Seqüenciamento da microflora bacteriana no sangue periférico: a nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV

Sequenciamento da microflora bacteriana que transloca para o sangue periférico. Nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV, sou Marti Júnior, e atuo como professora assistente na Clínica de Doenças Infecciosas e Medicina Tropical da Universidade de Milão, na Itália. E agora mostraremos a vocês experimentos sobre como detectar e sequenciar o DNA bacteriano do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV.

O trato gastrointestinal saudável é colonizado por uma grande variedade de microrganismos comensais que influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico humoral e celular inato. A microbiota é protegida do sistema imunológico por uma barreira mucosa forte, seguindo diversas condições clínicas, como infecções, tratamento com antibióticos, complicações pós-operatórias, bem como em pacientes com carcinoma, pancreatite e desnutrição. Ocorre uma alteração do trato gastrointestinal.

A infecção por HIV causa uma ruptura da barreira gastrointestinal com falha progressiva da imunidade mucosal e vazamento para a circulação sistêmica de bioprodutos bacterianos, como lipopolissacarídeo e fragmentos de DNA bacteriano, que contribuem para a ativação imune sistêmica, demonstrando as fases experimentais da detecção e sequenciamento de DNA bacteriano. Presentes na corrente sanguínea periférica de pacientes infectados pelo HIV estarão Camilla ti, uma pesquisadora colaboradora em doenças infecciosas, Esther, eu, uma estudante de doutorado, e ju MariaI, uma pesquisadora pós-doutoranda, todos frequentando a clínica de Doenças Infecciosas e Medicina Tropical da Universidade de Milão. Nosso experimento tem como objetivo identificar espécies bacterianas em amostras de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV.

Vamos utilizar sangue total de indivíduos infectados pelo HIV e de indivíduos saudáveis, já que pessoas saudáveis apresentam homeostase intestinal normal. Não esperamos observar microflora translocante nesses pacientes. O sangue total será coletado dos pacientes, seguido pela separação do plasma.

O DNA será então extraído para realizar uma reação de PCR ampla para o gene ribossomal 16S do PCIC. Após a reação de PCR, serão realizadas purificação do produto, clonagem e análise de sequenciamento. O primeiro passo do nosso experimento é a coleta de sangue por venopunção, seguida pela separação do plasma.

Sangue total, aproximadamente nove mililitros, é coletado em tubos contendo EDTA. Os tubos são colocados em uma centrífuga a 2000 RPM por 10 minutos. A centrifugação à temperatura ambiente permite a separação do plasma.

O DNA será agora extraído das nossas amostras de plasma. Desinfete adequadamente a cabine, as pipetas e os materiais necessários para o experimento, a fim de garantir a esterilidade, posicionando todos os materiais sob luz UV por pelo menos 30 minutos. Desligue as luzes UV, limpe as luvas com um desinfetante, umedeça algumas toalhas de papel com etanol e coloque-as sob a cabine sempre que descartar uma ponteira. Durante o procedimento de extração de DNA, limpe a pipeta nas toalhas de papel umedecidas.

Agora você está pronto para a extração de DNA. O DNA é extraído utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, 350 microlitros de plasma são colocados em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.

Água ultra pura é usada como controle negativo. Dez microlitros de lisossomo, numa concentração final de 1 mg por mL, são adicionados às amostras. As amostras são então incubadas por 30 minutos.

À temperatura de 37 graus Celsius, a solução A, clorofórmio e a solução B são então adicionadas às amostras de acordo com as instruções após a centrifugação. Três fases distintas irão aparecer. O sobrenadante é coletado e adicionado ao etanol, permitindo a precipitação do DNA; a concentração de DNA é lida com um espectrofotômetro.

O próximo passo é uma amplificação ampla da reação de PCR para o gene ribossomal PRIC 16 s. A PCR é realizada em uma sala dedicada. Uma mistura de PCR é preparada usando estes reagentes. A mistura de PCR é filtrada por 30 minutos a 500 ×g a quatro graus Celsius para evitar possível contaminação por polimerase de bactérias ambientais.

A mistura de PCR é então dividida em alíquotas, de acordo com o número de amostras que precisam ser amplificadas. Lembre-se de considerar alíquotas para controles negativos e positivos da reação.

A TERMOCICLAGEM é programada nas seguintes condições: 94 graus Celsius por cinco minutos. 94 graus Celsius, 55 graus Celsius, 72 graus Celsius por um minuto durante 40 ciclos, 72 graus Celsius por 10 minutos. A duração média é de três horas.

Os produtos de PCR são visualizados em um gel de agarose a 2%. Este é um gel de agarose a 2% mostrando os produtos de PCR. A primeira fileira contém uma escada de 100 pares de bases.

A segunda estria, um controle positivo de PCR. A terceira estria contém um controle negativo de PCR. A quarta estria mostra amostras de um paciente positivo para HIV e a quinta estria contém uma estria com água.

Seis mostra amostras de um indivíduo saudável e uma reação de PCR negativa. A fita sete contém água. A IFICAÇÃO PCR é o próximo passo.

Os produtos de PCR são purificados utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Muitas colunas contendo filtros são usadas nesta etapa. Os resultados de PCR são registrados em uma folha de trabalho.

Agora vamos prosseguir com a clonagem utilizando a seleção azul-branca. Uma técnica molecular que permite a detecção da inserção bem-sucedida de DNA em um vetor. O vetor é transformado em células competentes. Bactérias.

As células competentes são cultivadas na presença de xal. Se a ligation for bem-sucedida, a colônia bacteriana será branca. Caso contrário, a colônia será azul.

Xal é usado para indicar se uma célula expressa a enzima beta-galactosidase e para visualizar a transformação de colônias de E. coli. O IPTG induz a expressão da beta-galactosidase. Xal e IPTG são espalhados em placas contendo ampicilina. Uma mistura de clonagem contendo produtos de PCR, SALT e um vetor de clonagem é preparada seguindo as instruções do fabricante.

As células de E coli são mantidas no gelo. Em seguida, a mistura de clonagem é adicionada às células, que posteriormente passam por choque térmico e são semeadas em placas, as quais são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, colônias brancas e azuis se desenvolvem nas placas.

As colônias brancas são positivas para produtos de PCR. As inserções e colônias azuis são negativas para inserção do produto de PCR. Selecionam-se 10 colônias brancas e uma colônia azul.

Cada colônia é colocada em dois mililitros de caldo LB líquido. As colônias em meio acrescido de ampicilina são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, as colônias cultivadas durante a noite são utilizadas para extração de plasmídeo com um kit comercial de mini-prep.

Mini colunas contendo filtros são usadas na etapa seguinte à extração do plasmídeo, em que os plasmídeos são visualizados em um gel de AROS a 0,7%. Este é um gel de AROS a 0,7% mostrando os produtos de mini-prep. A primeira fileira contém uma escada de um quilobase.

A segunda faixa contém a colônia controle azul. As faixas de três a doze contêm colônias brancas. Os resultados são registrados com uma planilha de trabalho. A seguir, o sequenciamento, os plasmídeos são amplificados.

É feita uma mistura utilizando esses reagentes. A mistura de PCR é dividida em alíquotas de acordo com o número de amostras que precisam ser amplificadas. O termociclamento é programado nas seguintes condições: 96 graus Celsius por um minuto, 96 graus Celsius por 10 segundos, 50 graus Celsius por cinco segundos, 60 graus Celsius por quatro minutos.

Por 25 ciclos. A duração média é de aproximadamente uma hora. Após a amplificação, os produtos de PCR são purificados utilizando colunas contendo filtro.

Os produtos purificados são carregados em uma placa, que é então colocada em um sequenciador. Após a obtenção de uma sequência, ela é inserida no blast e as espécies bacterianas de cada colônia são identificadas. Colônias que exibem sequências com homologia de 98% a 100% são consideradas positivas.

Este é um exemplo de sequenciamento bacteriano em plasma de um indivíduo positivo para HIV. Nossos resultados mostram que a translocação microbiana na doença por HIV envolve uma flora polimicrobiana. Demonstramos aqui que pacientes infectados pelo HIV apresentam uma alta microflora microbiana polimicrobiana na circulação sistêmica.

O DNA bacteriano no sangue periférico estava abaixo do limite de detecção em nossos indivíduos saudáveis negativos para HIV, possivelmente refletindo a integridade do trato gastrointestinal. Nossa pesquisa está agora focada em compreender e investigar o possível papel da microflora no sangue periférico na imunopatogênese do HIV e, possivelmente, na resposta ao tratamento.