Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir oncogenes ou outros genes potencialmente perigosos em células humanas utilizando lentivírus ecotrópico. Isso é alcançado pela produção de lentivírus pantrópico, que codifica o receptor do retrovírus murino, bem como lentivírus ecotrópico que codifica o gene de interesse. As células são transduzidas com o receptor do retrovírus murino, o que as torna suscetíveis à transdução com o vírus ecotrópico. Em seguida, as células são transduzidas com o vírus ecotrópico para introduzir o oncogene, utilizando complexação com polímeros de poli-cérebro e sulfato de condroitina para potencializar a transdução. Os resultados obtidos demonstram transdução seletiva de células humanas com lentivírus ecotrópico com base em microscopia fluorescente e fatos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transdução por retrovírus gama, é que partículas lentivirais podem transduzir de forma mais eficaz diversos tipos celulares, incluindo células não divididas, como as células-tronco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da pesquisa de câncer e células-tronco, como compreender a função de oncogenes potenciais. Antes de iniciar este procedimento, consulte o responsável pela segurança institucional e siga as diretrizes de segurança recomendadas.

Inicie com um cultivo de células 293T saudáveis e em rápido crescimento, trabalhando em uma câmara de cultura tecidual. Em condições assépticas, ressuspenda cinco vezes 10 elevado a 6 células 293T em 10 mililitros de meio para 293T sem antibiótico. Pipete a suspensão celular em uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros e incube a placa durante a noite em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No dia seguinte, inicie a transfeção na parte final da tarde. Primeiro, colete uma alíquota de Optum e dos plasmídeos de transferência, empacotamento e envelope, e deixe-os aquecerem até a temperatura ambiente. Pipete 375 microlitros de optimum em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicione 25 microlitros do reagente de transfeção FU gene HD. Certifique-se de que o reagente FU gene seja pipetado diretamente no meio e não toque nas paredes do tubo.

Em seguida, em um segundo tubo de microcentrífuga, combine cinco microgramas do plasmídeo de transferência, 3,75 microgramas do plasmídeo de empacotamento e 1,25 microgramas do plasmídeo de envelope na quantidade necessária de OptiMEM para completar o volume até 100 microlitros. Em seguida, adicione a mistura OptiMEM ao tubo contendo a mistura de plasmídeos e incube em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Durante os últimos minutos da incubação, aspire suavemente o meio do recipiente contendo as células 293T e substitua por 10 mililitros de meio fresco para 293T sem antibiótico.

Por fim, adicione gota a gota a mistura de plasmídeo do gene FU ao meio do placa de 10 centímetros. Coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos ajustado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube durante a noite. No dia seguinte, aspire muito cuidadosamente o meio da placa e substitua por meio 2 9 3 T fresco, sem antibiótico.

Em seguida, devolva a placa ao incubador de cultura de tecidos e incube por mais dois dias. Três dias após a transfeção, aspire o meio contendo o vírus da placa e filtre-o utilizando um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 mícron. Após a filtração, faça diluições seriadas de um vírus controle fluorescente em meio fresco sem antibiótico contendo seis microgramas por mililitro de polibrena, e utilize essas diluições para transduzir células da linhagem celular apropriada. No dia seguinte, em uma placa de 24 poços, troque o meio por meio fresco sem antibiótico e continue a incubação por mais dois dias para permitir que as células expressem a proteína fluorescente.

Utilize os dados obtidos para determinar a fração de células transduzidas para cada diluição viral. Em seguida, calcule o título em unidades transformantes por mililitro com base nas diluições que resultam em menos de 15% de transdução, a fim de minimizar eventos de transdução múltipla. Presume-se que os títulos de outros lentivírus não fluorescentes produzidos em paralelo sejam semelhantes ao do vírus fluorescente.

Para transduzir células-alvo, comece selecionando uma multiplicidade de infecção maior que dois para garantir que a maioria das células seja transduzida. Primeiro, dilua o sobrenadante viral na multiplicidade de infecção necessária em meio de cultura completo fresco, suplementado com seis microgramas por mililitro de polibrena, até um volume final de um mililitro.

Aspire o meio de um prato de 35 milímetros contendo as células-alvo e adicione um mililitro do sobrenadante viral diluído. Incube na estufa de cultura de tecidos por 24 a 48 horas para permitir expressão suficiente do receptor SLC7A1, se desejado. Utilize seleção com antibiótico blasticidina para selecionar células transduzidas de forma estável que expressem SLC7A1, conforme as instruções no procedimento escrito.

Para iniciar a determinação de toxicidade, prepare uma solução estoque de 20 miligramas por mililitro de sulfato de condroitina e uma solução estoque de 20 miligramas por mililitro de poli cérebro em água e filtre esterilizando. Soluções estoque excedentes podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius até o momento do uso.

Em seguida, determine o número de culturas celulares em placas de 96 poços necessárias para determinar com precisão a toxicidade do complexo polimérico. Utilizando o ensaio MTT, pelo menos seis concentrações de sulfato de condroitina e poli verde devem ser testadas em triplicata. Além disso, inclua células não tratadas e células cultivadas em meio sem soro.

O meio deve ser incluído para fornecer uma linha de base para células saudáveis e para controlar respectivamente a parada de crescimento. Uma vez determinado o número de poços necessários, semeie 5.000 células-alvo em cada poço de uma placa de 96 poços, semeando paralelamente células em uma placa de 24 poços para análise microscópica ou baseada em fatos da eficiência de transdução em cada condição experimental; deixe ambos os conjuntos de células crescerem durante a noite. No dia seguinte, adicione uma alíquota da solução estoque de sulfato de condroitina e uma alíquota da solução estoque de poli-cérebro.

Em seguida, dilua o vírus que codifica a GFP em meio livre de antibiótico contendo seis microgramas por mililitro de polibrena, a uma multiplicidade de infecção suficiente para transduzir cerca de 10 a 50% das células-alvo por poço. Certifique-se de que haja vírus diluído suficiente para cada condição de teste, além dos poços controle em cada placa. Rotule um conjunto de tubos com cada concentração de sulfato de condroitina e polímero poliverde a ser testada.

Em seguida, alíquotar quantidade suficiente da suspensão viral para cada condição em triplicata nos tubos. Depois, pipetar o volume necessário da solução estoque de sulfato de condroitina e poli cérebro para atingir as concentrações-teste em cada um dos tubos sucessivamente. Imediatamente após a adição de sulfato de condroitina e poli verde, agitar levemente o tubo para homogeneizar.

Deixe as misturas de vírus, condroitina sulfato e poli verde incubarem à temperatura ambiente por cinco minutos. A mistura pode ficar turva à medida que os precipitados virais se formam. Após a incubação, aspire o meio dos poços da placa de 96 poços.

Em seguida, adicione a mistura de vírus, condroitina sulfato e poli verde aos poços conforme planejado. Pipete também o controle e o meio livre de soro nos poços apropriados. Repita o processo para a placa de 24 poços e incube durante a noite no incubador de cultura de tecidos.

Em seguida, aspire o meio contendo o vírus das placas e substitua por meio fresco. Retorne as placas ao incubador por 48 horas. Após 48 horas, remova a placa de 24 poços e utilize os dados para analisar a eficiência de transdução de cada concentração de sulfato de condroitina e poli cérebro.

No dia seguinte, aspire o meio de todos os poços da placa de 96 poços e substitua por 100 microlitros de solução de MTT, cultivando por três horas em incubadora umidificada para permitir a redução do MTT nas mitocôndrias de células metabolicamente ativas. Após três horas, aspire a solução de MTT e substitua por 200 microlitros de solução solvente.

Incube a placa por duas horas à temperatura ambiente ou até que todo o púrpura MTT formado e o precipitado sejam dissolvidos. Leia a absorbância em um leitor de microplacas a 570 nanômetros, subtraindo a leitura de fundo a 690 nanômetros. A concentração ótima do polímero produzirá o máximo de potencialização da transdução conforme determinado por fatos, com efeito mínimo sobre a atividade metabólica conforme determinado pelo MTT para hdfs.

100 microgramas por mililitro de sulfato de condroitina. O Poly brain é a concentração polimérica ideal determinada por este método. Primeiro, prepare quantidade suficiente da mistura de sobrenadante viral de poli verde com sulfato de condroitina a 100 microgramas por mililitro para transduzir o número necessário de placas de 35 milímetros de células HDF que expressam o receptor SLC sete A um. Incube a mistura por cinco minutos para permitir a formação de complexos poliméricos.

Em seguida, aspire o meio das células-alvo que expressam o receptor e substitua pela mistura viral. Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a remoção da mistura viral, lave a superfície das células duas vezes com PBS para auxiliar na remoção dos complexos virais. A remoção completa não é necessária, pois não foram observados efeitos adversos na saúde celular decorrentes de complexos poliméricos residuais.

Esta imagem de microscopia de fluorescência ilustra uma transdução suficiente de células de sarcoma humano, expressando estavelmente SLC sete A um com vírus trópico ao utilizar vetores de controle fluorescentes para monitorar a eficiência de transdução. A quantificação da fluorescência por meio de análise de fax demonstra uma eficiência de transdução superior a 90%. As taxas de transdução de HDFS são geralmente menores porque as células não foram ativadas ou selecionadas para expressão de receptores; os títulos de lentivírus atrópicos geralmente são de 10 a 20% do vírus pseudotipado com VSV, conforme medido em S-L-C-H-S-C. O ensaio de viabilidade MTT permite a detecção sensível da parada de crescimento em células-alvo, como observado aqui, após transdução com vírus e concentrações de sulfato de condroitina.

Polímeros cerebrais de até 800 microgramas por mililitro não têm efeito sobre o metabolismo de HDF. Análise de fax de HDFs transduzidas com vírus mais várias concentrações de sulfato de condroitina. O polímero verde mostra aumento da transdução em comparação com o polímero verde isolado.

A máxima potencialização ocorre em 100 microgramas por mililitro. O poli-sulfato de condroitina no cérebro é várias vezes menor do que os valores previamente relatados. Assim, é importante otimizar as condições para qualquer tipo celular específico em relação à complexação com sulfato de condroitina.

O poli cérebro aumenta o título observado, aproximadamente três vezes no S-L-C-H-S-C. Na prática, isso resulta em um efeito maior na eficiência de transdução em concentrações baixas de vírus do que em concentrações mais altas, o que provavelmente se deve à presença de múltiplas células transduzidas e à saturação de receptores em concentrações elevadas de vírus. A transdução com vírus trópico é específica para células que expressam o receptor de retrovírus neuronal.

Ao transduzir células humanas não modificadas com vírus trópico, fluorescência superior ao fundo não reduzido não foi observada, conforme visto pela análise por microscopia. Os HDFs não mostram transdução na ausência de receptor, enquanto a pré-transdução com receptor resulta em células fluorescentes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar se o vírus não irá transduzir células humanas modificadas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar lentivírus trópico para entregar genes potencialmente perigosos a células humanas, incluindo o uso da complexação com polímero para aumentar a transdução.