Name: Procedimento de punção cecal Ligadura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda o modelo de ligadura e punção cecal em camundongos C57BL/6 para estudar sepse polimicrobiana. Este método permite investigar respostas imunes exacerbadas e danos orgânicos em pesquisa de sepse humana.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento de Saúde da Pensilvânia. Dr. Miguel Garcia Toscano foi um pós-doutorado na Universidade de Temple, financiado pela Fundação Martin Alfonso Escudero durante este estudo. Queremos agradecer Iliya Yordanov e Kevin Kotredes para a confecção do vídeo.

1. Ligadura cecal e punção como um modelo de camundongo para Sepsis Humanos Para este procedimento C57BL / 6 ratos (7-9 semanas de idade) são utilizados. <ol><li> Anestesiar o rato pela injeção intraperitoneal de uma solução de 1:1 de quetamina (75mg/kg) e xilazina (15mg/kg). Como referência, injetar 30 mL da solução de 1:01 em um rato pesando 20 gramas. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados com isoflurano inalado através de um vaporizador anestésico. </li><li> Raspar o abdome do rato e desinfectar área pela solução betadine primeira aplicação seguido por limpeza com uma gaze com álcool 70% (número 1 na seqüência imagem abaixo). Clorexidina pode ser utilizada como um anti-séptico alternativa. Opcional: uma cortina estéril pode ser usada para manter a área limpa. </li><li> Sob condições assépticas, uma prática 1 a 2 cm laparotomia mediana e expor o ceco com intestino adjacente (2 e 3). </li><li> O ceco é firmemente ligada com um fio de seda 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) em sua base abaixo da válvula íleo-cecal, e é perfurado uma ou duas vezes com uma agulha de calibre 19 (4 e 5) na mesma lado do ceco. Por favor, note que o comprimento do ceco ligada definido como a distância entre a extremidade distal do ceco ao ponto de ligadura vai determinar o grau de severidade. A distância de&gt; um centímetro produz sepse de alta qualidade, enquanto uma distância de 1 cm ≤ produz meio-de-baixo grau sepse. Observe também que utilizando o método de perfuração cecal mostrado aqui é diferente do padrão através de e através da técnica de punção (introdução de uma agulha através do ceco). Ambos os métodos de produzir o resultado confiável sepse mesmo. No entanto, uma desvantagem da técnica de ponta a ponta é que não facilita controlar a quantidade de fezes extrudados quando o ceco é espremido. </li><li> O ceco é, então, pressiona suavemente para expulsar uma pequena quantidade de fezes dos locais de perfuração (6). O ceco é retornado para a cavidade peritoneal e peritônio é fechado com 6,0 suturas de seda. (7). </li><li> A pele é fechada com grampos Reflex 7mm (RS-9258, Instrumentos Cirúrgicos Roboz) ou grampos de sutura Michel (7 mm, RS-9270) (8). </li><li> Ressuscitar ratos através da injeção por via subcutânea 1 ml de solução pré-aquecido 0,9% com uma agulha de 25G. Esta medida fluidoterapia irá induzir a fase hiperdinâmica da sepse. Este passo crítico é descrito mais adiante na seção de discussão. </li><li> Opcional: Inject por via subcutânea buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) ou tramadol (20mg/kg peso corporal) para analgesia pós-operatória. Ser advertidos de que estes opiáceos pode suprimir a respiração e locomoção e estes efeitos podem ser interpretados como sinais de sepsis. </li><li> Os animais são colocados temporariamente em uma almofada de aquecimento ou, alternativamente, voltou imediatamente para uma gaiola com a exposição a uma lâmpada de aquecimento infravermelho de 150W, até que se recuperar da anestesia. O tempo de recuperação é de 30 min a 1 hora. </li><li> Fornecer acesso livre à comida e água (hidrogel) colocado no fundo da gaiola. </li><li> Ratos são monitorados a cada 12 horas para a sobrevivência de uma a duas semanas ou eutanásia em momentos diferentes para análise de parâmetros diferentes. </li></ol> Como controle para o projeto experimental, os animais sham iria seguir a técnica de laparotomia sem ligadura e punção. Seis a 12 horas após o procedimento cirúrgico os ratos se tornarão letárgicos e desenvolver febre, piloereção, diarréia, encolhendo-se, mal-estar e, todos os sintomas de sepse. Camundongos com sepse grave muito mal consegue se mover antes da morte e exibem uma diminuição drástica da temperatura corporal. Neste ratos etapa deve ser sacrificados para evitar a dor e sofrimento prolongado. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig0.jpg" alt="Figura 0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 0"> 2. Mais comuns Parâmetros Analisados Para avaliar o resultado do procedimento, diversos parâmetros podem ser analisados ​​em órgãos, extratos celulares ou fluidos corporais. Amostras podem ser coletadas em momentos diferentes de 3 horas para uma semana após o procedimento cirúrgico. <ol><li> Sobrevivência camundongos. </li><li> Citocinas e quimiocinas na cavidade, soro peritoneal e extratos de órgãos. <ol><li> Interleucina-6: Produzido e lançado por monócitos, células dendríticas, macrófagos, células B, células T, granulócitos, mastócitos e tipos de células muito mais. Ela desempenha um papel importante na reação de fase aguda e inflamação. </li><li> Fator de necrose tumoral α: Pleiotrophic citocina que desempenha um papel central na inflamação e apoptose. Produzido por monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e fibroblastos. </li><li> nterleukin-1β: Produzido por monócitos, células NK, células dendríticas, células B e células T. Induz febre e síntese de proteínas de fase aguda. </li><li> Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime antigen apresentação e respostas Th1 pró-inflamatórias. </li><li> Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime a apresentação de antígenos e respostas Th1 pró-inflamatórias. </li><li> Monócitos quimiotáticos proteína-1 (também conhecido como CCL2): Recrutas monócitos, células T de memória e células dendríticas aos locais de lesão tecidual e infecção. </li><li> KC (CXCL1): Produzido por macrófagos e células endoteliais. KC rato é um atrativo de neutrófilos potente e ativador. </li><li> RANTES: A quimiotática de monócitos. Pode chemoattract CD4 unstimulated + / CD45RO + células de memória T CD4 e estimulado + e CD8 + T com nd ve e fenótipos de memória. </li><li> Interferon-γ: Secretada por células Th1, células T citotóxicas, células dendríticas e natural killer (NK). Aumenta a apresentação de antígenos e atividade lítica de macrófagos e suprime a atividade das células Th2. Promove a adesão e de ligação necessários para a migração de leucócitos e promove a atividade das células NK. </li><li> Alta mobilidade do grupo B-1 de proteínas: No monócitos é um fator nuclear kappa B ativador pela ligação ao receptor celular para produtos de glicação antecedência final (RAGE), ativando a liberação de mediadores pró-inflamatórios na fase tardia da sepse. </li></ol></li><li> Determinação mieloperoxidase em órgãos como medida de infiltração de neutrófilos. Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima peroxidase presente em abundância na maioria dos granulócitos neutrófilos. É uma proteína lisossomal armazenado em grânulos azurófilos dos neutrófilos. MPO tem um pigmento heme, que faz com que sua cor verde nas secreções ricas em neutrófilos, como o pus e algumas formas de muco. </li><li> Bactérias carga em órgãos e sangue, medida como o número de unidades formadoras de colônia por mililitro. </li></ol> 3. Resultados representante O procedimento CLP foi realizada inicialmente em camundongos C57BL / 6. Testamos vários parâmetros para modular a gravidade da sepse, alterando o comprimento da ligação e da espessura da agulha, conforme mostrado nas Figuras 1 e 2. Entre esses dois fatores, o comprimento da ligadura parece ser mais eficaz do que a espessura da agulha para alterar a sobrevivência por cento. Conforme mostrado na Figura 1, aumentando o comprimento da ligação por mais de um centímetro provoca um aumento da mortalidade de 100% em comparação com camundongos com uma ligadura de ≤ 1cm. Aumentando a espessura da agulha também diminuiu a sobrevivência por cento de 100% (com uma agulha 22G) para 55% (usando uma agulha 19G) com dois furos. Também testamos o efeito do CLP em camundongos C57BL / 6 e 129SvJ ratos para determinar se diferentes linhagens de camundongos mostrar susceptibilidade semelhantes ou distintas para CLP-induzida a sepse. A Figura 3 mostra que, nas mesmas condições, os ratos foram 129SvJ mais suscetíveis à infecção do que C57BL / 6, indicado por uma porcentagem de mortalidade aumentou. <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Efeito do comprimento da ligadura do ceco na sobrevivência animal. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois diferentes comprimentos de ligadura cecal. Este único parâmetro afeta drasticamente a sobrevida do animal desde que todos os animais do grupo com uma área de ligação mais do que 1 cm morreu em menos de três dias quando comparados com um grupo de animais com uma área de ligadura de 1 cm aprox. (N = 8). <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Influência da espessura da agulha sobre a sobrevivência. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois tamanhos diferentes da agulha, 19G e 22G. Camundongos com o ceco perfurado com uma agulha de 19G mostrou uma sobrevida de 55-60%. Em contraste, os ratos com o ceco perfurado com uma agulha de 22G mostrou 100% de sobrevivência, embora eles experimentaram sintomas típicos de inflamação durante os primeiros 3-4 dias, o que desapareceu depois de 4 dias (n = 8). <img src="/files/ftp_upload/2860/2860fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Comparação da susceptibilidade a sepse entre duas linhagens de camundongos diferentes. O modelo CLP foi realizada em 129SvJ e C57BL / 6, nas mesmas condições. No final do período de avaliação por cento a sobrevivência da cepa 129SvJ foi de 25% menos do que na cepa C57BL / 6, indicando uma maior susceptibilidade à inflamação induzida por infecção polimicrobiana. (N = 6).

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<li>Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+and+buprenorphine+on+select+immunologic+factors+in+a+cecal+ligation+and+puncture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model.</a> Shock. 34, 250-260 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.<br /Experimentos em animais&gt; foram realizados de acordo com o Instituto Nacional do Guia de Saúde para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e aprovado pelo comitê de cuidados com animais e uso da Temple University.

Aqui nós mostramos em detalhes como realizar o modelo CLP em camundongos e modular o grau de severidade. Comparado a outros modelos animais de sepse, CLP pode ser realizado em qualquer tensão do rato de diferentes idades e sexo. É um procedimento relativamente fácil e barato cirúrgico. Neste modelo, o grau de gravidade tem um impacto direto sobre a porcentagem de sobrevivência. O comprimento da ligação, a espessura da agulha e do número de punções são parâmetros que podem ser controlados par...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Ketaset </td><td> 0856-2013-01 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> AnaSed </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa de insulina 29G </td><td> Exel </td><td> 26028 </td><td></td></tr><tr><td> De seda de sutura, 6-0 PROLENE </td><td> Ethicon </td><td> 8680G </td><td></td></tr><tr><td> Agulha 19G e 25G </td><td> BD </td><td> 305186 </td><td></td></tr><tr><td> Barbeador </td><td> Abastecimento geral </td><td> Abastecimento geral </td><td></td></tr><tr><td> Aquecimento da lâmpada infravermelha </td><td> Abastecimento geral </td><td> Abastecimento geral </td><td></td></tr><tr><td> Michel ferida clipes de 7 milímetros </td><td> Roboz Cirúrgica Instr </td><td> RS-9270 </td><td></td></tr><tr><td> Máscara de ouvido loop </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-130-4181 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Roboz Cirúrgica Instr </td><td> RS-6702 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine solução </td><td> VWR </td><td> 63410-992 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça cirúrgica </td><td> Roboz Cirúrgica Instr </td><td> RS-5135 </td><td></td></tr><tr><td> Compressa embebida em álcool isopropílico 70% </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-031-350 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Bedford Labs </td><td> 55390-100-10 </td><td></td></tr><tr><td> Tramadol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 42965 </td><td></td></tr></tbody></table>

procedimento de punção cecal ligadura

Cecal Ligation Puncture Procedure

Sepse humana é caracterizada por um conjunto de reações sistêmicas em resposta à infecção intensivo e massivo que não conseguiu ser contido localmente pelo anfitrião. Atualmente, ocupa o sepse entre os dez maiores causas de mortalidade nas unidades de terapia intensiva EUA 1. Durante a sepse, há duas fases estabelecidas hemodinâmicas que podem se sobrepor. A fase inicial (hiperdinâmico) é definido como uma produção maciça de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio por macrófagos e neutrófilos, que afeta a permeabilidade vascular (levando à hipotensão), a função cardíaca e induz a alterações metabólicas, culminando com necrose de tecidos e falência de órgãos. Consequentemente, a causa mais comum de mortalidade é lesão renal aguda. A segunda fase (hipodinâmicos) é um processo anti-inflamatório envolvendo apresentação de antígenos alterados monócitos, diminuição da proliferação de linfócitos e função e aumento da apoptose. Este estado conhecido como imunossupressão ou depressão imunológica aumenta consideravelmente o risco de infecções nocosomial e, finalmente, a morte. Os mecanismos destes processos fisiopatológicos não estão bem caracterizados. Porque ambas as fases da sepse pode causar danos irreversíveis e irreparáveis, é essencial para determinar o estado imunológico e fisiológicas do paciente. Esta é a principal razão pela qual muitas drogas terapêuticas falharam. A mesma droga dada em diferentes estágios de sepse pode ser terapêutico ou de outra forma prejudicial ou não têm nenhum efeito 2,3. Para entender sepse em vários níveis é fundamental para ter um modelo animal adequado e abrangente, que reproduz o curso clínico da doença. É importante caracterizar os mecanismos fisiopatológicos que ocorrem durante a sepse e controlar as condições do modelo para testar potenciais agentes terapêuticos. Para estudar a etiologia da sepse humana pesquisadores desenvolveram diferentes modelos animais. O modelo mais utilizado é a ligadura cecal clínicos e punção (CLP). O modelo CLP consiste na perfuração do ceco permitindo a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para gerar uma resposta exacerbada imune induzida por infecção polimicrobiana. Este modelo cumpre a condição humana que é clinicamente relevante. Como em humanos, ratos que passam por CLP com reposição volêmica mostram a fase (início), primeiro hiperdinâmica que com o tempo progride para a fase (final) segundo hipodinâmicos. Além disso, o perfil de citocinas é semelhante ao observado na sepse humana, onde há aumento da apoptose de linfócitos (revisto em 4,5). Devido aos mecanismos de múltiplas e sobrepostas envolvidos na sepse, os pesquisadores precisam de um modelo adequado de gravidade da sepse controlada a fim de obter resultados consistentes e reprodutíveis.

O modelo do rato de ligadura e punção cecal como uma ferramenta valiosa para o estudo da sepse humana.

Procedimento de punção cecal Ligadura

A sepse humana é caracterizada por um conjunto de reações sistêmicas em resposta a uma infecção intensiva e massiva que não foi contida localmente por...

Olá, meu nome é Miguel Toscano, do laboratório da Dra. Dena, do departamento de Microbiologia e Hematologia da Universidade Temple. Hoje vamos mostrar como montar o modelo de infecção e punção iCal na linhagem de camundongos C57 Black/6. Utilizamos este modelo em nosso laboratório para simular a sepse humana.Basicamente, este modelo consiste em uma punção do ceco que permite a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para produzir uma sepse polimicrobiana, gerando assim uma resposta imune exacerbada. Neste modelo, muitos órgãos e diferentes tipos celulares são irreversivelmente danificados, o que, no final, pode causar a morte do animal.Então vamos começar. Anestesiar o camundongo. O primeiro passo é anestesiar o animal por injeção intraperitoneal.Uma mistura, na proporção de um para um, de Ketomine e xilazina. Para evitar ser mordido pelo camundongo e para não machucá-lo, devemos segurar o camundongo pela cauda com uma das mãos. Com a outra mão, pressionamos suas costas contra o chão.Em seguida, podemos segurar o camundongo pela parte posterior da cabeça e virar o animal de costas para expor o abdômen. Com uma seringa de insulina de 29 gauge, injetamos de 20 a 30 microli

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Descrevemos um novo método cirúrgico para cateterizar "alças intestinais" dentro do íleo de ovelhas. Uma vez que os animais têm recuperado de uma cirurgia e que tenha limpado antibióticos e analgésicos, múltiplos tratamentos podem ser depositados diretamente em loops através dos cateteres.

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Colon ascendens Stent peritonite (CASP) - um modelo padronizado para sepse abdominal polimicrobianas

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Aprenda o modelo de ligadura e punção cecal em camundongos C57BL/6 para estudar sepse polimicrobiana. Este método permite investigar respostas imunes exacerbadas e danos orgânicos em pesquisa de sepse humana.

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