Name: Seqüenciamento da microflora bacteriana no sangue periférico: a nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Aprenda a sequenciar DNA bacteriano no sangue periférico de pacientes com HIV. Este método identifica espécies microbianas translocadas e sua relação com a ativação imune sistêmica na infecção pelo HIV.

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Somos gratos a Gianni Scimone para assistência excelente, com tomada de vídeo.

Manipulação de amostras de sangue contaminado pelo HIV requer algumas recomendações importantes. Todas as amostras de sangue devem ser transportados em robusta contentores estanques. É preciso ter cuidado ao coletar a amostra para evitar a contaminação do exterior do container e de qualquer documentação que acompanha a amostra. Todas as pessoas de processamento de sangue infectados devem usar luvas. As luvas devem ser mudadas e as mãos lavadas após a conclusão do processamento das amostras. Processamento de amostras de sangue infectado pelo HIV deve ser feito em uma capa de gabinete classe II de risco biológico. Mecânicos auxiliares de pipetagem deve ser usado. Uso de agulhas ou outros instrumentos cortantes (incluindo por exemplo, pipetas de vidro ou tubos capilares) deve ser limitada a situações em que não há alternativa. Superfícies de laboratório devem ser descontaminados com um desinfectante químico apropriado após um derramamento de sangue e quando as atividades são concluídas. Materiais contaminados utilizados devem ser descontaminados antes de reutilizar ou deve ser eliminado de forma correcta por via de resíduos hospitalares. Cada incidente sobre a exposição ocupacional a sangue ou fluidos potencialmente infectantes (ou seja, aqueles que requerem precauções universais) deve ser tratada como uma emergência médica, as intervenções devem ser iniciadas imediatamente para ser eficaz. O protocolo exige cinco dias para sua conclusão. O prazo é detalhado na Figura 1. Espécies bacterianas são identificados usando os métodos descritos na Figura 2. 1. Coleta de Amostras <ol><li> 9 ml de sangue total é desenhada em tubos contendo EDTA. </li><li> Os tubos são centrifugados a 2000 rpm por 10 minutos a RT para obter plasma. </li><li> O plasma é coletado em um 2 ml estéril Eppendorf-tubo. </li></ol> 2. Extração de DNA de amostras de plasma <ol><li> Desinfectar adequadamente capô, pipetas e materiais necessários para o experimento, a fim de garantir a esterilidade. </li><li> Posição de todos os materiais sob luzes UV por pelo menos 30 minutos. </li><li> Limpe as luvas com um desinfectante. </li><li> Molhe um papel toalha poucos em etanol e colocá-los sob o capô. Cada vez que uma dica é descartado limpe a pipeta sobre as toalhas de papel molhado. </li></ol> DNA é extraído usando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). <ol start="5"><li> 350 uL de plasma são colocados em um tubo eppendorf estéril de 2ml. </li><li> 350 mL de água ultrapura filtrados são usados ​​como controle negativo. </li><li> Adicionar 10 mL de lisozima (1mg/ml) com as amostras. </li><li> Incubar por 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Adicione 500 ml de solução de Lise e misture delicadamente com as amostras. </li><li> Incubar durante 7 minutos a 65 ° C. </li><li> Adicionar 900 mL de clorofórmio para as amostras. </li><li> Vortex vigorosamente até que as amostras são uniformemente viscosa. </li><li> Adicione 200 ml de solução-precipitação e vortex vigorosamente. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.500 rpm por 10 minutos a RT para separar as fases e formam a interface. </li><li> Transferir a fase superior aquosa para um tubo de microcentrífuga fresco contendo 1 ml de etanol 100%. </li><li> Centrifugar as amostras a 10.500 rpm por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol 70%. </li><li> Centrifugar amostras na velocidade máxima por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol. O etanol residual deve ser removida com uma pipettator. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50 mL de água ultrapura. </li><li> Leia concentração de DNA com um espectrofotômetro. </li></ol> 3. Gene 16S rRNA PCR Amplificação por PCR é realizado como descrito anteriormente 9. <ol><li> Amplificar DNA em uma mistura de reação de 100 L com 10 mL de tampão PCR 10X, 5 mL de 25 mM MgCl2, 5 mL de 2 mM dNTPs total, 1 mL de 50 mM de primer RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 mL de 50 mM de primer DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 mL de H20 e 0,5 mL de Taq polimerase (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). </li><li> Transfira a mistura da PCR em filtros para evitar possível contaminação por Taq polimerase bacteriana. </li><li> Filtros de centrifugação (microcontrolador, Millipore, Billerica, MA, EUA) por 30 minutos a 500 rcf a 4 ° C. </li><li> Mix alíquota do PCR de acordo com o número de amostras que precisam ser amplificados (controles positivos e negativos de PCR, amostras de água e extraído). </li><li> Use as seguintes condições termociclador: 94 ° C por 10 minutos, 40 vezes por 1 minuto cada vez que a 94 ° C, 55 ° C e 72 ° C e 10 min a 72 ° C. </li><li> Visualize o produto da PCR em um gel de agarose 2%. Use 100 bp DNA ladder. PCR tamanho do produto é de aproximadamente 360 ​​pb (Figura 3). </li></ol> 4. PCR Purification produto Só PCR amostras positivas devem ser purificada. Purificação é realizada utilizandoinstruções de um fabricante de kit de seguir comercial (PureLink PCR MICROKIT, Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). <ol><li> Adicionar 4 volumes de tampão de ligação contendo isopropanol por um volume de produto da PCR. </li><li> Transferência de produto de PCR com tampão de ligação a uma coluna. </li><li> Centrifugar por 1 minuto a 10,000 rcf na RT. </li><li> Lavar coluna com tampão de lavagem contendo etanol. </li><li> Centrifugar por 1 minuto a 10,000 rcf na RT. </li><li> Centrifugar a velocidade máxima durante 1 minuto a RT para secar a membrana de sílica e remover qualquer tampão de lavagem residual com etanol. </li><li> Adicionar 10 mL de água ultrapura. </li><li> Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a velocidade máxima por 2 minutos em temperatura ambiente para coletar o DNA purificado. </li></ol> 5. Clonagem Lisogenia Caldo (LB) Preparação da placa <ol><li> Dissolver 25 gr de mistura LB em aproximadamente 800 ml de água. </li><li> Trazer o volume final para 1 L. </li><li> Adicionar 15 gr de Bactoagar. </li><li> Autoclave por 20 minutos. </li><li> Após autoclavagem, vigorosamente redemoinho da solução no frasco para misturar agar derretido. </li><li> Arrefecer a solução à 50 ° C. </li><li> Adicionar Ampicilina (50 mg / ml) e agite até que se dissolva. </li><li> Preparar placas a uma profundidade de aproximadamente 3mm. </li><li> Deixar as placas em temperatura ambiente. </li><li> Spread X-Gal (40mg/ml) e IPTG (100 mM) em cada placa LB e incubar a 37 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol> Transformação de células competentes Transformação é feita usando instruções de um fabricante de kit de seguir comercial (Topo TA cloning kit, Invitrogen, Carlsbad CA, EUA). <ol><li> Prepare a mistura de reacção clonagem (1-4 mL do produto da PCR fresco, 1 mL de solução salina, 1 mL do vetor e água se necessário). </li><li> Mistura de reacção gentilmente e incubar por 5-10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Coloque a reação no gelo. </li><li> Adicione 2 mL da reação de clonagem em um frasco de células competentes e misture delicadamente. </li><li> Incubar no gelo por 30 minutos. </li><li> De choque térmico as células por 30 segundos a 42 ° C. </li><li> Transferir imediatamente o tubo em gelo. </li><li> Adicionar 250 mL de meio. </li><li> Tampe o tubo e agitar tighly o tubo horizontalmente a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Spread 50 mL de cada transformação em uma placa pré-aquecida seletivo. </li><li> Incubar durante a 37 ° C. </li></ol> Após a incubação, colônias brancas e azuis se desenvolvem em placas. Colônias brancas são positivos para PCR de inserção de produtos e colônias azuis são negativas para a PCR de inserção do produto. 6. Análise de seqüenciamento Reação de sequenciamento <ol><li> A mistura é feita com estes reagentes: 2,5 mL de DNA, uma cartilha mL (5pmol / mL) 1,1 mL Big Dye (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). </li><li> Condições térmicas cycler: 96 ° C por 1 minuto, 25 vezes para 96 ​​° C por 10 segundos, 55 ° C por 15 segundos e 60 ° C por 4 min. </li></ol> Purificação coluna <ol><li> Para cada reação, prepare uma coluna MicroSpin (Qiagen, Milan, Itália). </li><li> Inverter coluna e vórtice de mistura de resina. </li><li> Pressão fora da parte inferior da coluna, afrouxe a tampa ¼ de volta, e coloque em uma coluna de tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrífuga 3200 rpm por 1 minuto. </li><li> Transferência de coluna para um tubo de microcentrífuga limpo. </li><li> Pipeta cuidadosamente a reação de seqüenciamento toda PCR para o centro da coluna. </li><li> Centrífuga 3200 rpm por 1 minuto. </li><li> DNA purificado vai eluite no tubo (20 l de água ultrapura). </li></ol> Análise de seqüenciamento <ol><li> Carregar a amostra purificada (20 l) em 96 com vários poços da placa. </li><li> Carregue a placa para o seqüenciador. Sequenciadores de DNA automatizados gerar um cromatograma de quatro cores mostrando os resultados da execução do seqüenciamento. </li><li> De entrada a seqüência de nucleotídeos como uma consulta nos bancos de dados seqüência de público. A pesquisa é realizada nas bases de dados NCBI e servidores, com a ferramenta de pesquisa local Alinhamento Básico (BLAST). </li><li> Considere as bactérias apenas com homologias 98-100%. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Timeline do procedimento. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluxogramas dos processo de identificação bacteriana inteira. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Gel agarose 2% mostrando 16S rRNA gene ampla gama de produtos PCR. Raia 1 contém uma escada de DNA 100bp, pista 2 contém o controle de PCR positiva, pista 3 mostra o controle PCR negativo. Faixa 4 mostra as amostras de um paciente HIV-positivo, e lane 5 contém água. Faixa 6 shows amostras de um indivíduo saudável e uma reação de PCR negativo; lane 7 contém água. Somente os pacientes HIV positivos exibe uma amplificação PCR positivo. Água ultrapura utilizada como controle negativo durante a etapa de extração, indica que nenhuma contaminação ocorreu. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Gel 0,7% agarose mostrando plasmídeo extraído com o procedimento miniprep. Raia 1 contém um 1 escada de DNA kilobase, pista 2 contém a colônia de controle azul, faixas de 3 a 12 contêm colônias brancas. O plasmídeo da colônia azul não contém a bula do produto da PCR. Todas as 10 colônias brancas contêm plasmídeo com a inserção correta. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Mostra um exemplo de análise de seqüenciamento de bactérias no plasma de um indivíduo HIV-positivo. Nossos resultados mostram que a translocação microbiana em HIV doença envolve uma flora polimicrobic, que não é visto em HIV-negativos assuntos, sugerindo falha substancial de imunidade intestinal no controle da translocação bacteriana.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<p class="jove_content"&gt; Vimos por este meio mostrar um protocolo de PCR / seqüenciamento para caracterizar a translocação de bactérias no sangue periférico de indivíduos infectados pelo HIV.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Resultados mais confiáveis ​​são obtidos quando se utiliza plasma coletadas em tubos contendo EDTA. Após coleta de sangue, plasma deve ser separado por centrifugação dentro de 03/02 horas, para evitar hemólise e degradação fragmento de DNA. As amostras são armazenadas primeiro em -20 ° C por aproximadamente 5 dias e dep...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Easty DNA-Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> UltraPure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 mcg / mL em água destilada </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Applied Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrolador 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> Escada de DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR micro kit </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> LB Agar em pó, </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 mg / mL em água destilada </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/ml em DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100mM em água destilada </td></tr><tr><td> Topo TA cloning kit </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink rápida kit Miniprep Plasmid </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Big dye </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2,0 spin-kit </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

seqüenciamento da microflora bacteriana no sangue periférico: a nossa experiência com pacientes infectados pelo hiv

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

O trato gastrointestinal saudável é fisiologicamente colonizada por uma grande variedade de micróbios comensais que influenciam o desenvolvimento do sistema 1,2 humoral e celular imune da mucosa. Microbiota é protegido do sistema imunológico através de uma forte barreira mucosa. Infecções e antibióticos são conhecidos por alterar tanto a barreira do trato gastrointestinal normal ea composição das bactérias residentes, o que pode resultar em possíveis alterações imunológicas 3. HIV causa uma brecha na barreira gastrointestinal com insuficiência progressiva da imunidade da mucosa e vazamento para a circulação sistêmica de bioprodutos bacteriana, como lipopolissacarídeos e fragmentos de DNA de bactérias, que contribuem para a ativação imune sistêmica 4-7. Translocação microbiana está implicado em HIV / AIDS imunopatogênese e resposta à terapia 4,8. Nosso objetivo foi caracterizar a composição de bactérias translocação no sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. A perseguir o nosso objectivo é criar uma reação de PCR para o gene 16S panbacteric ribosomial seguido por uma análise de seqüenciamento. Resumidamente, o sangue total de ambos os sujeitos infectados pelo HIV e saudável é usado. Dado que os indivíduos saudáveis ​​apresentam homeostase intestinal normal não translocação de microflora é esperado nesses pacientes. Após a colheita de sangue total por punção venosa e separação do plasma, o DNA é extraído do plasma e usado para executar uma ampla gama reação de PCR para o gene 16S panbacteric ribosomial 9. Análises de purificação seguinte produto PCR, clonagem e sequenciamento são executadas.

Nossa experiência vai mostrar como realizar uma análise de seqüenciamento de translocação de espécies bacterianas no sangue periférico de pacientes HIV positivos.

Seqüenciamento da microflora bacteriana no sangue periférico: a nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV

O trato gastrointestinal saudável é fisiologicamente colonizado por uma grande variedade de micróbios comensais que influenciam o desenvolvimento da resposta humoral...

Sequenciamento da microflora bacteriana que transloca para o sangue periférico. Nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV, sou Marti Júnior, e atuo como professora assistente na Clínica de Doenças Infecciosas e Medicina Tropical da Universidade de Milão, na Itália. E agora mostraremos a vocês experimentos sobre como detectar e sequenciar o DNA bacteriano do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV.O trato gastrointestinal saudável é colonizado por uma grande variedade de microrganismos comensais que influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico humoral e celular inato. A microbiota é protegida do sistema imunológico por uma barreira mucosa forte, seguindo diversas condições clínicas, como infecções, tratamento com antibióticos, complicações pós-operatórias, bem como em pacientes com carcinoma, pancreatite e desnutrição. Ocorre uma alteração do trato gastrointestinal.A infecção por HIV causa uma ruptura da barreira gastrointestinal com falha progressiva da imunidade mucosal e vazamento para a circulação sistêmica de bioprodutos bacterianos, como lipopolissacarídeo e fragmentos de DNA bacteriano, que contribuem para a ativação imune sistêmica, demonstrando as fases experimentais da detecção e sequenciamento de DNA bacteriano. Presentes na corrente sanguínea periférica de pacientes infectados pelo HIV estarão Camilla ti, uma pesquisadora colaboradora em doenças infecciosas, Esther, eu, uma estudante de doutorado, e ju MariaI, uma pesquisadora pós-doutoranda, todos frequentando a clínica de Doenças Infecciosas e Medicina Tropical da Universidade de Milão. Nosso experimento tem como objetivo identificar espécies bacterianas em amostras de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV.Vamos utilizar sangue total de indivíduos infectados pelo HIV e de indivíduos saudáveis, já que pessoas saudáveis apresentam homeostase intestinal normal. Não esperamos observar microflora translocante nesses pacientes. O sangue total será coletado dos pacientes, seguido pela separação do plasma.O DNA será então extraído para realizar uma reação de PCR ampla para o gene ribossomal 16S do PCIC. Após a reação de PCR, serão realizadas purificação do produto, clonagem e análise de sequenciamento. O primeiro passo do nosso experimento é a coleta de sangue por venopunção, seguida pela separação do plasma.Sangue total, aproximadamente nove mililitros, é coletado em tubos contendo EDTA. Os tubos são colocados em uma centrífuga a 2000 RPM por 10 minutos. A centrifugação à temperatura ambiente permite a separação do plasma.O DNA será agora extraído das nossas amostras de plasma. Desinfete adequadamente a cabine, as pipetas e os materiais necessários para o experimento, a fim de garantir a esterilidade, posicionando todos os materiais sob luz UV por pelo menos 30 minutos. Desligue as luzes UV, limpe as luvas com um desinfetante, umedeça algumas toalhas de papel com etanol e coloque-as sob a cabine sempre que descartar uma ponteira. Durante o procedimento de extração de DNA, limpe a pipeta nas toalhas de papel umedecidas.Agora você está pronto para a extração de DNA. O DNA é extraído utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, 350 microlitros de plasma são colocados em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.Água ultra pura é usada como controle negativo. Dez microlitros de lisossomo, numa concentração final de 1 mg por mL, são adicionados às amostras. As amostras são então incubadas por 30 minutos.À temperatura de 37 graus Celsius, a solução A, clorofórmio e a solução B são então adicionadas às amostras de acordo com as instruções após a centrifugação. Três fases distintas irão aparecer. O sobrenadante é coletado e adicionado ao etanol, permitindo a precipitação do DNA; a concentração de DNA é lida com um espectrofotômetro.O próximo passo é uma amplificação ampla da reação de PCR para o gene ribossomal PRIC 16 s. A PCR é realizada em uma sala dedicada. Uma mistura de PCR é preparada usando estes reagentes. A mistura de PCR é filtrada por 30 minutos a 500 ×g a quatro graus Celsius para evitar possível contaminação por polimerase de bactérias ambientais.A mistura de PCR é então dividida em alíquotas, de acordo com o número de amostras que precisam ser amplificadas. Lembre-se de considerar alíquotas para controles negativos e positivos da reação.A TERMOCICLAGEM é programada nas seguintes condições: 94 graus Celsius por cinco minutos. 94 graus Celsius, 55 graus Celsius, 72 graus Celsius por um minuto durante 40 ciclos, 72 graus Celsius por 10 minutos. A duração média é de três horas.Os produtos de PCR são visualizados em um gel de agarose a 2%. Este é um gel de agarose a 2% mostrando os produtos de PCR. A primeira fileira contém uma escada de 100 pares de bases.A segunda estria, um controle positivo de PCR. A terceira estria contém um controle negativo de PCR. A quarta estria mostra amostras de um paciente positivo para HIV e a quinta estria contém uma estria com água.Seis mostra amostras de um indivíduo saudável e uma reação de PCR negativa. A fita sete contém água. A IFICAÇÃO PCR é o próximo passo.Os produtos de PCR são purificados utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. Muitas colunas contendo filtros são usadas nesta etapa. Os resultados de PCR são registrados em uma folha de trabalho.Agora vamos prosseguir com a clonagem utilizando a seleção azul-branca. Uma técnica molecular que permite a detecção da inserção bem-sucedida de DNA em um vetor. O vetor é transformado em células competentes. Bactérias.As células competentes são cultivadas na presença de xal. Se a ligation for bem-sucedida, a colônia bacteriana será branca. Caso contrário, a colônia será azul.Xal é usado para indicar se uma célula expressa a enzima beta-galactosidase e para visualizar a transformação de colônias de E. coli. O IPTG induz a expressão da beta-galactosidase. Xal e IPTG são espalhados em placas contendo ampicilina. Uma mistura de clonagem contendo produtos de PCR, SALT e um vetor de clonagem é preparada seguindo as instruções do fabricante.As células de E coli são mantidas no gelo. Em seguida, a mistura de clonagem é adicionada às células, que posteriormente passam por choque térmico e são semeadas em placas, as quais são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, colônias brancas e azuis se desenvolvem nas placas.As colônias brancas são positivas para produtos de PCR. As inserções e colônias azuis são negativas para inserção do produto de PCR. Selecionam-se 10 colônias brancas e uma colônia azul.Cada colônia é colocada em dois mililitros de caldo LB líquido. As colônias em meio acrescido de ampicilina são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, as colônias cultivadas durante a noite são utilizadas para extração de plasmídeo com um kit comercial de mini-prep.Mini colunas contendo filtros são usadas na etapa seguinte à extração do plasmídeo, em que os plasmídeos são visualizados em um gel de AROS a 0,7%. Este é um gel de AROS a 0,7% mostrando os produtos de mini-prep. A primeira fileira contém uma escada de um quilobase.A segunda faixa contém a colônia controle azul. As faixas de três a doze contêm colônias brancas. Os resultados são registrados com uma planilha de trabalho. A seguir, o sequenciamento, os plasmídeos são amplificados.É feita uma mistura utilizando esses reagentes. A mistura de PCR é dividida em alíquotas de acordo com o número de amostras que precisam ser amplificadas. O termociclamento é programado nas seguintes condições: 96 graus Celsius por um minuto, 96 graus Celsius por 10 segundos, 50 graus Celsius por cinco segundos, 60 graus Celsius por quatro minutos.Por 25 ciclos. A duração média é de aproximadamente uma hora. Após a amplificação, os produtos de PCR são purificados utilizando colunas contendo filtro.Os produtos purificados são carregados em uma placa, que é então colocada em um sequenciador. Após a obtenção de uma sequência, ela é inserida no blast e as espécies bacterianas de cada colônia são identificadas. Colônias que exibem sequências com homologia de 98% a 100% são consideradas positivas.Este é um exemplo de sequenciamento bacteriano em plasma de um indivíduo positivo para HIV. Nossos resultados mostram que a translocação microbiana na doença por HIV envolve uma flora polimicrobiana. Demonstramos aqui que pacientes infectados pelo HIV apresentam uma alta microflora microbiana polimicrobiana na circulação sistêmica.O DNA bacteriano no sangue periférico estava abaixo do limite de detecção em nossos indivíduos saudáveis negativos para HIV, possivelmente refletindo a integridade do trato gastrointestinal. Nossa pesquisa está agora focada em compreender e investigar o possível papel da microflora no sangue periférico na imunopatogênese do HIV e, possivelmente, na resposta ao tratamento.

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Tropismo do HIV pode ser inferida a partir da região V3 do envelope viral. V3 é PCR amplificados em triplicata utilizando nested RT-PCR, sequenciado, e interpretados usando software de bioinformática. Amostras com a seqüência de um ou mais (s) com pontuações baixas são G2P classificados como não-R5 vírus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Aprenda a sequenciar DNA bacteriano no sangue periférico de pacientes com HIV. Este método identifica espécies microbianas translocadas e sua relação com a ativação imune sistêmica na infecção pelo HIV.

Seqüenciamento da microflora bacteriana no sangue periférico: a nossa experiência com pacientes infectados pelo HIV

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