Procedimento de punção cecal Ligadura

Olá, meu nome é Miguel Toscano, do laboratório da Dra. Dena, do departamento de Microbiologia e Hematologia da Universidade Temple. Hoje vamos mostrar como estabelecer o modelo de infecção e punção do iCal na linhagem de camundongos C57 Black 6. Utilizamos este modelo em nosso laboratório para simular a sepse humana.

Basicamente, este modelo consiste em uma punção do ceco que permite a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para produzir uma sepse polimicrobiana, gerando assim uma resposta imune exacerbada. Neste modelo, muitos órgãos e diferentes tipos celulares são irreversivelmente danificados, o que, no final, pode causar a morte do animal.

Então vamos começar. Anestesiar o camundongo. O primeiro passo é anestesiar o animal por meio de injeção intraperitoneal.

Uma mistura, na proporção de um para um, de Ketomine e xilazina. Para evitar ser mordido pelo camundongo e para não machucá-lo, devemos segurar o camundongo pela cauda com uma das mãos. Com a outra mão, pressionamos suas costas contra o chão.

Em seguida, podemos segurar o camundongo pela parte posterior da cabeça e virar o animal de costas para expor o abdômen. Com uma seringa de insulina de 29 graus, injetamos 20 a 30 microlitros da anestesia na cavidade peritoneal. Para preparar o camundongo para o procedimento, segure a parte posterior do animal e depile o abdômen pressionando a cauda e/ou a perna do camundongo.

Verificamos que o camundongo não é sensível à dor. Em seguida, o abdômen é desinfetado, primeiramente esfregando com solução de Betadine, seguido por limpeza com um lenço de álcool isopropílico por pelo menos um minuto. Para praticar a laparotomia, levantamos a pele no meio do abdômen com a pinça e fazemos uma pequena incisão de aproximadamente um centímetro de comprimento.

Em seguida, levante o períneo e realize outro pequeno corte para expor a cavidade peritoneal. Usando pinças curvas, segure a membrana peritoneal. Identifique e exponha o ceco, passando-o através da membrana peritoneal.

Coloque-o sobre o abdômen. Agora é o momento da ligadura. Este é um fator importante.

Para determinar a gravidade do modelo, podemos modular a severidade do procedimento. Com a extensão da ligadura, os camundongos desenvolverão uma sepse mais leve. Se a ligadura for feita mais próxima à extremidade do ceco, ocorrerá uma sepse de grau moderado se realizada no meio e uma sepse grave se feita mais próxima à válvula íleo-cecal; a severidade do procedimento será refletida pelo percentual de mortalidade.

Nunca ligue a válvula íleo-cecal. Agora realize a ligadura utilizando fio de seda com um nó duplo para apertar bem, fazendo a punção. Segure o ceco e faça cuidadosamente uma punção próxima ao local da ligadura e faça outra punção mais perto da extremidade do ceco. A membrana do ceco é macia e será perfurada com muita facilidade.

Utilizando agulhas com diferentes espessuras e fazendo uma ou duas perfurações, também é possível modular a gravidade do modelo. O método de punção simples ou dupla mostrado aqui é uma técnica alternativa à punção clássica através e através. A vantagem do uso do método de punção simples ou dupla é que é possível controlar melhor a quantidade de fezes extrudidas quando o ceco é comprimido.

Segure o ceco com dois dedos e extrude suavemente o ceco para retirar uma quantidade muito pequena de fezes. Fechando a laparotomia, então levante o peritônio e coloque cuidadosamente o ceco de volta na cavidade peritoneal.

Tenha extrema cautela para evitar perfurações acidentais do ceco. Com a pinça, recomenda-se o uso de pinças maiores. Agora é o momento de fechar a cavidade peritoneal. Utilizando sutura de seda, é muito importante garantir que o fechamento seja bem realizado.

Iniciamos de um lado da ferida, onde fazemos um nó. Continuamos realizando a sutura até o outro lado, passando a seda sob o laço da punção anterior. Para fechar a pele, podemos usar clipes de ferida de Mitchell ou clipes reflexo, utilizando a ferramenta adequada para fechar os clipes.

Coloque quantos clipes forem necessários para garantir que o ferimento esteja fechado. Reanime os camundongos injetando subcutaneamente um mililitro de solução salina pré-aquecida. Usando uma agulha de 25 graus, esta medida de ressuscitação hídrica induzirá a fase hiperdinâmica da sepse, concluindo o procedimento.

Coloque o camundongo sob uma luz de aquecimento por infravermelho ou, alternativamente, sobre uma almofada aquecida até que o camundongo se recupere da anestesia. Forneça alimento e água no fundo da gaiola e supervise os animais a cada oito a 12 horas em busca de sinais de doença. Injete buprenorfina por via subcutânea para analgesia pós-operatória.

Um analgésico diferente para uso é o Tramadol. Sinais de sepse, sintomas de sepse são febre, letargia, pelo eriçado, ereção, diarreia, agrupamento e mal-estar. Animais muito doentes apresentam uma diminuição severa da temperatura corporal e se movem muito pouco para evitar sofrimento.

Eles devem ser eutanasiados nesta fase H. Assim, é assim que realizamos o modelo de ligadura em foice e punção. Esperamos que você tenha apreciado a demonstração deste procedimento e que a tenha considerado muito útil para sua pesquisa antes de iniciar seu estudo com animais. Recomendamos fortemente que você utilize cérebros velhos ou não utilizados para treinamento, a fim de estabelecer o grau apropriado de severidade para seus experimentos, modificando o comprimento da ligadura, a espessura da agulha e o número de punções.

Com isso dito, adeus.