Name: Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Aprenda a transduzir células humanas com lentivírus ecotrópico complexado com polímero para introduzir oncogenes com maior biossegurança. Este método utiliza microscopia de fluorescência e FACS para avaliar a eficiência da transdução em pesquisa de terapia gênica.

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Financiamento para este projeto foi fornecido pelo Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa.

1. Produção, coleta e congelamento de lentivírus
<ol>
	<li>Consulte o responsável pela segurança institucional antes de iniciar este protocolo e siga as diretrizes de segurança recomendadas.</li>
	<li>Dia 1. Inicie com células 293T saudáveis e em rápido crescimento para produzir o vírus. Plaque as células em 5 x 106 
	células por placa de 10 cm. Utilize meio 293T sem antibiótico (DMEM de alta glicose com 10% de FBS e 4 mM de L-glutamina) para a produção do vírus.</li>
	<li>Dia 2. No final da tarde, transfete as células 293T conforme a seguir (os valores indicados são para uma placa de 10 cm). 
	Deixe todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente. Pipete 375 μl de OptiMEM em um tubo de microcentrifugação e adicione 25 μl 
	de Fugene HD. Evite que o Fugene não diluído entre em contato com a superfície do tubo.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrifugação, misture:
		<ul>
			<li>5 μg de plasmídeo de transferência (Slc7a1, vetor alvo ou vetor controle fluorescente)</li>
			<li>3,75 μg de plasmídeo de empacotamento (pCMV-dR8.91 ou psPax2)</li>
			<li>1,25 μg de plasmídeo de envelope (pMD2.G para pantrópico, pHCMV-EcoEnv para ectrópico)</li>
			<li>OptiMEM sem soro até completar 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Misture os conteúdos dos dois tubos e incube a mistura por 20-30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Troque o meio das células 293T para 10 ml de meio 293T fresco sem antibiótico. Adicione a mistura de Fugene/plasmídeos gota a gota na placa e incube durante a noite a 37°C, 5% CO2.</li>
	<li>Dia 3. Troque o meio das células 293T para 10 ml de meio 293T fresco sem antibiótico. Seja cuidadoso, 
	pois as células 293T aderem fracamente e podem destacar-se se o meio for pipetado com força excessiva sobre a monocamada. Incube por dois dias em incubadora umidificada para produção do vírus.</li>
	<li>Dia 5. Recolha o vírus e filtre com um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 mm. Use imediatamente ou distribua em alíquotas de uso único e congele a -80°C. O vírus pantrópico e ectrópico congelado deve ter seu título reavaliado após seis meses e um mês de armazenamento, respectivamente.</li>
	<li>Titule o vírus conforme a seguir, utilizando células relativamente suscetíveis à transdução. Transduza as células com o vírus controle fluorescente durante a noite, usando diluições seriadas (por exemplo, 1:10, 1:100, 1:1000) em meio fresco com 6 μg/ml de PB. Troque para meio fresco no dia seguinte. Deixe as células por dois dias após a transdução para iniciar a expressão da proteína fluorescente e, em seguida, determine a fração de células transduzidas por FACS. Calcule o título em unidades transformantes (TU) por ml, com base em diluições que resultem em &lt; 15% de transdução, para minimizar eventos de múltipla transdução. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Fórmula de cálculo do título, equação para quantificação viral, análise matemática em virologia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equação 1">
	</li>
</ol>
2. Transdução de células-alvo humanas com o receptor de retrovírus murino Slc7a1
<ol>
	<li>Selecione uma multiplicidade de infecção (MOI) = 2 para garantir que a maioria das células será transduzida. Para células-alvo resistentes à transdução, como HDFs, será necessária um MOI mais alto; diluímos o sobrenadante viral apenas na proporção de 1:2 para alcançar a transdução da maioria das células.</li>
	<li>Transduza as células-alvo durante a noite com sobrenadante viral diluído em meio de cultura fresco contendo 6 μg/ml de PB, o que aumenta a transdução ao potencializar a interação eletrostática entre o vírus e a célula-alvo.1 Idealmente, deve-se usar um volume mínimo de vírus, como 1 ml para uma placa de 35 mm, pois a difusão é um fator limitante na eficiência de transdução.</li>
	<li>Cultive as células por pelo menos 48 horas após a remoção do vírus antes de transduzi-las com vírus ecotrópico, a fim de garantir expressão suficiente do receptor Slc7a1.</li>
	<li>(Opcional) É possível usar blasticidina para selecionar células transduzidas de forma estável que expressem Slc7a1, se desejado. Deve-se gerar previamente uma curva de letalidade com blasticidina para determinar a menor concentração eficaz, geralmente entre 2 – 10 μg/ml, que elimine todas as células-alvo não transduzidas em 7 dias. Cerca de 2 dias após a remoção do vírus Slc7a1, mude as células transduzidas para um meio contendo blasticidina. Cultive as células em meio com blasticidina por 7 dias, após o que todas as células remanescentes expressarão de forma estável o receptor de retrovírus e poderão então ser transduzidas com vírus ecotrópico, além de serem armazenadas para uso futuro como uma linhagem estável expressora de Slc7a1.</li>
</ol>
3. Titulação de complexo polimérico para determinar toxicidade
<ol>
	<li>Dia 1. Plaque as células a 5000 células/poço em uma placa de 96 poços, utilizando pelo menos três poços replicados para cada grupo experimental. Inclua células não transduzidas em meio completo para fornecer um valor de referência para células saudáveis, bem como amostras compostas por células em meio sem soro para induzir a parada de crescimento como controle. Em paralelo, plaque as células em um formato apropriado (como uma placa de 24 poços) para análise microscópica ou por citometria de fluxo (FACS) da eficiência de transdução em cada condição experimental.</li>
	<li>Dia 2. Transduza as células nas placas preparadas para as análises de MTT e FACS com vírus que codifica GFP, utilizando uma MOI de 0,5 para transduzir cerca de 40% das células-alvo. Teste diferentes concentrações de CS/PB (por exemplo, 50, 100, 200, 400, 600 e 800 mg/ml de cada componente), bem como 6 μg/ml de PB, para determinar as quantidades ideais. Prepare os complexos poliméricos conforme descrito na Parte 4 abaixo.</li>
	<li>Dia 3. Remova o meio contendo o vírus e substitua por meio fresco. Retorne as placas para uma estufa úmida.</li>
	<li>Dia 5. Analise a placa de FACS para determinar a eficiência de transdução com cada concentração de polímero.</li>
	<li>Dia 6. Remova o meio de todos os poços da placa de MTT e substitua por 100 μl de solução de MTT (1 mg/ml de MTT em meio completo). Incube por três horas em estufa úmida para permitir a redução do MTT nas mitocôndrias das células metabolicamente ativas.</li>
	<li>Remova a solução de MTT e substitua por 200 ml de solvente de MTT (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 em isopropanol).</li>
	<li>Incube por duas horas à temperatura ambiente ou até que todo o precipitado roxo de formazan de MTT seja completamente dissolvido. Leia a absorbância em um leitor de microplacas a 570 nm, subtraindo a leitura de fundo a 690 nm.</li>
	<li>Selecione a concentração ótima de polímero que produza o máximo aumento na transdução, conforme determinado por FACS, com efeito mínimo sobre a atividade metabólica, conforme determinado pelo ensaio de MTT. Para HDFs, selecionamos 100 μg/ml de CS/PB com base nos dados apresentados nos Resultados Representativos abaixo.</li>
</ol>
4. Transdução ecótrofica com complexação por polímero
<ol>
	<li>Prepare soluções estoque de PB e sulfato de condroitina, filtradas estéreis, a 20 mg/ml em água. Aliquote e armazene a -20°C.</li>
	<li>Pipete o sobrenadante viral em um tubo de microcentrifugação e dilua até a concentração final desejada (por exemplo, MOI de 2) com meio de cultura fresco. Adicione volumes iguais de PB e sulfato de condroitina (concentrações determinadas no passo 3 acima) sucessivamente, agitando levemente o tubo para misturar após cada adição. A mistura viral ficará imediatamente turva à medida que precipitados se formam. Incube a mistura viral à temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a formação do complexo.</li>
	<li>Remova o meio das células-alvo que expressam o receptor, substitua pela mistura viral e incube durante a noite a 37°C, 5% CO2. Após a remoção da mistura viral, lave a superfície das células duas vezes com PBS para auxiliar na remoção dos complexos virais. A remoção completa não é necessária; não observamos efeitos adversos na saúde celular provocados por complexos poliméricos residuais.</li>
</ol>
5. Verificando a especificidade da transdução ecótropica
<ol>
	<li>Ao produzir o vírus ecotrópico pela primeira vez, é prudente, do ponto de vista da segurança, verificar se o vírus é incapaz de transduzir células humanas não modificadas. Transduza células humanas com lentivírus ecotrópico em concentração relativamente alta (apenas uma diluição de 1 a 2 vezes do sobrenadante viral em meio fresco) durante a noite com 6 μg/ml de PB ou concentração otimizada de CS/PB.</li>
	<li>Remova o meio contendo o vírus e substitua por meio fresco. Após incubar as células por 2 dias, valide a expressão do transgene por meio de FACS utilizando vetores fluorescentes e/ou por RT-PCR com primers específicos para o transgene.</li>
</ol>
6. Resultados representativos:
A Fig. 1A mostra o processo de produção de lentivírus, e a Fig. 1B mostra a transdução de células humanas com lentivírus ecotrópico, incluindo a pré-transdução com o receptor de retrovírus murino Slc7a1. Para titulação do vírus, utilizamos uma linhagem celular de rabdomiossarcoma humano estavelmente transduzida com Slc7a1 (Slc-hRMS). Ao utilizar vetores controle fluorescentes para monitorar a eficiência de transdução, rotineiramente alcançamos eficiência de transdução > 90% de Slc-hRMS com vírus ecotrópico, como mostrado nas Fig. 2A e 2B. As taxas de transdução de HDFs são geralmente mais baixas porque as células não foram selecionadas com blasticidina para expressão do receptor (Fig. 2C). Os títulos de lentivírus ecotrópico são geralmente 10-20% dos obtidos com vírus pseudotipado com VSV quando medidos em Slc-hRMS (Fig. 2D).
Um ciclo de congelação-descongelação reduz o título do vírus ecotrópico em 16 - 3%, equivalente à perda de título durante um único ciclo de congelação-descongelação do vírus pseudotipado com VSV (p &gt; 0,05). Contrariamente a relatos anteriores,2 não observamos nenhum efeito positivo no título viral causado pelo congelamento rápido em gelo seco. Pelo contrário, obtemos títulos pós-descongelação mais altos para qualquer pseudotipo simplesmente colocando os tubos de vírus em um congelador a -80°C (dados não mostrados).
O ensaio de viabilidade com MTT permite a detecção sensível da parada de crescimento em células-alvo. A transdução com vírus mais concentrações de CS/PB até 800 μg/ml não tem efeito sobre o metabolismo de HDFs (Fig. 3A). A exposição ao CS/PB sem vírus também não apresenta efeito tóxico sobre as células (dados não mostrados). A análise por FACS de HDFs transduzidas com vírus mais diversas concentrações de CS/PB mostra aumento da transdução em comparação com PB isolado (Fig. 3B). O máximo de potencialização ocorre em 100 μg/ml de CS/PB (Fig. 3C), várias vezes menor do que os valores previamente relatados.3 Assim, é importante otimizar as condições para qualquer tipo celular-alvo específico.
A complexação com CS/PB aumenta aproximadamente 3 vezes o título observado em Slc-hRMS (Fig. 4A, p &lt; 0,01). Na prática, isso resulta em um efeito maior na eficiência de transdução em baixas concentrações de vírus do que em concentrações mais altas (Fig. 4B), o que provavelmente se deve à transdução múltipla de células e à saturação de receptores em concentrações mais elevadas de vírus.
A transdução com vírus ectrópico é específica para células que expressam o receptor de retrovírus murino. Ao transduzir células humanas não modificadas com vírus ectrópico, não observamos fluorescência acima do fundo de não transdução, independentemente do uso de PB ou CS/PB, conforme mostrado na Figura 5A. Microscopicamente, os HDFs não mostram transdução na ausência do receptor (Figura 5B), enquanto a pré-transdução com o receptor resulta em células fluorescentes (Figura 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Diagrama do processo de produção de lentivírus, mostrando a transdução de células 293T e as etapas do sobrenadante viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Visão esquemática de (A) o processo de produção do vírus e (B) a transdução de células humanas com receptor de retrovírus murino seguida por lentivírus ecotrópico.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Gráficos de citometria de fluxo, análise da porcentagem de células GFP+, microscopia de fluorescência, gráfico de barras da titulação viral." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Transdução de alta eficiência de células humanas com lentivírus ecotrópico codificando GFP. As células foram previamente transduzidas com o receptor de retrovírus murino Slc7a1. (A) Linhagem celular de rabdomiossarcoma humano selecionada com blasticidina para Slc7a1 (Slc-hRMS), transduzida (azul) ou não transduzida (rosa) com GFP. (B) Micrografia fluorescente de Slc-hRMS transduzidas com lentivírus ecotrópico (4X). (C) HDFs transduzidas (azul) e não transduzidas (rosa) com lentivírus ecotrópico GFP; as células foram transduzidas com Slc7a1 dois dias antes da transdução ecotrópica. (D) Título do lentivírus pseudotipado com VSV-G e do lentivírus ecotrópico, medido em Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Efeitos da concentração do polímero na expressão de GFP; gráficos de absorbância, citometria de fluxo e porcentagem de GFP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Otimização das concentrações de sulfato de condroitina/polibreno (CS/PB) em fibroblastos dérmicos humanos. (A) Viabilidade de HDFs medida pelo ensaio MTT após transdução na presença de PB apenas ou com diferentes concentrações de CS/PB. (B) Aprimoramento da eficiência de transdução em HDFs com diferentes concentrações de CS/PB, medido por FACS. (C) Quantificação do aprimoramento da transdução, mostrando que a transdução máxima ocorre com 100 μg/ml de CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Eficiência de transdução gênica versus análise de título, gráfico de barras e gráfico de dispersão, comparação do efeito da polibrena." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Efeito de 400 μg/ml de CS/PB na transdução de Slc-hRMS com lentivírus ecotrópico. (A) Aumento do título e (B) mudança na taxa de transdução em relação ao uso isolado de 6 μg/ml de polibrena.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Gráfico de intensidade de GFP por citometria de fluxo com imagens de microscopia de fluorescência mostrando a distribuição de células GFP+" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figura 5"> 
Figura 5. Ausência de transdução ectrópica de HDFs na ausência do receptor de retrovírus murino Slc7a1. (A) Gráfico de citometria de fluxo de fibroblastos humanos BJ, não transduzidos (rosa) ou transduzidos (azul) com lentivírus GFP ectrópico, em ambos os casos na ausência do receptor Slc7a1. Fibroblastos humanos BJ transduzidos com lentivírus GFP ectrópico, sem (B) e com (C) pré-transdução com o receptor Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Recombinante gammaretrovirus ecotropic baseado em Moloney vírus da leucemia murina (MLV) e seu receptor mSlc7a1 são bem estudadas e amplamente disponível, tendo sido utilizada por mais de 20 anos para entregar transgenes em células de camundongos. Gammaretrovirus Ecotropic também tem sido usado mais recentemente para entregar oncogenes às células humanas;. No contexto da reprogramação celular, o uso de mSlc7a1 para evitar a geração de vírus amphotropic abrigar oncogenes humanos está bem estabelecida 4,5 No entanto, lentivírus oferece vantagens significativas sobre gammaretrovirus na transdução de populações de células refratário, 6, incluindo células primárias que muitas vezes são alvos desejáveis ​​para a reprogramação, porque o complexo de pré-integração lentiviral permite transdução de não-divisão das células. 7 Lentivírus têm sido produzidos com dezenas de pseudotipos diferentes, incluindo MLV, em um esforço para alterar o tropismo do vírus, toxicidade e outras propriedades. 8 lentivírus ecotropic MLV-pseudotyped tem sido usado para a transdução de células mouse, 9, mas raramente tem sido utilizado em células humanas . 10 Por isso, propomos o uso de MLV-pseudotyped lentivírus ecotropic como um veículo de custo, seguro e eficaz, e altamente eficiente para entregar oncogenes conhecidos ou suspeitos, incluindo celulares fatores de reprogramação, para as células humanas. É fundamental notar que este protocolo não eliminar totalmente a necessidade de produzir e utilizar lentivírus pantropic, mas sim, este protocolo separa o oncogene (s) de que o vírus pantropic, isolando pesquisadores do potencial de auto-inoculação com câncer relacionados com o vírus. O mSlc7a1 proteína e sua hSlc7a1 homólogo humano são expressos ubiquitously transportadores de aminoácidos sem tumorigenicidade conhecidos ou capacidade de conferir uma vantagem seletiva em células de crescimento destinatário, 11 mSlc7a1 realização de um risco relativamente baixo para incorporação vírus amphotropic. Esta etapa adicional pode ser particularmente útil em laboratórios de vírus falta dedicado ou a cultura de tecidos do nível de biossegurança exigido. Em algumas situações pode ser possível eliminar completamente o uso de vírus pantropic por transfecting o Slc7a1 plasmídeo diretamente em células-alvo, no entanto, muitas células que seriam alvos úteis desta técnica também são refratários a transfecção. Como alternativa, a capacidade de isolar Slc7a1-transduzidas células pela seleção blasticidin significa que VSV-G lentivírus pseudotyped pode ser usado uma vez para gerar um estoque de células que expressam receptores, após o qual o vírus ecotropic pode ser usada rotineiramente para transduzir essas células para muitos experimentos. Pesquisadores devem sempre seguir as suas orientações de segurança institucional para trabalhar com qualquer lentivírus, independentemente do seu tropismo. Os títulos de vírus ecotropic alcançado com este protocolo são moderadamente inferiores VSV-pseudotyped vírus, geralmente 10-20% do título de vírus pantropic, de acordo com estudos anteriores. 9 Estes títulos foram medidos em células humanas de maneira estável transduzidas com Slc7a1, de modo a diminuir título observado para o vírus ecotropic pode ser em parte devido a expressão variada do gene do receptor em células-alvo. No entanto, os títulos virais obtidas em nosso protocolo são mais do que suficiente para a maioria das aplicações e levar a transdução de a maioria das células, em alguns casos&gt; 90% das células. Centrifugação técnicas baseadas são comumente usados ​​para concentrar as partículas virais. No entanto, requer várias horas de centrifugação, gera aerossóis infecciosos, e pode resultar em perda significativa de partículas virais. 12 Como alternativa, a complexação com CS / PB pode ser usado para melhorar a transdução sem alterar tropismo viral. 3 Este método é rápido (5 minutos ) e barato (US $ 0,03 por 10 ml de vírus), enquanto cerca de triplicar o título observados. Nenhum equipamento especial ou reagentes de propriedade são necessários, e observou-se toxicidade aguda após a exposição mínima de HDFS para CS / PB, de acordo com trabalhos anteriores em outras linhagens celulares. 13 Uma desvantagem potencial deste protocolo é que alguns complexos microscopicamente visível polímero aderir as células durante vários dias em cultura. Não podemos descartar a possibilidade de que estes complexos, embora não abertamente tóxicos para as células, pode ter efeitos mais sutis sobre os processos celulares. Aqui nós descrevemos uma metodologia para a segurança e eficiência transdução de células humanas com fatores oncogênicos. Esta abordagem deve ser de grande utilidade para pesquisadores que estudam oncogenes e biologia de células-tronco, incluindo as células iPS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Receptor MLV murino </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G envelope </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono laboratório 14 </td><td></td><td> Embalagem plasmídeo (psPax2 plasmídeo equivalente está disponível a partir Addgene, Cat. Número 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Envelope Ecotropic </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP controle plasmídeo </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimetrina brometo (polibrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Condroitina sal sulfato de sódio de cartilagem de tubarão </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Pescador </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Metiltiazolildifenil-brometo de tetrazolium (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

transdução de células humanas com polymer-complexado lentivirus ecotropic para reforço de biossegurança

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Caule e tumor estudos de biologia celular muitas vezes exigem transdução viral das células humanas com oncogenes conhecidos ou suspeitos, levantando questões importantes de segurança para o pessoal de laboratório. Lentivírus Pantropic, como o comumente usado VSV-G pseudotype, são uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene porque pode converter muitos tipos de células, incluindo células não-divisão. No entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de vírus e centrifugação pantropic codificação oncogenes devido ao maior nível de biossegurança requisitos manuseio e segurança. Vários oncogenes potentes, incluindo c-Myc e SV40 antígeno T grande, são conhecidos por aumentar a produção de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC). Todos os outros conhecidos iPSC-induzir mudanças genéticas (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, p53 e perda da função) também têm ligações ao câncer, tornando-os relativos à segurança relativamente alta também. Embora estes vírus relacionados ao câncer são úteis no estudo de reprogramação celular e pluripotência, eles devem ser usados ​​com segurança. Para tratar dessas questões de biossegurança, demonstramos um método para a transdução de células humanas com lentivírus ecotropic, com ênfase adicional sobre o custo reduzido e fácil manuseamento. Nós produzimos lentivírus ecotropic com título suficientemente elevado para transduzir superior a 90% do receptor-expressando células humanas expostas ao vírus, validando a eficácia desta abordagem. Lentivírus é frequentemente concentrada por ultracentrifugação, no entanto, este processo leva várias horas e pode produzir aerossóis infecciosos para humanos pesquisadores biomédicos. Como alternativa, as partículas virais podem ser mais segura sedimentada em células por complexação com sulfato de condroitina e polibrene (CS / PB). Esta técnica aumenta a título funcional viral até 3 vezes nas células que expressam o receptor de forma estável retrovirus murino, com o tempo e custo insignificante acrescentou. Transdução de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS) é maximamente melhorada usando CS / PB concentrações aproximadamente 4 vezes menor que o valor ideal relatado anteriormente para linhas celulares de cancro, sugerindo que a concentração de polímero deve ser ajustada para o tipo de célula-alvo de interesse. Nós, portanto, descrever o uso de brometo de tetrazólio-metiltiazolildifenil (MTT) para ensaio de toxicidade do polímero em um novo tipo de célula. Observamos viabilidade equivalente a HDFS após a transdução viral usando complexação de polímeros ou a dose padrão de polibrene (PB, 6 mg / ml), indicando toxicidade aguda mínima. Neste protocolo, descrevemos o uso de lentivírus ecotropic para superexpressão de oncogenes em células humanas, reduzindo os riscos de biossegurança e aumentar a taxa de transdução. Nós também demonstrar o uso de complexação de polímeros para aumentar a transdução, evitando aerossol de formação de centrifugação das partículas virais.

Lentivírus são um valioso instrumento de pesquisa para explorar a função do gene, no entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de codificação lentivírus pantropic conhecida ou suspeita de oncogenes. Como alternativa, apresentamos um protocolo mais seguro para o uso de lentivírus ecotropic em células humanas modificadas para expressar o receptor mSlc7a1 ecotropic.

Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

Estudos de biologia de células-tronco e células tumorais frequentemente exigem a transdução viral de células humanas com oncogenes conhecidos ou suspeitos, levantando questões importantes de segurança para...

O objetivo geral do experimento a seguir é introduzir oncogenes ou outros genes potencialmente perigosos em células humanas utilizando lentivírus ecotrópico. Isso é alcançado pela produção de lentivírus pantrópico, que codifica o receptor do retrovírus murino, bem como lentivírus ecotrópico que codifica o gene de interesse. As células são transduzidas com o receptor do retrovírus murino, o que as torna suscetíveis à transdução com o vírus ecotrópico. Em seguida, as células são transduzidas com o vírus ecotrópico para introduzir o oncogene, utilizando complexação com polímeros de poli-cérebro e sulfato de condroitina para potencializar a transdução. Os resultados obtidos demonstram transdução seletiva de células humanas com lentivírus ecotrópico com base em microscopia fluorescente e fatos.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transdução por retrovírus gama, é que partículas lentivirais podem transduzir de forma mais eficaz diversos tipos celulares, incluindo células não divididas, como as células-tronco. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da pesquisa de câncer e células-tronco, como compreender a função de oncogenes potenciais. Antes de iniciar este procedimento, consulte o responsável pela segurança institucional e siga as diretrizes de segurança recomendadas.Inicie com um cultivo de células 293T saudáveis e em rápido crescimento, trabalhando em uma câmara de cultura tecidual. Em condições assépticas, ressuspenda cinco vezes 10 elevado a 6 células 293T em 10 mililitros de meio para 293T sem antibiótico. Pipete a suspensão celular em uma placa de cultura tecidual de 10 centímetros e incube a placa durante a noite em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, inicie a transfeção na parte final da tarde. Primeiro, colete uma alíquota de Optum e dos plasmídeos de transferência, empacotamento e envelope, e deixe-os aquecerem até a temperatura ambiente. Pipete 375 microlitros de optimum em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicione 25 microlitros do reagente de transfeção FU gene HD. Certifique-se de que o reagente FU gene seja pipetado diretamente no meio e não toque nas paredes do tubo.Em seguida, em um segundo tubo de microcentrífuga, combine cinco microgramas do plasmídeo de transferência, 3,75 microgramas do plasmídeo de empacotamento e 1,25 microgramas do plasmídeo de envelope na quantidade necessária de OptiMEM para completar o volume até 100 microlitros. Em seguida, adicione a mistura OptiMEM ao tubo contendo a mistura de plasmídeos e incube em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Durante os últimos minutos da incubação, aspire suavemente o meio do recipiente contendo as células 293T e substitua por 10 mililitros de meio fresco para 293T sem antibiótico.Por fim, adicione gota a gota a mistura de plasmídeo do gene FU ao meio do placa de 10 centímetros. Coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos ajustado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube durante a noite. No dia seguinte, aspire muito cuidadosamente o meio da placa e substitua por meio 2 9 3 T fresco, sem antibiótico.Em seguida, devolva a placa ao incubador de cultura de tecidos e incube por mais dois dias. Três dias após a transfeção, aspire o meio contendo o vírus da placa e filtre-o utilizando um filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 mícron. Após a filtração, faça diluições seriadas de um vírus controle fluorescente em meio fresco sem antibiótico contendo seis microgramas por mililitro de polibrena, e utilize essas diluições para transduzir células da linhagem celular apropriada. No dia seguinte, em uma placa de 24 poços, troque o meio por meio fresco sem antibiótico e continue a incubação por mais dois dias para permitir que as células expressem a proteína fluorescente.Utilize os dados obtidos para determinar a fração de células transduzidas para cada diluição viral. Em seguida, calcule o título em unidades transformantes por mililitro com base nas diluições que resultam em menos de 15% de transdução, a fim de minimizar eventos de transdução múltipla. Presume-se que os títulos de outros lentivírus não fluorescentes produzidos em paralelo sejam semelhantes ao do vírus fluorescente.Para transduzir células-alvo, comece selecionando uma multiplicidade de infecção maior que dois para garantir que a maioria das células seja transduzida. Primeiro, dilua o sobrenadante viral na multiplicidade de infecção necessária em meio de cultura completo fresco, suplementado com seis microgramas por mililitro de polibrena, até um volume final de um mililitro.Aspire o meio de um prato de 35 milímetros contendo as células-alvo e adicione um mililitro do sobrenadante viral diluído. Incube na estufa de cultura de tecidos por 24 a 48 horas para permitir expressão suficiente do receptor SLC7A1, se desejado. Utilize seleção com antibiótico blasticidina para selecionar células transduzidas de forma estável que expressem SLC7A1, conforme as instruções no procedimento escrito.Para iniciar a determinação de toxicidade, prepare uma solução estoque de 20 miligramas por mililitro de sulfato de condroitina e uma solução estoque de 20 miligramas por mililitro de poli cérebro em água e filtre esterilizando. Soluções estoque excedentes podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius até o momento do uso.Em seguida, determine o número de culturas celulares em placas de 96 poços necessárias para determinar com precisão a toxicidade do complexo polimérico. Utilizando o ensaio MTT, pelo menos seis concentrações de sulfato de condroitina e poli verde devem ser testadas em triplicata. Além disso, inclua células não tratadas e células cultivadas em meio sem soro.O meio deve ser incluído para fornecer uma linha de base para células saudáveis e para controlar respectivamente a parada de crescimento. Uma vez determinado o número de poços necessários, semeie 5.000 células-alvo em cada poço de uma placa de 96 poços, semeando paralelamente células em uma placa de 24 poços para análise microscópica ou baseada em fatos da eficiência de transdução em cada condição experimental; deixe ambos os conjuntos de células crescerem durante a noite. No dia seguinte, adicione uma alíquota da solução estoque de sulfato de condroitina e uma alíquota da solução estoque de poli-cérebro.Em seguida, dilua o vírus que codifica a GFP em meio livre de antibiótico contendo seis microgramas por mililitro de polibrena, a uma multiplicidade de infecção suficiente para transduzir cerca de 10 a 50% das células-alvo por poço. Certifique-se de que haja vírus diluído suficiente para cada condição de teste, além dos poços controle em cada placa. Rotule um conjunto de tubos com cada concentração de sulfato de condroitina e polímero poliverde a ser testada.Em seguida, alíquotar quantidade suficiente da suspensão viral para cada condição em triplicata nos tubos. Depois, pipetar o volume necessário da solução estoque de sulfato de condroitina e poli cérebro para atingir as concentrações-teste em cada um dos tubos sucessivamente. Imediatamente após a adição de sulfato de condroitina e poli verde, agitar levemente o tubo para homogeneizar.Deixe as misturas de vírus, condroitina sulfato e poli verde incubarem à temperatura ambiente por cinco minutos. A mistura pode ficar turva à medida que os precipitados virais se formam. Após a incubação, aspire o meio dos poços da placa de 96 poços.Em seguida, adicione a mistura de vírus, condroitina sulfato e poli verde aos poços conforme planejado. Pipete também o controle e o meio livre de soro nos poços apropriados. Repita o processo para a placa de 24 poços e incube durante a noite no incubador de cultura de tecidos.Em seguida, aspire o meio contendo o vírus das placas e substitua por meio fresco. Retorne as placas ao incubador por 48 horas. Após 48 horas, remova a placa de 24 poços e utilize os dados para analisar a eficiência de transdução de cada concentração de sulfato de condroitina e poli cérebro.No dia seguinte, aspire o meio de todos os poços da placa de 96 poços e substitua por 100 microlitros de solução de MTT, cultivando por três horas em incubadora umidificada para permitir a redução do MTT nas mitocôndrias de células metabolicamente ativas. Após três horas, aspire a solução de MTT e substitua por 200 microlitros de solução solvente.Incube a placa por duas horas à temperatura ambiente ou até que todo o púrpura MTT formado e o precipitado sejam dissolvidos. Leia a absorbância em um leitor de microplacas a 570 nanômetros, subtraindo a leitura de fundo a 690 nanômetros. A concentração ótima do polímero produzirá o máximo de potencialização da transdução conforme determinado por fatos, com efeito mínimo sobre a atividade metabólica conforme determinado pelo MTT para hdfs.100 microgramas por mililitro de sulfato de condroitina. O Poly brain é a concentração polimérica ideal determinada por este método. Primeiro, prepare quantidade suficiente da mistura de sobrenadante viral de poli verde com sulfato de condroitina a 100 microgramas por mililitro para transduzir o número necessário de placas de 35 milímetros de células HDF que expressam o receptor SLC sete A um. Incube a mistura por cinco minutos para permitir a formação de complexos poliméricos.Em seguida, aspire o meio das células-alvo que expressam o receptor e substitua pela mistura viral. Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a remoção da mistura viral, lave a superfície das células duas vezes com PBS para auxiliar na remoção dos complexos virais. A remoção completa não é necessária, pois não foram observados efeitos adversos na saúde celular decorrentes de complexos poliméricos residuais.Esta imagem de microscopia de fluorescência ilustra uma transdução suficiente de células de sarcoma humano, expressando estavelmente SLC sete A um com vírus trópico ao utilizar vetores de controle fluorescentes para monitorar a eficiência de transdução. A quantificação da fluorescência por meio de análise de fax demonstra uma eficiência de transdução superior a 90%. As taxas de transdução de HDFS são geralmente menores porque as células não foram ativadas ou selecionadas para expressão de receptores; os títulos de lentivírus atrópicos geralmente são de 10 a 20% do vírus pseudotipado com VSV, conforme medido em S-L-C-H-S-C. O ensaio de viabilidade MTT permite a detecção sensível da parada de crescimento em células-alvo, como observado aqui, após transdução com vírus e concentrações de sulfato de condroitina.Polímeros cerebrais de até 800 microgramas por mililitro não têm efeito sobre o metabolismo de HDF. Análise de fax de HDFs transduzidas com vírus mais várias concentrações de sulfato de condroitina. O polímero verde mostra aumento da transdução em comparação com o polímero verde isolado.A máxima potencialização ocorre em 100 microgramas por mililitro. O poli-sulfato de condroitina no cérebro é várias vezes menor do que os valores previamente relatados. Assim, é importante otimizar as condições para qualquer tipo celular específico em relação à complexação com sulfato de condroitina.O poli cérebro aumenta o título observado, aproximadamente três vezes no S-L-C-H-S-C. Na prática, isso resulta em um efeito maior na eficiência de transdução em concentrações baixas de vírus do que em concentrações mais altas, o que provavelmente se deve à presença de múltiplas células transduzidas e à saturação de receptores em concentrações elevadas de vírus. A transdução com vírus trópico é específica para células que expressam o receptor de retrovírus neuronal.Ao transduzir células humanas não modificadas com vírus trópico, fluorescência superior ao fundo não reduzido não foi observada, conforme visto pela análise por microscopia. Os HDFs não mostram transdução na ausência de receptor, enquanto a pré-transdução com receptor resulta em células fluorescentes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar se o vírus não irá transduzir células humanas modificadas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar lentivírus trópico para entregar genes potencialmente perigosos a células humanas, incluindo o uso da complexação com polímero para aumentar a transdução.

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Biology

Biologia

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