquinho de soro com a face esternal voltada para cima. Usando um conjunto limpo de instrumentos de dissecação, abra o embrião cortando o abdômen e o esterno e expondo a cavidade abdominal.Primeiro, colete um pedaço do fígado do lobo direito ou esquerdo. Agora, os órgãos podem ser cuidadosamente retirados enquanto se cortam as vísceras que os conectam. Selecione um pulmão e corte ao redor de seus quatro lados para soltá-lo da caixa torácica.Para garantir consistência, colete o mesmo pulmão de cada animal. Se algum dos órgãos não for processado imediatamente, armazene-os a menos 20 graus Celsius.Após a remoção de um xenoenxerto hepático, foi realizada uma análise histológica do tumor. Esta é uma coloração tri RME do tumor Hep três. O componente estromal do tumor é claramente evidente entre os lobos distintos do tumor.Aqui, células hepáticas três injetadas intravenosamente e expressando GFP são visualizadas por microscopia fluorescente. Um dia após a injeção intravenosa, apenas células tumorais individuais dispersas são visíveis; três dias após a injeção, é evidente que o número de células está aumentando e pequenas colônias de células metastáticas estão se formando aqui. O nível de metástase ao longo de sete dias após o enxerto foi quantificado utilizando PCR em tempo real para a sequência humana A LU.A técnica que demonstramos aqui hoje é um modelo de alto valor altamente quantitativo. Uma vez dominada, um pesquisador pode preparar aproximadamente 30 animais por hora e, adicionalmente, em um período de duas semanas, a metástase pode ser analisada quantitativamente utilizando o modelo de embrião aviano após o seu desenvolvimento. Esta técnica permitiu aos pesquisadores na área da biologia do câncer analisar quantitativamente a metástase utilizando um modelo naturalmente imunodeficiente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de células de câncer de mama no espaço perivitelino de embriões transgênicos de peixe-zebra. Após a incubação, visualizamos o embrião sob um microscópio fluorescente para observar a invasão, disseminação e metástase das células cancerígenas.

zPDX-Análise de Invasividade: Investigando o Comportamento Invasivo de Células Cancerígenas Metastáticas em Xenoenxertos de Embrião de Peixe-Zebra

Neste vídeo, descrevemos a implantação de células cancerígenas em uma membrana corioalantóide de galinha para gerar um modelo in ovo. O modelo enxerta com sucesso as células do câncer de ovário para estudar a progressão do câncer ginecológico.

Modelagem de câncer baseada em membrana corioalantóide de frango: um modelo in ovo para estudar tumorigênese e metástase de células cancerígenas

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção intravenosa de células cancerígenas na vasculatura da membrana corioalantóide de galinha para gerar um modelo de metástase de câncer CAM. As células injetadas eventualmente formam colônias dispersas de células cancerígenas, permitindo o estudo da invasão e metástase do câncer.

Injeção intravenosa de células cancerígenas na vasculatura da membrana corioalantóide de galinha: um procedimento para estabelecer o modelo de câncer de membrana corioalantóide para estudar a invasão e metástase do câncer

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.

Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.

Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

O ensaio cam-delam para avaliar a capacidade metastática das células cancerosas é relativamente rápido, fácil e barato. O método pode ser usado para desvendar os mecanismos moleculares que regulam a formação de metástase e para a triagem de drogas. Um ensaio otimizado para análise de amostras de tumores humanos pode ser um método clínico para tratamento personalizado do câncer.

Ensaio cam-delam para pontuação de propriedades metastáticas quantificando a capacidade de delaminação e invasão de células cancerosas

Aprenda a avaliar quantitativamente a metástase de células tumorais humanas utilizando o modelo de membrana corioalantoica de embrião de galinha. Este método permite analisar a disseminação metastática com PCR específico.

Análise quantitativa de metástase de câncer utilizando um modelo de Embrião aviária

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