Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o número de cromossomos em ovócitos na metáfase dois após manipulação experimental. Comece coletando ovócitos completamente desenvolvidos de camundongos fêmeas sexualmente maduras. Em seguida, microinjete os ovócitos com os materiais de escolha para perturbar a proteína de interesse e madure os ovócitos in vitro até a metáfase da meiose dois. A seguir, estimule a dispersão dos cromossomos no óvulo por meio do tratamento com mantro, o que resulta em um fuso monopolar.

No final, esses resultados podem retratar o estado de ploidia do óvulo por meio de imunofluorescência e microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia reprodutiva e segregação cromossômica, como compreender os mecanismos moleculares que levam à aneuploidia. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois a técnica de microinjeção é difícil de aprender, já que várias etapas são difíceis de transmitir por escrito. Injete intraperitonealmente camundongos fêmeas sexualmente maduros com cinco UIs de gonadotrofina sérica de camundongo prenhe para maximizar o número de folículos antrais isolados de cada camundongo.

Aproximadamente 48 horas após a priming com PMSG, aqueça três mililitros por camundongo de meio de coleta a 37 graus Celsius e equilibre. Um mililitro de meio de cultura por pelo menos uma hora. Prepare microgotas de cada um em uma placa de Petri e recubra com óleo mineral.

Agora coloque o recipiente com o meio de cultura no incubador e o recipiente com o meio de coleta sobre um aquecedor de lâminas. Sacrifique o camundongo, dissecque os ovários e coloque-os em um copo de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido.

Usando uma seringa de insulina de um mililitro, fixe os ovários ao recipiente e libere os folículos antrais perfurando-os várias vezes com agulhas de 27 graus unidas entre si. Sob um microscópio de dissecação, colete os complexos cumulus-células usando uma pipeta de vidro operada pela boca. Colete apenas folículos antrais grandes, e não os folículos pré-antrais menores nem os ovócitos desnudos.

Transfira os complexos para uma microgota de meio de coleta preparado com uma micropipeta ligeiramente maior que o diâmetro do ovócito. Desprenda as células do cúmulo dos complexos. Transfira os ovócitos desnudados com uma pipeta maior para uma microgota de meio de cultura.

Deixe os ovócitos recuperarem por pelo menos uma hora no incubador antes da manipulação. Prepare as pipetas de injeção puxando tubos capilares de vidro borossilicato em um puxador mecânico. Remova a câmara de meio de um lâmina com poço individual.

Para criar uma plataforma de microinjeção, coloque uma gota de cinco microlitros de meio de coleta o mais próximo possível de uma gota de 0,5 microlitro de SIR N-A-C-R-N-A ou morfólino para material de injeção de oligonucleotídeos, cubra com óleo mineral e coloque sobre a platina do microscópio. Coloque as pipetas de injeção e de contenção nos porta-pipetas e posicione-as na gota de meio de coleta. Ligue os tanques de nitrogênio conectados ao pico-injetor e à mesa antidistúrbio.

Abra a ponta da pipeta de injeção batendo suavemente nela contra a pipeta de retenção enquanto a enche com meio. Transfira cinco a 10 sítios oh do incubador para a gota de meio de coleta na plataforma. Agora, configure os parâmetros do pico injetor para um volume de injeção de cinco a 10 picolitros enquanto pressiona limpar.

Mova a agulha de injeção até a gota de material e encha-a. Retorne-a à gota de meio. Use a pipeta de contenção para capturar um ovócito e alinhar o ovócito da agulha de injeção e a pipeta de contenção ao longo do eixo x.

Com aumento maior, avance a pipeta de injeção através do ovócito, tomando cuidado para evitar o núcleo. Após perfurar a membrana plasmática, pressione "injetar", retire a agulha, solte o ovócito e repita o procedimento. Após injetar todos os ovócitos, retorne-os ao incubador para permanecerem em meio de cultura pelo tempo desejado, que normalmente varia de 12 a 24 horas.

Em seguida, lave os cítos através de várias gotas de CZB e transfira para uma microgota de CZB sob óleo, incubando por 16 horas para completar a maturação até a metáfase da meiose II. Coloque 750 microlitros de CZB contendo 100 micromolares de Mastri em um poço de uma placa de cultura orgânica que contenha água no anel externo. Agora, lave os ovos através de várias gotas de CZB com mastri e, em seguida, transfira-os para a placa de cultura orgânica e incube por uma hora.

Fixe os ovos em uma cápsula de relógio contendo paraformaldeído 2% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira os ovos para a solução bloqueadora e armazene a quatro graus Celsius até o processamento dos ovos permeabilizados por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois, lave com várias grandes volumes da solução bloqueadora.

Realize o restante do procedimento na tampa de uma placa de 96 poços protegida da luz em uma câmara umidificada. À temperatura ambiente, transfira os ovos para gotas de 25 microlitros de solução bloqueadora por 15 minutos. Em seguida, para marcar os centrômeros, transfira os ovos para uma gota de solução bloqueadora contendo Crest Antiserum em uma diluição de um para 40 e incube por pelo menos uma hora.

Em seguida, lave com três gotas de solução bloqueadora, incubando por 15 minutos em cada uma. Transfira os ovos para uma gota de solução bloqueadora contendo anticorpo conjugado com fluoro quatro e incube por uma hora. Lave duas vezes com solução bloqueadora para detectar os cromossomos.

Incubar em uma diluição de um para 5.000 de cytx green e solução bloqueadora. Montar as amostras em cinco microlitros de Vector Shield. Colocar quatro pequenas gotas de vaselina nas posições pretendidas para os cantos do lamínula para evitar a compressão dos ovos. Posicionar o lamínula e selar com esmalte. Armazenar em caixa de lâminas a quatro graus Celsius até o processamento por microscopia confocal. Durante a aquisição de imagens com objetivo de 100x, capturar passos de 0,4 micrômetro no plano Z e imagens de toda a região do metáfase II contendo os centrômeros, utilizando software de imagem como o ImageJ do NIH. Óvulos de camundongo euploide contêm 20 pares de cinetócoros, resultando em 40 pontos no total nesta projeção Z de um ovo euploide em metáfase II. O DNA é colorido em verde e os cinetócoros K são coloridos em vermelho.

As setas apontam para dois braços cromatídicos distintos, indicando sobreposição no número cinético 17 e no número 18, após o procedimento de microinjeção. Outros métodos, como Western blot, PCR em tempo real, análise da configuração do fuso e alinhamento cromossômico, e fertilização in vitro, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como a perturbação da sua proteína de interesse afeta a maturação meiótica e o potencial de desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular sítios específicos e avaliar o PLO da metáfase dois x.