Name: Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a transformar Saccharomyces cerevisiae com bibliotecas de plasmídeos em alta escala usando robô de manipulação líquida. Este método automatizado permite triagens de superexpressão para identificar modificadores genéticos de fenótipos relacionados a doenças neurodegenerativas humanas.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Centro de Packard de Investigação em ALS Johns Hopkins (ADG), um diretor Award NIH Innovator New 1DP2OD004417-01 (ADG), R01 NIH NS065317 (ADG), a Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG é um Scholar Pew em Ciências Biomédicas, apoiado pelo Pew Charitable Trusts.

1. Preparações para a transformação de levedura Este protocolo é projetado para dez placas de 96 poços, mas podem ser ampliados ou reduzidos em conformidade. Descobrimos que este protocolo não funciona bem por mais de vinte placas de 96 poços por rodada de transformação. O procedimento de transformação inteira (a partir do passo I.3) levará cerca de oito horas. <ol><li> Alíquota de 5 10μL de DNA plasmídeo (100 ng / mL) a partir da levedura biblioteca ORF FLEXGene em todos os poços de fundo redondo-96-bem placa com Biorobot manipulador RapidPlate líquido. Lugar descoberto placas de 96 poços na capa da bancada limpa fume durante a noite para secar. Nós descobrimos que a eficiência de transformação semelhante com o CEN e plasmídeos de levedura 2μ. </li><li> Inocular 200 ml de levedura peptona dextrose (YPD) media (10g / L de extrato de levedura, 20g / L de peptona, 20g / L de glicose) com a tensão de consulta em um Erlenmeyer de 500mL perplexo. Incubar durante a 30 ° C com agitação (200 rpm). Se necessário, meios seletivos também pode ser usado para essas culturas starter. </li><li> Na manhã seguinte, dilua a tensão consulta para OD 600 = 0,1 em 2L de YPD. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) até que a cultura atinge OD 600 = 0,8-1,0. Para o crescimento ideal, crescem duas culturas separadas na 1L 2,8 L frascos perplexo. Se necessário, meios seletivos também pode ser usado em vez de YPD. </li></ol> 2. Transformação de levedura <ol><li> Colheita de células por centrifugação. Encher quatro descartáveis ​​225mL tubos cônicos com cultura de levedura, girando em 3000rpm (~ xg 1800) por 5 minutos em centrífuga de mesa (Eppendorf 5810R). Deitar fora o sobrenadante e repetir até que todas as células são colhidas. </li><li> Lavar as células em 200ml de autoclavado destilada H 2 O. Ressuspender pellet celular por agitação ou vórtex. Combine as células em um tubo cônico 225mL. Giram a 3000rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante. </li><li> Preparar a solução 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 em água destilada autoclavada). Lavar as células 0.1MLiOAc/1XTE 100mL. Giram a 3000rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender celular em 70ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Agitar e / ou vortex para garantir pellet ressuspenso é completamente. </li><li> Incube com agitação a 30 ° C por 30 minutos (200 rpm). </li><li> Adicionar β-mercaptoetanol a 0,1 M. Incube com agitação a 30 ° C por 30 minutos (200 rpm). Nota: Este passo pode ser omitido se estiver usando cepas de leveduras que são sensíveis à β-mercaptoetanol. Descobrimos que este passo não é essencial para a transformação bem-sucedida, no entanto, faz melhorar a eficiência de transformação. </li><li> Ferva 2 ml de DNA sonicado salmão esperma (10mg/mL) por 15 minutos, e depois relaxar no gelo. </li><li> Adicionar 2 ml de DNA de esperma de salmão cozido à mistura de células. Atenção: A precipitação pode formar com a adição do DNA do esperma de salmão com a mistura de células. Usando um Pipetman e 200 mL ponta, retire cuidadosamente qualquer precipitado que se forma, pois isso poderá interferir com pipetagem a jusante. </li><li> 50μL alíquota da mistura de células para cada poço da placa de 96 poços usando o Rapidplate BioRobot (também pode usar multi-canal de pipeta). Não se misturam. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitar. </li><li> Prepare 200mL de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% PEG-3350, DMSO 20mL, 20mL LiOAc 1M). Preparar a solução imediatamente antes da utilização. </li><li> Adicionar 125μL de PEG / LioAc / DMSO solução para cada poço. Mix, aspirando e dispensando suspensão de células oito vezes com RapidPlate. </li><li> Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitar. </li><li> Choque térmico das células a 42 ° C por 15 minutos em uma incubadora de seca. Não empilhar chapas. Nota: Nós descobrimos que essa etapa de choque térmico não é essencial para a transformação bem sucedida. Para certas cepas de leveduras (por exemplo, os mutantes sensíveis à temperatura), choque térmico é deletéria. Nós já reduziu o tempo de choque de calor para um minuto e ter sido capaz de transformar uma cepa de levedura abrigar uma mutação sensível a temperatura ypt1 usando esse protocolo. </li><li> Placas giram em 2500rpm (~ xg 1100) por 5 minutos, usando adaptadores centrífuga para acomodar placas de 96 poços. Remoção da solução de PEG por placas de inversão da caçamba de resíduos. Blot placa invertida sobre papel toalha para remover o líquido residual (células permanecerão no fundo de poços). </li><li> Enxágüe células adicionando 200μL de meio mínimo (por exemplo SD /-Ura) para cada poço com RapidPlate. </li><li> Girar placas a 2500rpm por 5 minutos e retire sobrenadante por inversão balde de lixo ao longo e nas toalhas de papel mata-borrão. </li><li> Adicionar 200μL de meio mínimo (por exemplo SD /-Ura) para cada poço com RapidPlate. </li><li> Incubar a 30 ° C por 2 dias sem agitar. Depois de dois dias, pequenas colônias de células deve começar a se formar na parte inferior de cada transformado com sucesso também. </li></ol> 3. Spotting ensaio <ol><li> Dispensar 200μL de rafinose mídia baseada mínima (por exemplo SRAF /-Ura) em cada poço deuma placa de fundo chato de 96 poços novos. </li><li> Mix cada poço da placa de transformação, aspirando e dispensando suspensão de células oito vezes com Rapidplate. </li><li> Inocular placas SRAF com 5μL da mistura de células de placa transformação. </li><li> Incubar a 30 ° C por um dia. Pequenas colônias devem estar presentes na parte inferior de cada poço depois de um dia. </li><li> Colônias Spot on SD /-Ura e / Ura-SGAL placas no capô. Esterilizar 96-parafuso replicador (frogger) por chamas. Mix colônias com frogger antes de spotting em placas de meios seletivo. Depois de spotting, permitem que as placas para secar na capa por 5-10 minutos. </li><li> Incubar a 30 ° C por 2-3 dias. </li></ol> Placas de fotografia com câmera digital, e visualmente comparar o crescimento das colônias em SGAL /-Ura placas para encontrar colônias em que a toxicidade tensão consulta é melhorada (um crescimento mais lento / colônias menos densas) ou suprimido (um crescimento mais rápido / mais densas colônias). 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Yeast tela superexpressão plasmídeo para identificar supressores e estimuladores da TDP-43 toxicidade. TDP-43 é uma proteína humana que tem sido implicado na patogênese da esclerose lateral amiotrófica (doença de Lou Gehrig). Agregados citoplasmáticos de TDP-43 acumula no cérebro e neurônios da medula espinhal de pacientes com ELA 17. Expressando TDP-43 em células de levedura resultados na agregação e citotoxicidade 18. Temos usado este sistema modelo para definir mecanismos de toxicidade TDP-43 19,20. Mostrados são exemplos de placas representativo de nossa levedura TDP-43 tela do modificador de toxicidade. Estas placas mostrar colônias com um sistema integrado de galactose induzível-TDP-43 plasmídeo e também transformada com os plasmídeos da biblioteca expressão FLEXGene ORF. A placa do lado esquerdo contém glicose, que reprime a expressão de TDP-43 ou os plasmídeos FLEXGene. A placa da direita contém galactose, que induz a expressão de TDP-43 e as ORFs na plasmídeos FLEXGene. A seta verde indica uma colônia transformada com um plasmídeo que suprime a toxicidade da TDP-43. A seta vermelha indica uma colônia transformada com um plasmídeo que aumenta a toxicidade da TDP-43.

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<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui apresentamos um protocolo para realizar um alto throughput tela superexpressão plasmídeo em levedura. Esta abordagem permite a detecção rápida e imparcial de modificadores genéticos de diferentes fenótipos celulares. Usando essa abordagem, um pesquisador pode selecionar uma porção significativa do genoma da levedura em questão de semanas. Esta abordagem imparcial também permite a identificação de modificadores, que podem não ter sido previsto com base em resultados anteriores. Nós temos usado essa abordagem para id...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 parafuso replicador (frogger) </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF Biblioteca </td><td> Instituto de Proteomics, Harvard Medical School </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> Frasco perplexo 500mL </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L triple-perplexo frasco Fernbach </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> Rapidplate 100μL ponteiras </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> Rapidplate 200μL ponteiras </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

alto rendimento yeast tela superexpressão plasmid

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

A levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é um sistema poderoso modelo para a definição de mecanismos fundamentais de muitos processos celulares importantes, incluindo aquelas com relevância direta para a doença humana. Por causa de seu tempo de geração curto e bem caracterizadas do genoma, uma grande vantagem experimental do sistema de modelo de levedura é a capacidade de realizar triagem genética para identificar genes e caminhos que estão envolvidos em um determinado processo. Nos últimos 30 anos como telas genética têm sido usadas para elucidar o ciclo celular, via de excreção, e muitos outros aspectos altamente conservadas da biologia das células eucarióticas 1-5. No últimos anos, diversas bibliotecas do genoma de cepas de leveduras e plasmídeos foram gerados 6-10. Estas colecções permitem agora para o interrogatório sistemático da função do gene usando-ganho e perda de função abordagens 11-16. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de um protocolo de transformação de alto rendimento fermento com um robô para manipulação de líquidos para executar uma tela superexpressão plasmídeo, usando uma biblioteca de vestidos de 5.500 plasmídeos de levedura. Temos vindo a utilizar estas telas para identificar modificadores genéticos de toxicidade associado ao acúmulo de agregação propensas proteínas humanas doença neurodegenerativa. Os métodos aqui apresentados são facilmente adaptáveis ​​para o estudo de outros fenótipos celulares de interesse.

Aqui nós descrevemos uma tela superexpressão plasmídeo em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Usando uma biblioteca vestiu plasmídeo e uma alta taxa de transferência de protocolo de transformação de levedura com um robô para manipulação de líquidos.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

A levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é um sistema modelo poderoso para definir mecanismos fundamentais de muitos processos celulares importantes, ...

O objetivo geral deste procedimento é transformar células de levedura com uma biblioteca em matriz de DNAs plasmidiais. Isso é realizado primeiramente cultivando-se uma quantidade apropriada de células de levedura. As células de levedura são então tratadas com acetato de lítio para torná-las competentes para a transformação de DNA.Em seguida, transforme as células competentes e misturando-as com DNA. O passo final do procedimento é selecionar e analisar os transformantes. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram os efeitos do DNA plasmidial sobre fenótipos de levedura por meio de ensaios de plaqueamento em levedura e/ou microscopia.A principal vantagem desta técnica em relação a protocolos existentes, como as transformações padrão em levedura, é que ela permite a transformação de um grande número de plasmídeos diferentes em células de levedura de forma automatizada. Este protocolo de transformação de levedura de alto rendimento foi projetado para 10 placas de 96 poços, mas pode ser ampliado ou reduzido conforme necessário. Para experimentos em maior escala, a chave para o sucesso é manter todas as placas e reagentes organizados.Uma vez iniciado o experimento, para evitar confusão, um manipulador automático de placas líquidas Biobot Rapid será utilizado neste protocolo. Para começar, alíquotas de cinco a dez microlitros de DNA plasmídico de uma biblioteca de plasmídeos de levedura em matriz serão distribuídas em cada poço de placas de fundo redondo com 96 poços. Coloque as placas de 96 poços descobertas dentro de uma cabine de segurança biológica ou capela de exaustão limpa durante a noite para secagem.Em seguida, inocular 200 mililitros de meio de peptona de levedura e dextrose ou meio YPD com uma linhagem de interesse em um frasco Lin Meyer de 500 mililitros com barreiras e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, diluir a linhagem de interesse até uma DO600 de 0,1 em dois litros de meio YPD para crescimento ideal. Cultivar culturas de até um litro em frascos separados de 2,8 litros com barreiras.Agite os frascos por quatro a seis horas a 30 graus Celsius até que as culturas atinjam uma DO 600 de 0,8 a 1,0. Quando a cultura de levedura atingir uma DO 600 de 0,8 a 1,0, recolha as células por centrifugação. Encha quatro tubos cónicos descartáveis de 225 mililitros com a cultura e centrifugue a 3000 RPM por cinco minutos em uma centrífuga de bancada.Descarte o sobrenadante S de cada tubo. Adicione mais cultura aos mesmos tubos e centrifugue novamente, repetindo conforme necessário até que todas as células sejam colhidas. Lave cada pellet celular em 50 mililitros de água destilada autoclavada e ressuspenda por vortexagem.Combine as células em um tubo cônico de 225 mililitros e centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante S, lave as células com 100 mililitros de solução de acetato de lítio. Centrifugue novamente a 3000 RPM durante cinco minutos.Remova o SNA e ressuspenda o pellet celular em 70 mililitros de solução de acetato de lítio. Vortexie em alta velocidade por cerca de 30 segundos até que o pellet seja completamente ressuspenso. Incube sob agitação a 30 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, adicione beta me capto etanol até atingir 0,1 molar e incube sob agitação a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, adicione dois mililitros de DNA de esperma de salmão fervido e resfriado à mistura celular. Despeje a mistura celular em uma placa de poço simples autoclavável e, em seguida, remova qualquer precipitado que se forme, pois isso pode interferir com a pipetagem posterior.Usando o biobot rapid plate, alíquota 50 microlitros da mistura celular para cada poço das quatro placas de 96 poços previamente preparadas contendo DNA plasmidial. Não misture. Incube as placas à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitação enquanto as células estão em incubação.Prepare 200 mililitros de solução de acetato de lítio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de PEG 33 a 50%, 20 mililitros de DMSO e 20 mililitros de acetato de lítio um molar. É importante que esta solução seja preparada imediatamente antes do uso.Adicione 125 microlitros da solução de acetato de lítio PEG DMSO a cada amostra. Misture bem aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes. Incube à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitação.Em seguida, submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 15 minutos em um incubador seco; não empilhe as placas após o choque térmico, centrifugue as placas utilizando adaptadores de centrífuga para acomodar as placas de 96 poços. Após a centrifugação, remova a solução de PEG invertendo as placas sobre um recipiente de resíduos. Em seguida, seque as placas invertidas em papel toalha.Para remover o líquido residual, as células permanecerão no fundo das cavidades. Lave as células adicionando 200 microlitros de meio mínimo a cada uma. Em seguida, centrifugue novamente as placas.Remova o sobrenadante invertendo o recipiente sobre um balde de resíduos e seque com papel toalha. Adicione 200 microlitros de meio mínimo a cada poço com uma placa rápida e incube a 30 graus Celsius por dois dias sem agitação. Após dois dias, pequenas colônias de células devem começar a se formar no fundo de cada poço transformado com sucesso.Para preparar o ensaio de Spatting, primeiro distribua 200 microlitros de meio mínimo baseado em OSE em cada poço de uma nova placa de fundo plano com 96 poços. Em seguida, misture cada poço da placa de transformação aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes com uma pipeta rápida.Inocule cada poço da placa de rafinose com cinco microlitros da mistura celular da placa de transformação, incube a 30 graus Celsius por um dia. No dia seguinte, pequenas colônias devem estar presentes na base de cada poço.Iremos realizar o ensaio de spotting na câmara de fluxo laminar, esterilizando um porta-pinos de 96 pontas, replicador ou frogger por meio da chama. Misture as colônias com o frogger e, em seguida, aplique as colônias em placas de meio seletivo. Após a aplicação, deixe as placas secarem na câmara de fluxo laminar por cinco a dez minutos.Incube as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias. São apresentados aqui resultados representativos de uma triagem de superexpressão de plasmídeo em levedura para identificar supressores e potenciadores da toxicidade da TDP-43. A TDP-43 é uma proteína humana implicada na patogênese da esclerose lateral amiotrófica ou doença de Lou Gehrig. A expressão da TDP-43 em células de levedura resulta em agregação e citotoxicidade.Essas placas exibem colônias com um plasmídeo de T DP 43 indutível por galactose integrado, que também foram transformadas com plasmídeos da biblioteca de expressão ORF de genes flex. As colônias aqui aparecem com coloração vermelha porque a linhagem possui, por acaso, uma mutação que resulta no acúmulo de um pigmento vermelho. A placa à esquerda contém glicose, que reprime a expressão de T DP 43 ou dos plasmídeos de genes flex.A placa à direita contém galactose, que induz a expressão de TDP 43 e das OS no plasmídeo do gene flex. A ponta de seta verde indica uma colônia transformada com um plasmídeo que suprime a toxicidade do TDP 43, conforme indicado pelo crescimento mais rápido e colônias mais densas. A ponta de seta vermelha indica uma colônia transformada com um plasmídeo que potencializa a toxicidade do TDP 43, conforme indicado pelo crescimento mais lento e colônias menos densas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transformar uma biblioteca de evitamento de DNAs plasmáticos de células.

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Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

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