Name: Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda microinjeção de oócitos e avaliação de ploidia em camundongos usando imunofluorescência e microscopia confocal. Este método permite estudar segregação cromossômica e biologia reprodutiva.

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Este trabalho foi realizado no laboratório de Richard M. Schultz &#39;s. Os autores gostariam também de agradecer Michael Lampson para conceituar o ensaio centrômero-contagem e acesso ao seu microscópio confocal. Teresa Chiang e Francesca Duncan ajudou a otimizar o ensaio centrômero da contagem. Paula Stein é apoiada por HD022681 (para RMS) e Karen Schindler é apoiada por HD055822.

1. Coleta de oócitos do mouse <ol><li> Para maximizar o número de folículos antrais isolados de cada rato, por via intraperitoneal injetar camundongos fêmeas sexualmente maduros (usamos seis semanas de idade CF-1 ratos de Harlan), com 5 UI de égua grávida gonadotrofina sérica (PMSG). </li><li> Prepare o meio de coleta (MEM / PVP) (3 ml / rato), adicionando milrinona para 2,5 mM e aqueça-a 37 ° C. A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém parada meiótica vez ovócitos são retirados os folículos. Alternativamente, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (0,2 mM) ou dibutyryl-monofosfato cíclico de adenosina (dbcAMP) (100 mg / ml) podem ser usados. Preparar o meio de cultura pela adição de glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) para 1 ml de CZB e permitir que ele atinja o equilíbrio na incubadora por pelo menos uma hora. Configure o microgotas de cada um em uma placa de Petri e sobreposição com óleo mineral. O prato CZB é colocado na incubadora, enquanto o prato MEM / PVP permanece fora de um aquecedor de slides. Outra coleção e meio de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16 da Especialidade de mídia ou Sigma) também são usados ​​rotineiramente. </li><li> Aproximadamente 48 horas após PMSG priming, sacrificar o mouse usando CO 2 sedação seguido por deslocamento cervical, dissecar os ovários e colocá-los em um vidro de relógio contendo pré-aquecido MEM / PVP + milrinona (MEM / PVP + M). </li><li> Usando uma seringa de insulina 1 ml, âncora dos ovários para o prato e liberar os folículos antrais por punção-los várias vezes com calibre 27 (ou costura) agulhas que são mantidas juntas. </li><li> Ao olhar através de um microscópio de dissecação, recolher complexos cumulus-oócitos utilizando uma boca-operado pipeta de vidro. É útil ter um microscópio com muito contraste. Como alternativa, o meio contendo o tecido e as células podem ser pipetados em uma tampa de uma placa de Petri de plástico. Apenas coletar grandes folículos antrais pequenos e não pré-antral folículos ou oócitos desnudados. Depois de coletados, os complexos de transferência para um microdrop de M + MEM / PVP que está no slide e mais quente sob óleo. </li><li> Com uma pipeta pequeno (pouco maior que o diâmetro do ovócito), pipeta cima e para baixo os complexos de separar as células cumulus. Transferir os oócitos desnudados com maior pipeta em um microdrop de CZB + milrinona (CZB + M) e coloque na incubadora. </li><li> Permitir a recuperação de oócitos por pelo menos 1 h na incubadora antes de manipulação. </li></ol> 2. Microinjeção de oócitos <ol><li> Faça pipetas de injeção puxando de vidro de borosilicato tubo capilar em um extrator mecânico. Nós usamos um Flaming-Brown micropipeta extrator (Modelo P-97) com as seguintes configurações: P = 500, Calor = 300, Pull = 150, Vel = 100 Time, = 150. </li><li> Prepare a plataforma microinjeção colocando uma queda de 5 mL de M + MEM / PVP o mais próximo possível de uma queda de 0,5 mL de material de injecção de escolha (por exemplo, siRNA, cRNA, oligonucleotídeo morfolino, etc) em um slide-câmara de um bem que tem a câmara de mídia removido. Cubra com óleo mineral e lugar no palco microscópio (Fig. 1). </li><li> Injeção local e pipetas holding para a titulares e posição para a queda de M. + MEM / PVP Ligue os tanques de nitrogênio, que estão ligados à picoinjector e anti-vibração mesa. Abra a ponta da pipeta de injeção batendo-o contra a pipeta holding, enquanto enchendo-o com o meio. Se a abertura é muito grande, o meio vai entrar e sair rapidamente ea agulha irá matar a célula. Pipetas com muito pequeno de uma abertura, muitas vezes entopem com facilidade. </li><li> Ovócitos transferência (10/05) da incubadora para o MEM / M + PVP queda na plataforma. Antes de injetar, configurar o picoinjector. Usamos os seguintes parâmetros na nossa picoinjector (Modelo PLI-100 em Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi tempo, = 3s. Isso resulta em um volume de injeção do PL 10/05. </li><li> Enquanto pressiona CLEAR, mover a agulha de injeção para a queda de material e de preenchimento. Devolvê-lo à queda média. </li><li> Use a pipeta holding para capturar um óvulo e alinhar a agulha de injeção, de oócitos e pipeta holding ao longo do eixo-x. </li><li> Sob maior ampliação, o avanço da pipeta de injeção através do óvulo com o cuidado de evitar o núcleo. Uma vez que a membrana plasmática é perfurada, pressione INJECT. Após a injeção, retire a agulha. Liberação do ovócito e repita. Uma vez que todos os ovócitos são injetados, devolvê-los à incubadora. Manter em CZB + M para quantidade desejada de tempo, desta vez é dependente do objetivo experimental (siRNA ie e knockdown morfolino (até 24 h), a superexpressão (3-12 h)). Por favor note que as incubações mais de 24 h irá comprometer a maturação meiótica. </li></ol> 3. Maturação de oócitos <ol><li> Após a incubação, lavar os oócitos através de várias gotas de CZB (meio de maturação) e transferir para um microdrop de meio de maturação sob óleo e coloque na incubadora. </li><li> 16 h para permitir t maturação completa o metáfase da meiose II. </li></ol> 4. Análise de ploidia <ol><li> Prepare CZB monastrol + (100 mM) e coloque 750 mL no poço de uma placa de cultura órgão que tem água no anel externo. </li><li> Lavar os ovos através de várias gotas de CZB + monastrol e transferi-los para a placa de cultura de órgãos. Lugar na incubadora por 1 h. </li><li> Corrigir os ovos, transferindo-os em um vidro de relógio contendo paraformaldeído 2% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Transferência para outro vidro de relógio com solução de bloqueio. Este prato pode ser armazenado a 4 ° C até ser transformado. </li><li> Transferência para solução de permeabilização (PBS + 0,3% BSA + tritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) em um vidro de relógio por 15 minutos em temperatura ambiente. Enxágüe através de vários grandes volumes de solução de bloqueio (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> O resto do procedimento é realizado na tampa de uma placa de 96 poços em câmara úmida à temperatura ambiente, que é protegido da luz. As gotas (~ mL 25) são colocados dentro do recortes circulares. Transferência de ovos para solução de bloqueio por 15 minutos. </li><li> Para centrômeros rótulo, ovos transferência para uma gota de solução de bloqueio contendo CREST anti-soro a 1:40. Incubar por pelo menos 1 h. Lave a 3 gotas de solução de bloqueio, incubação de 15 minutos em cada. </li><li> Transferência de ovos para uma gota de solução de bloqueio contendo Cy5 ou Alexa-fluor-594-conjugado anti-IgG humana (1:200) e incubar por 1 hora. Repita os passos de lavagem como acima, exceto para o último passo, incluem Sytox Green (1:5.000) na solução de bloqueio para detectar cromossomos. Montar em 5 mL de Vectashield. Para evitar esmagamento dos ovos, colocar 4 pequenas manchas de geléia de petróleo nos cantos do local onde a lamela será. Coloque uma lamela em cima e feche com unha polonês. Armazenar em uma caixa de lâminas a 4 ° C até o processamento através de microscopia confocal. </li><li> Enquanto imagem com um objetivo 100X, captura 0,4 mM passos no Z-plano e imagem de toda a região do eixo metáfase. Contar centrômeros usando software de imagem, como Image J (NIH). </li></ol> 5. Resultados representativos: Figura 2 é uma projeção Z-a partir de um ovo euplóide. Na metáfase da MII, os ovos do mouse euplóide contêm 20 pares de cromossomos e, portanto, tem 40 centrômeros. Ocasionalmente, os cromossomos não se espalhado, apesar do tratamento monastrol. Esta situação torna difícil a contagem confiável centrômeros e, portanto, não incluem estes ovos em nossas análises. Ocasionalmente, pode ser um desafio para determinar se um CREST-imunorreativa "spot" é 1 ou 2 centrômeros. Usando programas como o Image J é útil porque pode-se analisar cada Z-seção, enquanto cuidadosamente observando a orientação dos cromossomos, o número de seções em que um "spot" é detectado ea intensidade de pixels de "spots" tem. Dependendo de onde o fuso meiótico é posicionado em relação ao corpo polar, as regiões do DNA podem se sobrepor e estas amostras não devem ser incluídos na análise. Manipulação, in vivo ovularam ovos de ratos jovens reprodutivamente têm baixas taxas de aneuploidia (~ 1-2%). No entanto, por razões não compreendidas microinjeção, e nos procedimentos de maturação in vitro pode aumentar essa taxa para cima de 10%. Portanto, é fundamental que oócitos injetados são incluídos em qualquer estudo microinjeção. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Prato microinjeção configurar. Um slide de câmara com 5 gotas mL de MEM / PVP + M cai logo acima 0.5μl de solução injectável. Cubra com óleo mineral. Neste exemplo, existem 3 gotas por 3 soluções diferentes de injeção eo slide está sentado no palco de um microscópio. À esquerda é a agulha microinjeção e para a direita é a pipeta holding. Observe que há um reflexo do porta-agulhas. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultados ploidia. A Z-projeção de um ovo euplóide II metáfase. DNA é colorida em verde e cinetócoros são coloridos em vermelho. As setas apontam para duas distintas braços cromátides indicando que cinetócoros (# 17 e # 18) se sobrepõem. Ovos do mouse euplóide contêm 20 pares cinetocoro (40 total "spots"). Um ovo aneuplóides conteria qualquer variação neste número. Se este procedimento foram realizados em oócitos metáfase MI, haveria 40 pares cinetocoro (80 total "spots"). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabela 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Receita para o meio de coleta e microinjeção (MEM / PVP + M). Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tabela 2 "/&gt; Tabela 2. Receita para o meio CZB. Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C.

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
<li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li>
<li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).</li>
<li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li>
<li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li>
<li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li>
<li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microinjeção de ovócitos é um método poderoso para estudar mecanismos que regulam a maturação meiótica 10,11, 12, 13. Este método oferece um modo econômico para testar hipóteses antes de fazer um grande investimento no desenvolvimento de modelos de ratos transgênicos e orientada. Coleta de oócitos e técnicas de microinjeção exigem mais tempo para dominar do que os procedimentos típicos de biologia celular. Obstáculos específicos com a coleta de vezes incluem controlar a pipeta na boca, puxando a pipeta de vidro tamanho adequado para a coleta e remoção das células somáticas e aumentando a velocidade de coleta para minimizar o tempo em que os oócitos estão fora da incubadora. Recomendamos a prática muitas vezes antes de fazer experimentos. Transferência entre oócitos microgotas, mantendo o mesmo número de células é uma ótima maneira de tornar-se confortável com este método. A morte celular ocorre comumente enquanto aprende microinjeção. Isso poderia ocorrer por uma série de razões, incluindo a injecção de demasiado grande de um volume de material (ou seja, a abertura de agulha é muito grande), atingindo o núcleo com a agulha de injeção, piercing no lado oposto do oócito ou que o material injetado é tóxico para o ovócito. Praticando com injeção de tampão em oócitos até a sua taxa de sobrevivência é, pelo menos, 50% é a chave para dominar esta técnica. Se oócitos maduros não é provável que a milrinona não foi diluída o suficiente. Recomendamos enxaguar os oócitos através de muitos grandes gotas de milrinona livre CZB antes da maturação. A microinjeção seguintes ploidia análise é um dos muitos testes para avaliar a maturação meiótica. Análises de rotina que usamos no laboratório incluem o monitoramento da cinética pelo qual o progresso através de oócitos meiose, imunofluorescência para analisar a formação do fuso e alinhamento de cromossomos e ativação ovo ou a fertilização in vitro para avaliar as conseqüências do desenvolvimento da manipulação de oócitos 14,15, 16, 17.

Tabela de reagentes específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Milrinona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Ressuspender em DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Apenas uso de embriões testados, estéril filtrado </td></tr><tr><td> CREST autosoroterapia </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Ressuspender em DMSO, de 100 mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela de equipamentos específicos: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome do Equipamento </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Bocal </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vidro de relógio </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 milímetros Petri Dish </td><td> Falcão </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur de vidro pipetas </td><td> Fisher científica </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lado mais quente </td><td> Fisher científica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Deslize Câmara </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação capilar </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipeta Puller </td><td> Flaming-Brown micropipeta extrator </td><td></td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Micromanipuladores </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modelo de PLI-100 </td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> CO 2 tanques </td><td></td><td></td><td> Para incubadora </td></tr><tr><td> N2 tanque </td><td></td><td></td><td> Para a tabela e injetor </td></tr><tr><td> Anti-vibração tabela </td><td> Produção Técnica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Incubadora </td><td></td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Pipetas segurando </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Ferramentas de dissecção </td><td> Multa ferramentas da ciência </td><td></td><td> Qualquer modelo padrão </td></tr><tr><td> Câmara úmida </td><td></td><td></td><td> Usamos tupperware </td></tr><tr><td> Tampa da placa de 96 poços </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de microscópio </td><td> Fisher científica </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> Thomas científica </td><td> 6663-F10 </td><td> Espessura pode variar para microscópios especial </td></tr><tr><td> Centro de placa de cultura bem órgãos </td><td> Fisher científica </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15 milímetros </td></tr></tbody></table>

avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Erros na segregação cromossômica levar a células aneuplóides. Em células somáticas, aneuploidia é associado com o câncer, mas nos gametas, aneuploidia leva à infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Gametas haplóides por meio de formulário específico da espécie programas de desenvolvimento que são acoplados a meiose. A primeira divisão meiótica (MI) é exclusivo para a meiose porque cromátides irmãs permanecem ligados enquanto cromossomos homólogos são separados. Por razões ainda não totalmente compreendidas, esta divisão reducional é propenso a erros e é mais comumente a fonte de aneuploidia do que erros na meiose II (MII) ou de erros na meiose masculina 1,2. Nos mamíferos, os oócitos prisão em prófase da MI com um grande, vesícula intacta germinal (GV; núcleo) e só retomar a meiose quando recebem estímulos ovulatórios. Uma vez que retoma a meiose, oócitos MI completo e passar por uma divisão celular assimétrica, prendendo novamente na metáfase da MII. Ovos não completa MII até que sejam fertilizados por esperma. Oócitos também pode sofrer maturação meiótica utilizando estabelecidos em condições de cultura in vitro 3. Porque a geração de mutantes de camundongos transgênicos e gene-alvo é caro e pode demorar longos períodos de tempo, manipulação de gametas femininos in vitro é uma estratégia mais econômica e economia de tempo. Aqui, descrevemos métodos para isolar prófase detido oócitos de camundongos e por microinjeção. Qualquer material de escolha pode ser introduzido no óvulo, mas porque meiotically-oócitos competentes são transcricionalmente silenciosos cRNA 4,5, e não DNA, deve ser injetado para estudos de expressão ectópica. Para avaliar a ploidia, descrevemos nossas condições para maturação in vitro de oócitos MII aos ovos. Historicamente, o cromossomo espalhando técnicas são usadas para contar o número de cromossomos 6. Este método é tecnicamente desafiadora e está limitado a apenas identificar hyperploidies. Aqui, descrevemos um método para determinar hipo e hyperploidies usando ovos intactos 7-8. Este método usa monastrol, um inibidor cinesina-5, que entra em colapso o eixo bipolar em um eixo monopolar cromossomos 9 separando assim de tal forma que cinetócoros individuais podem ser facilmente detectadas e contadas usando um soro anti-CREST auto-imunes. Porque este método é realizado em ovos intactos, cromossomos não são perdidos devido a erro do operador.

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Erros na segregação cromossômica levam a células aneuploides. Em células somáticas, a aneuploidia está associada ao câncer, mas em gametas, a aneuploidia leva a ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o número de cromossomos em ovócitos na metáfase dois após manipulação experimental. Comece coletando ovócitos completamente desenvolvidos de camundongos fêmeas sexualmente maduras. Em seguida, microinjete os ovócitos com os materiais de escolha para perturbar a proteína de interesse e madure os ovócitos in vitro até a metáfase da meiose dois. A seguir, estimule a dispersão dos cromossomos no óvulo por meio do tratamento com mantro, o que resulta em um fuso monopolar.No final, esses resultados podem retratar o estado de ploidia do óvulo por meio de imunofluorescência e microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia reprodutiva e segregação cromossômica, como compreender os mecanismos moleculares que levam à aneuploidia. Uma demonstração visual deste método é essencial, pois a técnica de microinjeção é difícil de aprender, já que várias etapas são difíceis de transmitir por escrito. Injete intraperitonealmente camundongos fêmeas sexualmente maduros com cinco UIs de gonadotrofina sérica de camundongo prenhe para maximizar o número de folículos antrais isolados de cada camundongo.Aproximadamente 48 horas após a priming com PMSG, aqueça três mililitros por camundongo de meio de coleta a 37 graus Celsius e equilibre. Um mililitro de meio de cultura por pelo menos uma hora. Prepare microgotas de cada um em uma placa de Petri e recubra com óleo mineral.Agora coloque o recipiente com o meio de cultura no incubador e o recipiente com o meio de coleta sobre um aquecedor de lâminas. Sacrifique o camundongo, dissecque os ovários e coloque-os em um copo de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido.Usando uma seringa de insulina de um mililitro, fixe os ovários ao recipiente e libere os folículos antrais perfurando-os várias vezes com agulhas de 27 graus unidas entre si. Sob um microscópio de dissecação, colete os complexos cumulus-células usando uma pipeta de vidro operada pela boca. Colete apenas folículos antrais grandes, e não os folículos pré-antrais menores nem os ovócitos desnudos.Transfira os complexos para uma microgota de meio de coleta preparado com uma micropipeta ligeiramente maior que o diâmetro do ovócito. Desprenda as células do cúmulo dos complexos. Transfira os ovócitos desnudados com uma pipeta maior para uma microgota de meio de cultura.Deixe os ovócitos recuperarem por pelo menos uma hora no incubador antes da manipulação. Prepare as pipetas de injeção puxando tubos capilares de vidro borossilicato em um puxador mecânico. Remova a câmara de meio de um lâmina com poço individual.Para criar uma plataforma de microinjeção, coloque uma gota de cinco microlitros de meio de coleta o mais próximo possível de uma gota de 0,5 microlitro de SIR N-A-C-R-N-A ou morfólino para material de injeção de oligonucleotídeos, cubra com óleo mineral e coloque sobre a platina do microscópio. Coloque as pipetas de injeção e de contenção nos porta-pipetas e posicione-as na gota de meio de coleta. Ligue os tanques de nitrogênio conectados ao pico-injetor e à mesa antidistúrbio.Abra a ponta da pipeta de injeção batendo suavemente nela contra a pipeta de retenção enquanto a enche com meio. Transfira cinco a 10 sítios oh do incubador para a gota de meio de coleta na plataforma. Agora, configure os parâmetros do pico injetor para um volume de injeção de cinco a 10 picolitros enquanto pressiona limpar.Mova a agulha de injeção até a gota de material e encha-a. Retorne-a à gota de meio. Use a pipeta de contenção para capturar um ovócito e alinhar o ovócito da agulha de injeção e a pipeta de contenção ao longo do eixo x.Com aumento maior, avance a pipeta de injeção através do ovócito, tomando cuidado para evitar o núcleo. Após perfurar a membrana plasmática, pressione "injetar", retire a agulha, solte o ovócito e repita o procedimento. Após injetar todos os ovócitos, retorne-os ao incubador para permanecerem em meio de cultura pelo tempo desejado, que normalmente varia de 12 a 24 horas.Em seguida, lave os cítos através de várias gotas de CZB e transfira para uma microgota de CZB sob óleo, incubando por 16 horas para completar a maturação até a metáfase da meiose II. Coloque 750 microlitros de CZB contendo 100 micromolares de Mastri em um poço de uma placa de cultura orgânica que contenha água no anel externo. Agora, lave os ovos através de várias gotas de CZB com mastri e, em seguida, transfira-os para a placa de cultura orgânica e incube por uma hora.Fixe os ovos em uma cápsula de relógio contendo paraformaldeído 2% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira os ovos para a solução bloqueadora e armazene a quatro graus Celsius até o processamento dos ovos permeabilizados por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois, lave com várias grandes volumes da solução bloqueadora.Realize o restante do procedimento na tampa de uma placa de 96 poços protegida da luz em uma câmara umidificada. À temperatura ambiente, transfira os ovos para gotas de 25 microlitros de solução bloqueadora por 15 minutos. Em seguida, para marcar os centrômeros, transfira os ovos para uma gota de solução bloqueadora contendo Crest Antiserum em uma diluição de um para 40 e incube por pelo menos uma hora.Em seguida, lave com três gotas de solução bloqueadora, incubando por 15 minutos em cada uma. Transfira os ovos para uma gota de solução bloqueadora contendo anticorpo conjugado com fluoro quatro e incube por uma hora. Lave duas vezes com solução bloqueadora para detectar os cromossomos.Incubar em uma diluição de um para 5.000 de cytx green e solução bloqueadora. Montar as amostras em cinco microlitros de Vector Shield. Colocar quatro pequenas gotas de vaselina nas posições pretendidas para os cantos do lamínula para evitar a compressão dos ovos. Posicionar o lamínula e selar com esmalte. Armazenar em caixa de lâminas a quatro graus Celsius até o processamento por microscopia confocal. Durante a aquisição de imagens com objetivo de 100x, capturar passos de 0,4 micrômetro no plano Z e imagens de toda a região do metáfase II contendo os centrômeros, utilizando software de imagem como o ImageJ do NIH. Óvulos de camundongo euploide contêm 20 pares de cinetócoros, resultando em 40 pontos no total nesta projeção Z de um ovo euploide em metáfase II. O DNA é colorido em verde e os cinetócoros K são coloridos em vermelho.As setas apontam para dois braços cromatídicos distintos, indicando sobreposição no número cinético 17 e no número 18, após o procedimento de microinjeção. Outros métodos, como Western blot, PCR em tempo real, análise da configuração do fuso e alinhamento cromossômico, e fertilização in vitro, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como como a perturbação da sua proteína de interesse afeta a maturação meiótica e o potencial de desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular sítios específicos e avaliar o PLO da metáfase dois x.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).

Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Nós fornecemos um esboço do protocolo clínico para a avaliação não invasora da maturidade humana do ovo usando a microscopia de luz polarizada.

Avaliação da maturidade do ovo humano e sua aplicação clínica

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Este protocolo fornece uma estrutura experimental para documentar o impacto físico do citoesqueleto na forma nuclear e nas organelas sem membrana interna no sistema oócito de camundongos. A estrutura pode ser adaptada para uso em outros tipos de células e contextos.

Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Aprenda microinjeção de oócitos e avaliação de ploidia em camundongos usando imunofluorescência e microscopia confocal. Este método permite estudar segregação cromossômica e biologia reprodutiva.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

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