Name: Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprenda o modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) para estudo de acidente vascular cerebral isquêmico em ratos, utilizando fluxometria por Laser Doppler. Este método permite monitorar o fluxo sanguíneo cerebral em tempo real.

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Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o "Princípio do Laboratório Animal Care" (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985). 1. Materiais <ol><li> Animais: Camundongos machos C57BL / 6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EUA) pesando 20-26 gramas no momento da cirurgia. </li><li> Anestesia: <ol><li> Aparelho de anestesia: VetEquip sistema de anestesia inalatória (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA). </li><li> Anestésicos inalatórios: O isoflurano (Farmacêutica Baxter, Deerfield, IL). </li></ol></li><li> Instrumentos cirúrgicos: uma tesoura SuperCut Iris, em linha reta (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Vannas micro-tesouras, em linha reta (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Dumont fórceps (ponta fina, 45 ° dicas dobrados, instrumentos de precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Bipolar unidade de coagulação (Exsicador High Frequency 900, Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); clipe navio micro (Instrumentos de Precisão Mundial, Inc., Sarasota, FL, EUA) </li><li> Materiais cirúrgicos: estéreis dicas de algodão; Wipes; esponjas de gaze; sutura (7-0 sutura de seda, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA); adesivo tecidual (Vetbond, a 3M Company, St Paul, MN, EUA); matagal Cirúrgica : Bethadine, etanol 70%, e estéril 0,9%; pomada Eye (Puralube Pomada Vet, Pharmaderm, Melville, NY, EUA). </li><li> Oclusão de sutura preparação para MCAO: <ol><li> Incandescência para MCA oclusão: 7-0 sutura cirúrgica de monofilamento de nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA). </li><li> Fonte de calor para embotamento da ponta de sutura (Unidade Térmica Cauterização, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Borracha de silicone líquido (silicone RTV adesiva, de precisão Mundial Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA). </li></ol></li><li> Cirúrgica / Dissecting microscópio (Leica Microscópio estéreo MZ6). <ol><li> Iluminador de fibra ótica (iluminador de fibra óptica Fo1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA). </li></ol></li><li> Laser doppler fluxometria (PeriFlux System 5000, Perimed, Estocolmo, Suécia). <ol><li> MICROTIP flexível (MT MICROTIP B500-0 Straight, Perimed, Estocolmo, Suécia) </li></ol></li><li> Parâmetros de temperatura: <ol><li> Monitorar a temperatura retal (BAT-12, instrumentos de precisão World, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Cobertor térmico (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, EUA). </li></ol></li><li> Coloração e medição quantitativa de infarto volume: <ol><li> 2% solução de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (2% TTC, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EUA). </li><li> Camundongos cérebro matriz slicer (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA). </li><li> Câmera digital (V1253, a Kodak Co., Rochester, NY, EUA). </li><li> Imagem J software (software ImageJ 1.42q, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA). </li></ol></li></ol> 2. Pré-cirúrgica passos <ol><li> Antes da cirurgia, os ratos estão alojados sob um ciclo claro / escuro 12:12 com livre acesso à água e para roedores. </li><li> Suturas para MCAO são preparados por embotamento 1-2mm da ponta de sutura com o calor e revestimento 3-4mm de eixo de sutura de sua ponta com borracha de silicone líquido, permitindo-o secar (7-0; ponta de diâmetro, 0,20-0,25 milímetros; revestimento comprimento, 3-4mm; sutura comprimento 11-13mm). Esterilidade deve ser preservado em todas as etapas acima mencionadas. </li><li> Após a pesagem do mouse, a anestesia é induzida com 4% de isoflurano em uma câmara de indução e mantida durante o procedimento com 1,5-2% isoflurano em 30% O 2 e 70% N 2 O mistura de gás através de uma máscara. </li><li> O mouse é colocado em uma posição de bruços em uma gaze deitado sobre uma superfície de operação com temperatura controlada (manta térmica); a pele da cabeça é raspada. </li><li> Pomada oftálmica lubrificante é aplicado a ambos os olhos, e as pálpebras estão fechadas para evitar a dessecação dos olhos durante o processo cirúrgico. </li><li> A incisão mediana (1 cm) é feita sobre a pele que recobre a calvária da linha nucal superior ao násio ea pele é puxada lateralmente para afixar um MICROTIP flexível (MT B500-0 MICROTIP reta, diâmetro de 0,5 mm). O MICROTIP é colocado perpendicular à superfície do crânio parietal direita (1 mm e 5 mm posterior ao bregma laterais) para monitorar o fluxo de sangue no território MCA fluxometria por laser doppler. </li><li> Certifique-se que o MICROTIP flexível é ligado ao crânio firmemente antes de o animal está ligado a uma posição supina. Pescoço do animal é colocada sobre uma almofada macia e seu nariz é mantido no cone do nariz do aparelho anestésico. Isto irá resultar em ter espaço suficiente para o MICROTIP flexível. </li><li> Uma sonda de temperatura rectal é inserida para manter uma temperatura central constante de animais de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Ambas as patas dianteiras e patas traseiras são gravadas para a superfície da plataforma operacional, ea cauda é colado o tubo retal. </li> &lt;/ Ol&gt; 3. MCA cirurgia de oclusão: <ol><li> Sob o microscópio cirúrgico, uma incisão é feita na linha média do pescoço com uma tesoura entre o manúbrio e da mandíbula suavemente levantando a pele solta. </li><li> A par subjacente glândulas submandibular são francamente dividida, com a glândula esquerda esquerda in situ. A glândula submandibular direita é retraída cranialmente e garantiu junto com o músculo esternocleidomastóideo. </li><li> A divisão exposta do músculo omo-hióideo cobrindo a bainha carotídea é cuidadosamente dividido com pickups. </li><li> A artéria carótida comum direita (CCA) é cuidadosamente separado e isolado do nervo vago e sua bainha (localizado lateralmente ao CCA). </li><li> Daqui por diante, os 2 métodos cirúrgicos que têm sido usados ​​com freqüência para realizar MCA oclusão diverge: </li></ol> Método de Koizumi 4 <ol class="lroman" type="i"><li> Três pontos gola solta (7-0 seda) são preparados em todo o CCA direita. </li><li> A artéria carótida externa (ACE) é identificado, isolado, e cauterizados (2-3mm distal a bifurcação). Ela pode posteriormente ser dividido com micro-tesoura. Para evitar danos acidentais periféricos no local de cauterização, o poder deve ser fixado em 1 usando o botão de energia. Isto é consistente para todos os cauterizações. </li><li> Tensão suficiente é aplicada para a sutura de colarinho mais proximal sobre o CCA para oclusão do fluxo sanguíneo (ligadura permanente). A oclusão do fluxo é verificado por uma queda de ~ 50% dos valores basais cortical perfusão. </li><li> Em seguida, um clipe de navio é colocado logo antes da bifurcação CCA para evitar fluxo retrógrado no momento da arteriotomia. </li><li> Uma arteriotomia é executada entre a sutura proximal ligada e o clipe de navio no CCA com micro-tesoura (mais perto de ligadura). </li><li> O calor blunted silicone revestido de sutura nylon 7-0 é introduzido através da arteriotomia e avançado até alcançar o clipe de navio. Os restantes 2 suturas colarinho soltos são gentilmente apertado ao redor do CCA entre o arteriotomia eo clipe de navio para evitar a volta de fuga através do fluxo CCA, com cuidado para não traumatizar a parede arterial, em seguida, o clipe de embarcação é retirada. </li></ol> Longa método de 3 <ol class="lalpha" type="a"><li> O ECA é identificado, dissecado tanto quanto possível (perto de sua bifurcação em artérias lingual e maxilar), cauterização (com poder de definir a 1), e dividiu com micro-tesoura. </li><li> Duas suturas gola solta (7-0 seda) são preparados em todo o ICA proximal um pouco acima da bifurcação CCA. </li><li> O CCA está temporariamente fechada com um clipe navio. A oclusão do fluxo é verificado por uma queda de ~ 50% dos valores basais cortical perfusão. </li><li> Em seguida, o ICA está temporariamente fechada com um clipe embarcação acima as duas suturas soltas colar para evitar fluxo retrógrado no momento da arteriotomia. </li><li> Uma arteriotomia é executada usando micro-tesoura na próxima ECA refletida para o coto. </li><li> O calor blunted silicone revestido de sutura nylon 7-0 é introduzido através da arteriotomia no ECA e avançado até alcançar o clipe de navio aplicada no ICA. Os 2 suturas gola solta no ICA proximal são gentilmente apertado ao redor da ACI proximal para evitar o fluxo de sangue através de refluxo ICA, com bastante atenção para não traumatizar a parede arterial, em seguida, o clipe de embarcação é retirada. </li></ol> O restante do procedimento é em grande parte convergentes: <ol><li> A sutura oclusão está lentamente avançado através da artéria carótida interna (ACI) em direção à base do crânio até uma resistência moderada é sentida. A queda simultânea no valor do fluxo sanguíneo cerebral como uma porcentagem (= 80%) em relação à linha de base é confirmada por laser doppler fluxometria. Os 2 suturas são apertadas colar ao redor do filamento inserido. </li><li> Para experimentos isquemia cerebral transitória, a sutura oclusão é retirado delicadamente após 45 minutos. Neste ponto o tempo pode ser alterado para vários objetivos experimentais. </li><li> Depois de retirar o filamento de sutura, o site arteriotomia é fechada para evitar sangramento pós-cirúrgico. No método de Koizumi, isso envolve firmemente apertando as suturas colar em volta do CCA. Na técnica de Longa, o site arteriotomia na base do ECA é cauterizada, então as suturas colar no ICA proximal são afrouxados e removido para restaurar o fluxo de carótida. </li><li> Para fechar a incisão, a glândula submandibular e SCM são colocados sobre o campo operatório. As bordas da ferida são então aproximados com adesivo em tecido cervical e áreas do couro cabeludo. Alternativamente, um grampo de sutura absorvíveis ou metal poderiam ser usados ​​para fechar a ferida, especialmente quando sobrevivência a longo prazo do animal se destina. </li><li> Após o encerramento da incisão, o animal recebe uma solução salina morna ml por via subcutânea, reposição de volume. Uma dose de analgésicos apropriados (ie Buprenorfina em 0,05-0,1 mg / kg) devem ser utilizados para minimizar a dor animal e desconforto durante o período de recuperação. A animal é removido da sala de cirurgia e colocado em uma gaiola de recuperação da área quente / para evitar a hipotermia, com acesso fácil e gratuito a uma alimentação suave e água. </li></ol> 4. Pós-Op avaliação neurológica Depois que o animal recupere a consciência total, déficits neurológicos podem ser avaliados por uma escala simples (cinco vírgula escala) da seguinte 3: <ol start="0"><li> déficits não observáveis </li><li> não-prorrogação forepaw contralateral (déficit neurológico leve focal) </li><li> circulando em uma direção contralateral ao infarto (moderado déficit neurológico focal) </li><li> caindo em uma direção contralateral ao infarto (grave déficit neurológico focal) </li><li> depressão do nível de consciência sem movimento espontâneo </li></ol> 5. Coloração e medição quantitativa do volume de infarto cerebral <ol><li> Após 24 horas de reperfusão MCA, o mouse sobreviventes é pesado, profundamente anestesiados com isoflorane 4%, e sacrificado de acordo com o protocolo aprovado. </li><li> O cérebro é cuidadosamente removido e colocado em um rato slicer cérebro matriz, e do cérebro inteiro é coronalmente seccionados em intervalos de 2 mm. </li><li> As seções são imersos em 2% TTC em tampão fosfato salino (PBS) a 37 ° C por 20 minutos. Após a coloração TTC, área de infarto é mostrado como um tecido branco (sem manchas) adjacente ao tijolo vermelho (viável) tecido (Figura 1). </li><li> Cortes seriados são fotografados usando uma câmera digital e na área de infarto é medido com o programa J imagem. </li><li> A área de infarto (branco, imaculado), a área do hemisfério ipsilateral (branco e vermelho tijolo, manchado), ea área do hemisfério contralateral (tijolo vermelho manchado,) são medidos para cada seção. O volume é calculado pela soma das áreas de representação em todas as seções e multiplicando pela espessura do corte. Depois de corrigir para o edema, o volume de infarto é calculado da seguinte 9: Volume Infarct corrigido (CIV),% = [volume hemisfério contralateral - (volume hemisfério ipsilateral - volume de infarto)] volume hemisfério / contralateral x 100 </li></ol> 6. Resultados representante Após a oclusão e reperfusão da MCA através deixou CCA para estabelecer isquemia cerebral transitória, os animais são sacrificados e seus cérebros coronalmente seccionado estão manchadas com TTC para avaliar o volume de infarto (Figura 1). <img src="files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. TTC-manchada seriados cérebro coronal (2 mm) de ratos submetidos a oclusão MCA. </ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, e21-e181 (2009).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema.+I.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurol Res. 19, 641-648 (1997).</li>
<li>Fujii, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-related+differences+in+susceptibility+to+transient+forebrain+ischemia+in+SV-129+and+C57black%2F6+mice.+%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. </a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).</li>
<li>Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).</li>
<li>Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+4-phenylbutyrate+protects+against+cerebral+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury.</a> Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ideal+suture+diameter+is+critical+for+consistent+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).</li>
<li>Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+model+of+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+a+study+with+histopathological+and+behavioral+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).</li>
<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
</ol>

Autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

O modelo MCAO é um modelo estabelecido que replica isquemia cerebral em espécies murina. Este modelo foi usado pela primeira vez em ratos e, posteriormente adaptado para ratos. Evitando craniectomia para eliminar a influência da manipulação cirúrgica na permeabilidade da barreira do sangue cerebral e pressão intracraniana é uma vantagem desta técnica. No entanto, muitas variáveis, tais como tensão diferenças relacionadas 10, tamanho da ponta de sutura 11, a duração da oclusão 6, a temper...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Masculino camundongos C57BL / 6 </td><td> Animal </td><td> Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EUA </td><td></td><td> 20-26 grs </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Microscópio </td><td> Leica Microscópio estéreo MZ6 </td><td></td><td> Zoom 6.3:1 </td></tr><tr><td> Iluminador de fibra óptica </td><td> Iluminador </td><td> TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA </td><td></td><td> Fo1-150 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Anestesia </td><td> Farmacêutica Baxter, Deerfield, IL </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Iris SuperCut, em linha reta </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 14218 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas micro-tesoura, em linha reta </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 14003 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont multa forceps ponta </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 503290 </td><td></td></tr><tr><td> Clipe de navio </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 14120 </td><td></td></tr><tr><td> Exsicador High Frequency 900 </td><td> Ferramenta cirúrgica </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 500397 </td><td></td></tr><tr><td> 7-0 sutura cirúrgica de monofilamento de nylon </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA </td><td> 1647G </td><td> Sutura para oclusão </td></tr><tr><td> 7-0 sutura cirúrgica Silk </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA </td><td> 7733G </td><td> Sutura para ligadura </td></tr><tr><td> Silicone RTV adesiva </td><td> Borracha de silicone </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 1571 </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> Adesivo de tecido </td><td> 3M Company, St Paul, MN, EUA </td><td> 70200746587 </td><td></td></tr><tr><td> Puralube Pomada Vet </td><td> Pomada </td><td> Pharmaderm, Melville, NY, EUA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina hydrochlorode </td><td> Analgésicos </td><td> Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, EUA </td><td> NDC 0409-2012-32 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade Cauterização Térmica </td><td></td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> 501292 </td><td></td></tr><tr><td> PeriFlux System 5000 </td><td> TCD fluxometria </td><td> Perimed, Estocolmo, Suécia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BAT-12 </td><td> Retal termômetro </td><td> Precision mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA </td><td> BAT-12R </td><td></td></tr><tr><td> T / PUMP, TP600 </td><td> Cobertor térmico </td><td> Gaymar, NY, EUA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EUA </td><td> T8877 </td><td></td></tr><tr><td> Camundongos cérebro matriz slicer </td><td> Cérebro slicer </td><td> Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA </td><td> BSMAS001-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

intraluminal artéria cerebral média oclusão model (mcao) para acidente vascular cerebral isquêmico com laser doppler fluxometria orientação em ratos

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

AVC é a terceira principal causa de morte e a principal causa de incapacidade no mundo, com um custo estimado de perto de US $ 70 bilhões nos Estados Unidos em 2009 1,2. O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) foi desenvolvido por Koizumi 4 em 1986 para simular esta patologia de grande impacto humano no rato. A modificação do método de MCAO mais tarde foi apresentado por Longa 3. Ambas as técnicas têm sido amplamente utilizados para identificar mecanismos moleculares de lesão cerebral resultante de acidente vascular cerebral isquêmico e potencial modalidades terapêuticas 5. Este método relativamente não-invasivo em ratos foi estendido para uso em camundongos para tirar proveito de transgênicos e knockout cepas 6,7. À isquemia focal modelo cerebral, uma sutura intraluminal é avançado através da artéria carótida interna para ocluir a base do MCA. Retração da sutura, após um período de tempo especificado imita reperfusão espontânea, mas a sutura pode também ser mantida em permanência. Este vídeo estará demonstrando as duas abordagens principais para a realização de procedimento MCAO intraluminal em ratos de forma gradual, bem como fornecer insights para potenciais inconvenientes e perigos. O tecido cerebral isquêmico, posteriormente, ser manchada por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto (TTC) para avaliar a extensão do infarto cerebral 8.

O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

O acidente vascular cerebral é a terceira principal causa de morte e a principal causa de incapacidade no mundo, com um custo estimado de quase 70 bilhões de dólares nos Estados Unidos...

Neste artigo em vídeo, apresentamos um modelo murino de acidente vascular cerebral isquêmico conhecido como oclusão da artéria cerebral média ou MCAO. No método original de oclusão da artéria cerebral média por coágulo, uma sutura rombuda é avançada através da artéria carótida comum para ocluir a artéria cerebral média. Este método resulta em uma oclusão permanente da artéria carótida comum.Uma modificação metodológica por Longa permite o acesso à artéria cerebral média por meio da artéria carótida externa. Este método preserva a função da carótida comum e sua circulação distal entre os modelos experimentais de acidente vascular cerebral isquêmico. O modelo de oclusão da artéria cerebral média por filamento intraluminal em ratos e camundongos é um dos modelos mais frequentemente utilizados; desde sua primeira descrição em ratos, várias modificações do modelo inicial foram publicadas, sendo atualmente a modificação de Longa a variação mais proeminente.Este modelo é menos invasivo e fácil de realizar tanto isquemia permanente quanto transitória de maneira controlada. O modelo de oclusão da artéria cerebral média por filamento intraluminal envolve a inserção de um monofilamento na artéria carótida interna e seu avanço até bloquear o fluxo sanguíneo para a artéria cerebral média. Este modelo fornece infartos reprodutíveis na área territorial da faixa média da artéria e permite a reperfusão após a retirada do fio cirúrgico.O tamanho do infarto parece ser afetado por muitos fatores específicos nesta técnica, como o diâmetro da sutura, o revestimento da sutura com silicone ou poliol lisina, ou o comprimento de inserção do próprio filamento. Neste vídeo, mostraremos como realizar este modelo de forma sequencial, bem como como evitar muitas das armadilhas e desvantagens potenciais relacionadas ao uso deste método. Uma sutura de náilon monofilamento 7,0 será utilizada para a oclusão da artéria cerebral média.A extremidade da sutura de náilon deve ser arredondada pela proximidade com uma fonte de calor. A extremidade arredondada deve ser reta e lisa, com aproximadamente um a dois milímetros de comprimento. Após arredondar a extremidade, a sutura deve ser cortada para um comprimento total de aproximadamente 11 a 13 milímetros.A ponta rombuda da sutura é mergulhada em silicone até que três a quatro milímetros da extremidade fiquem revestidos, e então é deixada secar. Todos os passos no preparo da sutura devem ser realizados em condições estéreis. Após pesar o camundongo, a anestesia é induzida com 4% de isoflurano em uma câmara de indução.O camundongo é posicionado em decúbito ventral sobre uma gaze colocada sobre uma manta térmica. Para manter uma temperatura corporal central de 37 graus, a anestesia é mantida durante o procedimento por meio de uma máscara facial. A cabeça depilada é limpa com álcool, Betadine e novamente com álcool.Uma incisão de um centímetro é feita na pele para expor o crânio um milímetro posterior e cinco milímetros lateral ao bgma. Uma micro ponta flexível é fixada perpendicularmente à superfície do osso parietal direito para monitorar o fluxo sanguíneo na área da artéria cerebral média por meio de imagem de fluxo a laser por Doppler.Retornando o animal à posição supina, faz-se uma incisão mediana no pescoço com tesoura, entre o manúbrio e a mandíbula. As glândulas submandibulares pareadas são separadas por dissecação romba para expor as estruturas subjacentes: o músculo digástrico, o músculo esternocleidomastoideo e a traqueia. A retração dessas estruturas em formato triangular e uma dissecação adicional revelam a artéria carótida comum, o nervo vago e a veia jugular interna; a artéria carótida comum bifurca-se nas artérias carótida externa e carótida interna.A artéria occipital também pode ser observada originando-se da região de bifurcação. No método de COE, a artéria carótida comum proximal é cuidadosamente separada e isolada do nervo vago. Três pontos de sutura em forma de colar são preparados ao redor da artéria carótida comum.Deve-se prestar atenção especial para que o nervo vago não seja capturado pelo ponto A. A artéria carótida externa é identificada e isolada. Em seguida, é cauterizada a dois ou três milímetros da bifurcação.O ponto de sutura mais próximo no colar da artéria carótida comum é apertado para ocluir permanentemente o fluxo sanguíneo. A oclusão do fluxo é verificada por meio de uma queda nos valores basais de perfusão cortical de aproximadamente 50%. As pontas livres da sutura são cortadas. Um clipe vascular é colocado logo antes da bifurcação da carótida comum para evitar o fluxo sanguíneo retrógrado.Em seguida, realiza-se uma arteriotomia entre o clipe vascular e a ligadura com tesoura microcirúrgica. Isso permite a introdução da sutura termoretificada na artéria carótida comum e seu avanço até alcançar o clipe vascular. Os dois fios de sutura da cânula restantes são suavemente apertados para evitar vazamento de refluxo pela artéria carótida comum.O clipe do vaso é retirado e a sutura rombuda é suavemente avançada para dentro da artéria carótida interna. Até que uma leve resistência seja sentida na leitura do Doppler, obtém-se uma redução aproximada de 80% em relação à linha de base. As duas suturas de fixação são firmemente apertadas para evitar sangramento retrógrado.O camundongo pode agora permanecer em um estado de isquemia por um período de tempo apropriado. Para simular a reperfusão, os pontos de oclusão são removidos após um intervalo adequado. Um aumento na leitura do Doppler indica que o fluxo sanguíneo colateral foi restabelecido.O ponto de sutura é completamente retirado e os dois pontos de sutura do colarinho são totalmente apertados e aparados no método longo. Pode-se utilizar uma via diferente para ocluir a artéria cerebral média. Primeiro, a carótida externa deve ser identificada, isolada e cauterizada o mais distalmente possível, deixando um comprimento suficiente para a inserção do fio de sutura.A artéria carótida externa é então dividida e seus ramos são cauterizados e cortados também. O coto da artéria carótida externa é retratado. Preparam-se cuidadosamente dois pontos de ligadura soltos ao redor da artéria carótida interna proximal logo acima da bifurcação da carótida comum.A artéria carótida comum é temporariamente fechada com uma pinça vascular. Isso resulta em uma queda nos valores de perfusão de aproximadamente 50% logo distal à bifurcação. A artéria carótida interna é igualmente clampeada com uma pinça vascular e uma arteriotomia é realizada próximo à extremidade do coto retratado da carótida externa utilizando tesoura microcirúrgica.A sutura aquecida é introduzida através da artéria carótida comum e da carótida externa e avançada até alcançar o clipe vascular na artéria carótida interna. Os dois laços de sutura soltos ao redor da porção proximal da carótida interna são suavemente apertados para evitar o refluxo sanguíneo, porém sem comprimir excessivamente a fim de não traumatizar a parede arterial. Em seguida, o clipe vascular é removido da artéria carótida interna, a partir da qual a artéria tripalatina se ramifica.À medida que a sutura é avançada suavemente, deve-se ter cuidado para evitar redirecioná-la para dentro dela. É observada uma segunda queda na leitura do Doppler. Quando a sutura rombuda atinge a artéria cerebral média, os pontos da cânula devem ser novamente apertados para evitar sangramento retrógrado.O camundongo pode agora permanecer em um estado de isquemia por um período de tempo apropriado. Retrair o ponto cego restaura o fluxo sanguíneo, conforme indicado por um aumento no monitor de Doppler. Após a remoção completa dos pontos, o coto da artéria carótida externa é cauterizado.Para prevenir sangramento pós-cirúrgico, é necessário ter cuidado para preservar a patência da artéria carótida comum. Os pontos de ligadura na artéria carótida interna proximal são então afrouxados e cortados, e o clipe na artéria carótida comum é removido para restabelecer o fluxo sanguíneo. Isso é indicado por um segundo pico na leitura do Doppler.Uma vez que o camundongo recupere a consciência, os déficits neurológicos podem ser avaliados em diferentes momentos, de acordo com uma escala de cinco pontos. Uma pontuação de zero indica ausência de déficit neurológico observável; uma pontuação de um, correspondente a um acidente vascular cerebral leve, é evidenciada pela incapacidade de estender uma pata dianteira do lado oposto ao hemisfério acometido pelo acidente vascular cerebral. Uma pontuação de dois, correspondente a um acidente vascular cerebral moderado, é evidenciada por movimentos circulares na direção oposta à do hemisfério acometido.Uma pontuação três, correspondente a um acidente vascular cerebral grave, é evidenciada pela queda em uma direção oposta ao hemisfério afetado pelo acidente. Um camundongo com pontuação quatro demonstrará nenhuma atividade motora espontânea. Para obter uma medida do volume do acidente vascular cerebral, o cérebro é removido do crânio em um ponto temporal apropriado.Após a reperfusão, o cérebro é colocado em um fatiador matricial e todo o cérebro é seccionado no plano coronal. Em intervalos de dois milímetros, o cerebelo e os bulbos olfativos são descartados. Cada seção de dois milímetros é imersa em solução de TTC 2% por 20 minutos a 37 graus no escuro.Imagens digitais das seções cerebrais mostram que o TTC cora em vermelho o tecido vivo e deixa o tecido infartado com coloração esbranquiçada em cada seção. A área do infarto, identificada aqui como um, a área de todo o hemisfério ipsilateral, identificada aqui como dois, e a área do hemisfério contralateral, identificada aqui como três, são todas medidas com o programa Image J. Após medir as áreas em todas as seções, os volumes podem ser calculados somando os valores das áreas e multiplicando pela espessura das fatias.Para determinar o volume do infarto corrigido para edema, utiliza-se a seguinte fórmula. Esse volume é expresso como uma porcentagem do volume do hemisfério ipsilateral. O modelo MCO fornece resultados reprodutíveis.No entanto, alguns fatores procedimentais podem interferir na execução da técnica. O revestimento de silicone na extremidade da sutura é importante porque suaviza a superfície da sutura e reduz o risco de abrasão endotelial ou perfuração vascular. Além disso, o revestimento da sutura pode ser modificado para refletir diferentes objetivos experimentais.Revestir além de três a quatro milímetros da ponta ocluirá a artéria proximal à artéria cerebral média, aumentando o volume total do acidente vascular cerebral. As suturas coloridas devem ser aplicadas com cuidado para não restringir o nervo vago e devem ser amarradas suavemente para que a parede AAL não seja traumatizada. A temperatura corporal do camundongo pode afetar a extensão da infarto, portanto, esta deve ser mantida estável durante todo o procedimento.Esperamos que assistir a este vídeo ajude você a compreender o processo cirúrgico e forneça um ponto de partida sólido para os seus próprios experimentos. Obrigado por assistir e boa sorte com os seus experimentos.

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