Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos
21 de julho de 2011
Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar o desenvolvimento da glândula mamária em camundongos selvagens e mutantes. Isso é realizado primeiramente dissecando um camundongo para expor as glândulas mamárias. Em seguida, as glândulas mamárias são adequadamente coletadas e espalhadas sobre lâminas de vidro, calm lum.
A coloração é então utilizada para analisar o grau de desenvolvimento do epitélio. Por fim, realiza-se a análise das contrações mioepiteliais após exposição à ocitocina, INEA J.Ultimamente, os resultados obtidos revelarão se os ductos da glândula mamária e os alvéolos foram adequadamente formados, e se o epitélio mio pode ser induzido a contrair e ejetar leite após exposição à ocitocina. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais relacionadas ao desenvolvimento e diferenciação da glândula mamária, como o impacto de mutação gênica ou deleção gênica na morfologia e função da glândula mamária.
A demonstração visual deste método garante a dissecção adequada da glândula mamária, pois tanto a montagem em orifício quanto o ensaio baseado em ocitocina exigem glândulas mamárias bem preparadas. Uma dissecção inadequada da glândula pode resultar na ausência de alguns ductos epiteliais ou na presença de tecidos estranhos, como pele ou tecido muscular. Pelo menos um dia antes da dissecção, prepare a solução de alúmen de CalMin dissolvendo um grama de CalMin e 2,5 gramas de sulfato de alumínio e potássio em 500 mililitros de água destilada.
Ferva a solução por 20 minutos em um frasco de um litro e ajuste o volume final para 500 mililitros com água. Filtre a solução através de papel watman e adicione alguns grãos de tiol como conservante. Em seguida, refrigere a solução após a coloração.
A solução de alúmen de carbono pode ser despejada novamente no frasco de estoque e reutilizada várias vezes durante várias semanas. Prepare uma solução nova quando a cor ficar desbotada. Para iniciar a dissecação da glândula da memória, sacrifique um camundongo por inalação de dióxido de carbono.
Evite a dislocação cervical, se possível, pois ela pode danificar vasos sanguíneos importantes no pescoço e resultar no acúmulo de sangue ao redor da glândula mamária número um, dificultando seu dissecção sobre espuma de poliestireno envolta em folha de alumínio. Coloque o camundongo de costas e estenda os quatro membros.
Fixe firmemente os quatro membros usando agulhas de 16 a 20. Pulverize o camundongo abundantemente com etanol 70% utilizando pinça. Levante a pele abdominal na linha média e faça uma pequena incisão com tesoura afiada, começando pela incisão.
Corte a pele até o pescoço do animal, evitando perfurar as cavidades abdominal ou torácica. Corte a pele das patas dianteiras até a incisão mediana, resultando em um formato de Y. Corte a pele das patas traseiras da mesma maneira.
Usando pinça hemostática. Remova suavemente a pele abdominal e torácica para o lado do camundongo, se necessário. Corte suavemente o tecido conjuntivo.
Fixe a pele ao isopor usando agulhas de número 16 a 20, expondo as glândulas mamárias presas à face inferior da pele. Disseque uma glândula por vez utilizando pinça. Levante suavemente a glândula mamária de interesse e corte entre a glândula e a pele com tesoura pequena e afiada, começando da periferia em direção à coluna vertebral do animal.
Certifique-se de cortar cuidadosamente para que nenhum fragmento de pele ou músculo permaneça na glândula. Todas as glândulas mamárias podem ser removidas usando este protocolo, mas as glândulas mamárias abdominais número quatro são as mais adequadas para montagem inteira. Após a excisão da glândula mamária do camundongo, espalhe-a diretamente sobre uma lâmina de vidro.
Tente achatá-la o máximo possível. Mantendo a forma original in situ, a glândula aderirá bem à lâmina. Quando esticada corretamente em uma câmara de fluxo, fixe a glândula imergindo a lâmina em um frasco com carnoy.
Fixe por quatro horas à temperatura ambiente. Alternativamente, fixe a glândula durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o tecido em etanol 70% por 15 minutos.
Em seguida, reidrate-o gradualmente em água removendo metade da solução de etanol do frasco e substituindo por água bidestilada. Incube por cinco minutos. Repita o processo três vezes, enxágue e coloque em água destilada por cinco minutos.
Em seguida, corar a glândula com alúmen de carbono durante a noite, à temperatura ambiente. No dia seguinte, remover a coloração de alúmen de carbono para reutilização e desidratar gradualmente o tecido corado por meio de banhos seriados de etanol, durante cinco minutos cada. Em seguida, clarificar o tecido em xilol durante a noite; após a clarificação, imergir a glândula mamária em salicilato de metila, mantendo o salicilato de metila em capela até que as imagens estejam prontas para serem capturadas. O desenvolvimento da glândula mamária pode ser quantificado contando-se o número de ramificações ou ramos laterais ao longo de segmentos dos ductos, o comprimento dos ductos primários ou pode-se avaliar a razão entre a área do tecido epitelial e a área do tecido adiposo.
Um segundo ensaio utilizado para avaliar o desenvolvimento e a função da glândula mamária envolve expor a glândula à ocitocina e avaliar a ejeção de leite para os ductos epiteliais. Para realizar este ensaio, filhotes recém-alimentados devem ser separados da mãe, e a mãe deve ser mantida em isolamento por uma hora. Em seguida, sacrifique a mãe e exponha as glândulas mamárias conforme descrito para a dissecação da glândula mamária.
No entanto, deixe-os no animal. Inicie o ensaio utilizando uma pipeta de transferência para depositar uniformemente três a cinco mililitros de PBS ou da solução de ocitocina diretamente sobre a glândula mamária de interesse. Para este procedimento, recomenda-se o uso das glândulas torácicas, utilizando um lado como controle e o outro lado para testar a ejeção do leite.
Incube as glândulas por um minuto e remova as soluções aspirando cuidadosamente com uma pipeta de transferência; monitore a entrada de leite nos ductos por meio de gravação em vídeo ou ao capturar imagens antes e após a exposição ao PBS ou à ocitocina. A seguir, exemplos de memória de camundongo. Montagens de glândulas com orifícios mostram ductos epiteliais, indicados por setas, e o linfonodo, marcado por uma ponta de seta, facilmente observáveis em uma glândula mamária inteira bem espalhada.
Uma glândula mamária mal espalhada pode se soltar da lâmina e colapsar, tornando-a inutilizável. Uma glândula mamária incorretamente excisada pode apresentar partes faltando ou fragmentos de músculo ou pele remanescentes aqui. A ejeção de leite induzida por ocitocina pode ser observada em patos epitélio após exposição à ocitocina.
No entanto, se as glândulas já estiverem cheias de leite no início do ensaio devido a um período de latência inadequadamente longo após a última mamada das crias, é difícil observar o acúmulo adicional de leite nas glândulas após a exposição à ocitocina. Alternativamente, um período de latência curto após a mamada das crias impedirá o acúmulo de quantidade suficiente de leite nos alvéolos para que possa ser adequadamente observado nos ductos após a exposição à ocitocina, seguindo a dissecação das glândulas mamárias. Em vez de montagem em lâmina ou avaliação da ejeção de leite induzida por ocitocina, as glândulas mamárias podem ser congeladas, cortadas em criostato e imunomarcadas para qualquer número de proteínas residentes nas glândulas mamárias.
Ou, alternativamente, as glândulas podem ser lisadas e preparadas para western blot. Juntos, esses dois ensaios permitiram abordar questões fundamentais relacionadas ao desenvolvimento, diferenciação e função das glândulas em qualquer número de modelos de camundongos que foram geneticamente modificados para carecer de genes essenciais ou apresentar mutações em genes arbor.
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Visão Geral
Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento e a função da glândula mamária em camundongos. O procedimento avalia o grau de desenvolvimento da glândula mamária e a funcionalidade da ejeção do leite por meio de ensaios específicos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Genética
Antecedentes
- O desenvolvimento da glândula mamária é crucial para a compreensão da lactação.
- Mutações genéticas podem afetar a morfologia e a função da glândula mamária.
- A ocitocina desempenha um papel significativo na ejeção do leite.
- A avaliação das contrações das células mioepiteliais pode fornecer informações sobre a funcionalidade da glândula.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o desenvolvimento da glândula mamária em camundongos selvagens e mutantes.
- Analisar o impacto de mutações gênicas na morfologia da glândula mamária.
- Avaliar a funcionalidade das glândulas mamárias em resposta à estimulação hormonal.
Métodos Utilizados
- Dissecação de camundongos para expor as glândulas mamárias.
- Coleta e espalhamento das glândulas mamárias sobre lâminas de vidro.
- Coloração para analisar o desenvolvimento do epitélio.
- Avaliação das contrações mioepiteliais após exposição à ocitocina.
Resultados Principais
- Os resultados revelam o grau de formação dos ductos e alvéolos da glândula mamária.
- A análise mostra se o miotélio é capaz de contrair e ejetar leite.
- Os achados contribuem para o entendimento da diferenciação da glândula mamária.
- Informações sobre os efeitos de modificações genéticas na função da glândula.
Conclusões
- Este método fornece uma estrutura para o estudo do desenvolvimento da glândula mamária.
- Pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a função gênica em glândulas mamárias.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para explorar implicações adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa do desenvolvimento e da função da glândula mamária em modelos de camundongos permite a validação rigorosa de alvos para genes implicados em interações epitélio-estromais e na biologia da lactação. Esses ensaios fornecem confiança preditiva para a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta e facilitam a continuidade translacional em programas pré-clínicos que investigam perturbações gênicas no desenvolvimento ou na função. A abordagem auxilia na triagem de portfólios ao distinguir os efeitos gênicos na arquitetura tecidual e na produção funcional em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função gênica na morfogênese e diferenciação da glândula mamária.
- Apoia a desmistificação biológica ao associar genótipo a fenótipos em nível tecidual.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da avaliação direta da ejeção de leite e do desenvolvimento ductal.
- Fornece insights mecanicistas sobre as interações entre células epiteliais e mioepiteliais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece ensaios funcionais e em montagem inteira validados para triagem fenotípica reprodutível.
- Fornece resultados quantitativos, como ramificação ductal, formação alveolar e métricas de ejeção de leite.
- Permite a padronização da preparação de tecidos e da aquisição de imagens para comparação entre estudos.
- Prepara sistemas biológicos robustos para análises moleculares ou proteicas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados do modelo murino com a biologia da glândula mamária humana para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Apóia a continuidade desde a descoberta genética até a validação pré-clínica de fenótipos de desenvolvimento ou lactação.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para alvos genéticos que afetam a função tecidual.
- Oferece uma plataforma para avaliar intervenções terapêuticas em modelos geneticamente modificados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, validação funcional e fenotipagem quantitativa em modelos de camundongos geneticamente modificados.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula para função gênica no desenvolvimento da glândula mamária e na lactação.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis da arquitetura ductal e alveolar e da ejeção funcional do leite.
- Análises: Permite comparação estatística de fenótipos mutantes versus selvagens utilizando pontos finais morfológicos e funcionais definidos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas genéticas a modelos pré-clínicos com saídas mensuráveis e relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado adaptável a diversos alvos genéticos e modelos de camundongos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na função gênica e reduz a ambiguidade mecanicista na biologia do desenvolvimento.
- Valor Operacional: Fornece ensaios padronizados e escalonáveis para análise reprodutível de tecidos e função.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avanço ou interrupção do projeto ao fornecer pontos finais fenotípicos robustos para priorização de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco e a despriorização com base em dados quantitativos de desenvolvimento e função.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de camundongos, manipulação de tecidos e análise quantitativa de imagens.
- Exige acesso à infraestrutura para coloração histológica, aquisição de imagens e ensaios funcionais.
- Necessita padronização entre equipes no preparo dos tecidos e na quantificação dos pontos finais.
- Adaptável a diversas origens genéticas e estágios de desenvolvimento em modelos de camundongos.
- Depende de cronometragem e manipulação precisas para garantir resultados funcionais confiáveis.
