Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid
27 de julho de 2011
Aqui nós descrevemos uma tela superexpressão plasmídeo em Saccharomyces cerevisiae, Usando uma biblioteca vestiu plasmídeo e uma alta taxa de transferência de protocolo de transformação de levedura com um robô para manipulação de líquidos.
O objetivo geral deste procedimento é transformar células de levedura com uma biblioteca de DNAs plasmáticos. Isso é feito primeiro cultivando uma quantidade adequada de células de levedura. As células de levedura são então tratadas com acetato de lítio para torná-las competentes para a transformação do DNA.
Em seguida, transforme as células e competentes misturando-as com DNA. A etapa final do procedimento é selecionar e analisar os transformantes. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram os efeitos do DNA plasmático nos fenótipos de leveduras por meio de ensaios de detecção de leveduras e/ou microscopia.
A principal vantagem dessa técnica em relação aos protocolos existentes, como transformações de levedura padrão, é que ela permite a transformação de um grande número de plasmídeos diferentes em células de levedura de forma automatizada. Este protocolo de transformação de levedura de alto rendimento foi projetado para placas de 10 a 96 poços, mas pode ser ampliado ou reduzido de acordo. Para experimentos em larga escala, a chave para o sucesso é manter todas as placas e reagentes organizados.
Uma vez que o experimento esteja em andamento para evitar confusão, um manipulador rápido de líquido de placa biobot será usado neste protocolo Para iniciar alíquota, cinco a 10 microlitros de DNA de plasma de uma biblioteca de plasmídeos de levedura em cada poço da rodada. Placas inferiores de 96 poços. Coloque as placas de 96 poços descobertas dentro de uma capela de exaustão de bancada limpa durante a noite para secar.
Em seguida, inocular 200 mililitros de peptídeo de levedura dextrose ou meio YPD com uma cepa de consulta em um frasco Lin Meyer de 500 mililitros perplexo, incubar durante a noite a 30 graus Celsius com agitação na manhã seguinte. Dilua a tensão de consulta para um OD 600 de 0,1 em dois litros de mídia YPD para um crescimento ideal. Cultive culturas de até um litro em frascos defletores separados de 2,8 litros.
Agitar os frascos durante quatro a seis horas a 30 graus Celsius até que as culturas atinjam uma DO 600 de 0,8 a 1,0. Quando a cultura de levedura atingir um OD 600 de 0,8 a 1,0, colha as células por centrifugação. Encha quatro tubos cônicos descartáveis de 225 mililitros com cultura e gire 3000 RPM por cinco minutos em uma centrífuga de mesa.
Despeje o sobrenadante S de cada tubo. Adicione mais cultura aos mesmos tubos e centrifugue novamente, repetindo conforme necessário até que todas as células sejam colhidas. Lave cada pellet celular em 50 mililitros de água destilada em autoclave e Resus gaste por vórtice.
Combine as células em um tubo cônico de duzentos e vinte e cinco mililitros e gire a 3000 RPM por cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante S, lave as células em cem mililitros de solução de acetato de lítio. Gire novamente a 3000 RPM por cinco minutos.
Remova o SNA ressuspendendo o pellet celular em 70 mililitros de solução de acetato de lítio. Vortex em alta velocidade por cerca de 30 segundos até que o pellet seja completamente ressuspenso. Incubar com agitação a 30 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, adicione beta-me capto etanol a 0,1 molar incubar com agitação a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, adicione dois mililitros de DNA de esperma de salmão fervido e resfriado à mistura de células. Despeje a mistura de células em uma placa de poço único autoclavável e, em seguida, remova qualquer precipitado que se forme, pois isso pode interferir na pipetagem a jusante.
Usando a alíquota rápida de placa do biobot, 50 microlitros de mistura de células para cada poço dos quatro previamente preparados. Placas de 96 poços contendo DNA de plasma não se misturam. Incube as placas em temperatura ambiente por 30 minutos sem agitar enquanto as células estão incubando.
Prepare 200 mililitros de solução de acetato de lítio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de 50%PEG 33, 50 20 mililitros de DMSO e 20 mililitros de acetato de lítio de um molar. É importante que esta solução seja preparada imediatamente antes do uso.
Adicione 125 microlitros de solução de DMSO de acetato de lítio PEG a cada um. Misture bem aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos sem agitar.
Em seguida, choque térmico as células a 42 graus Celsius por 15 minutos Em uma incubadora seca, não empilhe as placas após o choque térmico, gire as placas usando adaptadores de centrífuga para acomodar as placas de 96 poços. Após a centrifugação, remova a solução de PEG invertendo as placas sobre um balde de resíduos. Em seguida, seque os pratos invertidos em papel toalha.
Para remover o líquido residual, as células permanecerão no fundo dos poços. Enxágue as células adicionando 200 microlitros de mídia mínima a cada uma. Bem, gire as placas novamente.
Remova o sobrenadante invertendo sobre um balde de resíduos e enxugando em papel toalha. Adicione 200 microlitros de meio mínimo a cada poço com uma incubação rápida de placas a 30 graus Celsius por dois dias sem agitação. Após dois dias, pequenas colônias de células devem começar a se formar na parte inferior de cada Transformado com sucesso.
Bem, para se preparar para o ensaio de Spatting, primeiro dispense 200 microlitros de meio mínimo à base de OSE em cada poço de um novo plano. Placa inferior de 96 poços. Próximo. Misturar cada alvéolo da placa de transformação aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes com uma placa rápida.
Inocular cada poço da placa de rafinose com cinco microlitros de mistura de células da placa de transformação, incubar a 30 graus Celsius por um dia. No dia seguinte. Pequenas colônias devem estar presentes na parte inferior de cada uma.
Bem, execute o ensaio de detecção no capô, esterilize um parafuso 96, replicador ou frogger flamejante. Misture as colônias com um frogger e, em seguida, localize as colônias em placas de mídia seletiva. Após a mancha, deixe as placas secarem no capô por cinco a 10 minutos.
Incube as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias. Aqui estão os resultados representativos de um plasmídeo de levedura sobre a tela de expressão para identificar supressores e intensificadores de TDP 43.Toxicidade. TDP 43 é uma proteína humana que tem sido implicada na patogênese de uma esclerose lateral miotrófica ou doença de Lou Gehrig expressando TDP 43 em células de levedura resulta em agregação e citotoxicidade.
Essas placas exibem colônias com um plasmídeo T DP 43 induzível por galactose integrado que também foi transformado com plasmídeos da biblioteca de expressão de ORF do gene flex. As colônias aqui aparecem na cor vermelha porque a cepa tem uma mutação que resulta no acúmulo de um pigmento vermelho. A placa à esquerda contém glicose, que reprime a expressão de T DP 43 ou dos plasmídeos do gene flex.
A placa à direita contém galactose, que induz a expressão de TDP 43 e OFs nos plasmídeos do gene flex. A ponta da seta verde indica uma colônia transformada com um plasmídeo que suprime a toxicidade do TDP 43, conforme indicado por um crescimento mais rápido e colônias mais densas. A ponta da seta vermelha indica uma colônia transformada com um plasmídeo que aumenta a toxicidade do TDP 43, conforme indicado por um crescimento mais lento e colônias menos densas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transformar uma biblioteca de DNAs de plasma de células.
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Visão geral
Este artigo descreve uma triagem de superexpressão de plasmídeo em Saccharomyces cerevisiae, utilizando um protocolo de transformação de levedura de alto rendimento. O processo envolve a transformação de células de levedura com uma biblioteca de matriz de DNA plasmídeo para analisar os efeitos nos fenótipos da levedura.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Microbiologia
- Genética
- Biologia celular
Fundo
- As triagens de superexpressão de plasmídeo são essenciais para estudar a função dos genes.
- Saccharomyces cerevisiae serve como um organismo modelo para estudos genéticos.
- Métodos de alto rendimento aumentam a eficiência das transformações genéticas.
- Compreender os fenótipos da levedura pode fornecer insights sobre processos biológicos mais amplos.
Objetivo do estudo
- Transformar células de levedura com DNA plasmídeo para avaliar a função dos genes.
- Utilizar um robô de manuseio de líquidos para transformações de alto rendimento.
- Analisar os transformantes resultantes quanto a mudanças fenotípicas.
Métodos utilizados
- As células de levedura são cultivadas até uma densidade apropriada.
- As células são tratadas com acetato de lítio para induzir competência para transformação.
- As células competentes são misturadas com DNA plasmídeo para transformação.
- Os transformantes são selecionados e analisados usando ensaios de manchas de levedura e microscopia.
Principais resultados
- Transformação bem-sucedida de células de levedura com DNA plasmídeo.
- Identificação de mudanças fenotípicas nos transformantes.
- Demonstração da eficácia dos métodos de alto rendimento.
- Insights sobre os papéis funcionais de genes específicos na levedura.
Conclusões
- A triagem de superexpressão de plasmídeo é uma ferramenta valiosa para análise genética.
- Técnicas de alto rendimento podem acelerar significativamente a pesquisa em genética de levedura.
- Os resultados contribuem para a compreensão da função e regulação dos genes.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
High-throughput yeast plasmid overexpression screens enable systematic identification of genetic modifiers impacting cellular phenotypes relevant to human disease. This scalable approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by leveraging a well-characterized eukaryotic model. Integration of automated liquid handling accelerates discovery inflection points and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in disease-relevant phenotypes.
- Supports identification of genetic suppressors and enhancers for mechanistic de-risking.
- Facilitates functional target validation through systematic gain-of-function screening.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in complex biological systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions using automated liquid handling for reproducibility.
- Generates quantitative phenotypic outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Enables scalable screening of thousands of plasmids in parallel for robust data generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast phenotypes with human disease mechanisms for translational continuity.
- Supports identification of genetic modifiers relevant to neurodegenerative disease models.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of targets into preclinical validation.
- Offers predictive de-risking value by modeling aggregation-prone protein toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput yeast transformation protocol bridges early discovery and lead identification by enabling systematic genetic screens with direct translational relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible yeast models for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colony growth and density measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast-based findings to preclinical disease models when aligned with human protein toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable screening capability for diverse phenotypic endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and high-throughput screening protocols.
- Depends on access to liquid handling robotics and 96-well plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and data analysis.
- Adaptable to various phenotypes but may require optimization for specific readouts.
- Scalability and reproducibility depend on rigorous plate and reagent management.
