Name: Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a extrair DNA de alto peso molecular de esteiras microbianas hipersalinas. Este protocolo melhora a qualidade e concentração do DNA ao separar células microbianas da matriz antes da extração.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Programa Ambiental Genomics (Grant No. EF-0723707).

1. Extração de células microbianas: <ol><li> Homogeneizar tapetes microbianos com um pilão de moer estéril, misturando bem. Coloque todos os cerca de 30 g (peso úmido) de material mat homogeneizadas em recipiente estéril de liquidificador Waring, adicionar cerca de 100 mL de NaCl 1 M (ou uma concentração específica para amostra em uso), e mistura três vezes em velocidade média por 1 min com resfriamento intermitente em um freezer -20 ° C por 1 min. Transfira a pasta em um frasco de centrífuga de 250 mL e completar o volume vazio restante com 1 M NaCl. Prepare a solução de NaCl em água autoclavada DI e filtro de esterilizá-lo. </li><li> Além disso desalojar as células microbianas a partir da matriz agitando (150 rpm) usando um vortexer (Vortex-Genie R 2) em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Centrifugar a baixa velocidade (500x g) por 15 min a 4 ° C. Gentilmente transferir o sobrenadante para um balão com perturbação mínima para o sedimento. </li><li> Usando o sedimento peletizada, repita os passos de mistura e 1.2 e 1.3 quatro vezes mais com a adição de NaCl fresco para cada pellet de sedimentos no final do passo 1.3. O sobrenadante de cada extração de NaCl é transferido para um balão fresco. </li><li> Combine os sobrenadantes dos 5 celulares extrações e centrifugar em alíquotas de 200 mL em alta velocidade (25.000 xg) por 15 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, ressuspender cada pellet celular em 10 mL de hexametafosfato de sódio a 2%, combine pellets e fazer aumentar o volume para 200 mL com hexametafosfato de sódio a 2%. Lave as células por agitação (150 rpm) em temperatura ambiente por 30 min. No final desta etapa você deve ter apenas um tubo de células para prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Centrífuga em alta velocidade (25.000 xg) por 15 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, ressuspender pellet celular em 200 mL de TE (50 mM EDTA), e lavar as células por agitação (150 rpm) em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Centrífuga em alta velocidade (25.000 xg) por 15 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante, ressuspender em 15 mL de TE (10 mM EDTA), e armazenar de 200 mL alíquotas a -80 ° C até ser necessário para DNA extrações. </li></ol> 2. Extração de DNA e Purificação: <ol><li> Adicionar 200 mL de NaCl 5 M, 200 mL SDS 10%, e de 100 L 14,3 M β-mercaptoetanol para a alíquota de 200 mL de células microbianas. Misture delicadamente por inversão 4-6 vezes. </li><li> Mistura o assunto para 3 rounds de congelamento e descongelamento por submersão em nitrogênio líquido por 2 minutos seguido de descongelamento em banho-maria a 65 ° C por 5 min. Estender finais descongelamento a 10 min. </li><li> Adicionar 200 mL de acetato de potássio 5 M (pH 5,5) e colocar no gelo por 10 min. Centrifugar a 10.000 xg por 10 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um novo tubo usando uma ponteira de grande furo. Adicionar 3 mL de RNase A e incubar a 37 ° C por 1h. </li><li> Adicionar igual volume de clorofórmio, agitar brevemente por inversão, e centrifugar a 15.000 xg por 10 min em temperatura ambiente. </li><li> Transferir cuidadosamente a camada superior do sobrenadante para um novo tubo usando uma ponteira de grande furo. Evite pipetagem a camada de interface branco, localizado entre as camadas superior e inferior. Repita o procedimento de extração clorofórmio. </li><li> Adicionar um volume igual de refrigerados (a -20 ° C) isopropanol para o sobrenadante e incubar no gelo por 30 min para o DNA precipitado. </li><li> Centrifugar à máxima velocidade (20.800 xg) por 10 min a 4 ° C para pellet de DNA. </li><li> Desprezar o sobrenadante e lavar DNA pellet com 1 mL de refrigerados (a -20 ° C) etanol 70%. </li><li> Centrifugar à máxima velocidade (20.800 xg) por 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante, repita lavar etanol 70%, e de ar seco pellet de DNA por 10 min. Repita lavar etanol 70%. </li><li> Ressuspender o DNA em 25 mL TE (10 mM EDTA), quente a 65 ° C por 5 min, se combinam em um tubo se tubos múltiplos têm sido utilizados, e make-up volume de 500 mL com TE. </li><li> Adicionar 500 mL gelada (ou a 4 ° C) 20% de polietileno glicol (PEG) (preparado em 1,2 M NaCl). Misture delicadamente por inversão e incubar no gelo durante 10 min, e centrifugar a velocidade máxima por 10 min a 4 ° C para pellet de DNA. Remover e descartar o sobrenadante e lavar o DNA peletizadas com 1 mL de etanol 70% gelado, ar seco por 10 min, e ressuspender em 30-50 mL TE ou água de grau molecular. Facilitar a ressuspensão de DNA por aquecimento a 65 ° C por 5 min e DNA loja a -80 ° C. </li></ol> 3. Purity DNA, Concentração e Determinação Tamanho: <ol><li> Determinar a qualidade do DNA através da medição da 260/280 A e A 260/230 relações usando um espectrofotômetro 1000 Nanodrop ou quaisquer outros instrumentos apropriados. </li><li> Determinar a concentração de DNA usando Quant-iT dsDNA kit de Ensaio de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Determinar o tamanho do DNA usando pulso eletroforese em gel de campo. Prepare 1% agarose gel com 0,5 X TBE e usar os seguintes parâmetros na Mapper CHEF XA System; tempo de troca inicial de 0,35 s, um tempo de troca final de 7,67 s, e 120 ° incluído ângulo de um gradiente de 6,0 V / cm em um r linearamplificação fator. Mancha gel com 1 x SYBR Green I para 30 min. Carga entre 700-1000 ng DNA total em gel. Ver fig. 3 para uma forma condensada do protocolo completo. </li></ol> Resultados representativos: Extração de células: Extratos microbianos seqüencial celular (sobrenadante) mostraram que a turbidez dos extratos diminui à medida que aumenta o número de extrações. Isto sugere uma redução no número de células após cada extração de células sucessivas. Importante notar aqui é que, como cada etapa de extração de células adicionais proporciona a oportunidade para a introdução de contaminantes, o número de células extrações devem ser minimizados para que o final de pellet celular é representante da comunidade microbiana total. Outras fontes de contaminação foram controlados através da adopção de técnicas de laboratório adequado estéril. Por exemplo, as soluções foram preparadas em água DI autoclavado e esterilizado por filtração. Recipientes foram esterilizados com álcool, autoclavados e tratados sob luz UV e reticulador ultravioleta. Concentração de DNA e determinação de qualidade: O protocolo rendeu cerca de 2 mg de HMW DNA (35-50 kb) (Fig. 4) por grama de amostra tapete com um A 260 / 280 relação de 1,6, e um A proporção de 260/230 0,7 (Tabela 1). Embora a razão A 260 / 230 parece ser baixa, sem inibição de aplicação de base molecular a jusante, como a amplificação do 16S rRNA genes foi observado em um estudo separado 7. É importante notar que o DNA de hipersalinos esteiras tem duas principais fontes de contaminação; EPS e sais. Portanto, é possível que traços destes contaminantes podem estar influenciando a A 260/230 relações, apesar dos esforços tremendos para reduzir seus efeitos sobre as aplicações de fluxo baixo. DNA determinação do tamanho: Pulso de eletroforese em gel de campo emprega um fluxo pulsante atual com interruptores intermitentes direcional, resultando em um esfregaço de DNA, como mostrado na figura 3. Nosso protocolo rendeu um DNA HMW de aproximadamente 35-50 kb. Enquanto alguns tamanho DNA pode ser menor que 30 kb, é importante ter parte do esfregaço acima de 35 kb dado que a clonagem fosmid requer ~ 40 kb de DNA e insere fragmentos maiores de DNA proporcionar maior acesso às vias biossintéticas intacta. Em nossos estudos, o esfregaço DNA acima de 35 kb foi retirado e purificada de grande vetor de inserção clonagem e outras aplicações molecular. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microbiana hipersalinos local de amostragem mat (Lagoa Grande) localizado na Eleuthera, nas Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A seção transversal do tapete microbiano hipersalinos utilizados neste estudo. O tapete microbiano foi obtido a partir de uma lagoa hipersalina localizado na Eleuthera, nas Bahamas. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representação esquemática dos processos envolvidos na extração de células microbianas, lise celular, extração e purificação do DNA metagenomic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">Clique aqui para ver uma imagem maior.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Caracterização do peso molecular do DNA extraído usando pulso eletroforese em gel de campo. Pista M é um marcador HMW, e faixas 1 e 2 são réplicas de DNA metagenomic extraído do tapete hipersalinos Eleuthera usando o protocolo acima. <table border="1"><tbody><tr><td> Método de extração </td><td></td><td> Concentração ng / g </td><td> A 260/280 </td><td> A 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Rep 1 </td><td> 1806,1 </td><td> 1,64 </td><td> 0,76 </td></tr><tr><td></td><td> Rep 2 </td><td> 2010,8 </td><td> 1,61 </td><td> 0,75 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. A medição da concentração e qualidade do DNA extraído de mat hipersalinos microbiana.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Dado que a remoção total de células a partir de amostras mat complexa e altamente diversificada microbiana não é prático, a principal preocupação é o quão bem as células extraídas representar a comunidade microbiana total mat. Em um estudo anterior, PCR-DGGE análise dos genes 16S rRNA microbiana mostrou que as cinco etapas de remoção de células utilizadas neste protocolo de extratos de células que são representativas da comunidade em geral tapete microbiano 7. O número real de extração de células passos neces...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polietileno glicol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% em 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Acetato de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT Assay dsDNA kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentro </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> BDH Chemicals </td><td> BDH8014 </td><td> Conc apropriado. </td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% em água </td></tr><tr><td> hexametafosfato de sódio </td><td> Merck Química </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% da água </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA Sistema </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 espectrofotômetro </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agente de crosslinking ultravioleta </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring Blender </td><td> Waring laboratório </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extração de dna de alto peso molecular de esteiras microbianas

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Análise bem sucedida e precisas e interpretação de dados metagenomic é dependente da extração eficiente de alta qualidade, de alto peso molecular DNA comunidade (HMW). No entanto, as amostras de mat ambientais muitas vezes apresentam dificuldades para a obtenção de grandes concentrações de DNA de alta qualidade HMW,. Tapetes microbianos hipersalinos contêm grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 1 e sais que podem inibir a aplicações a jusante do DNA extraído. Métodos diretos e duras são muitas vezes utilizados na extração de DNA a partir de amostras refratário. Estes métodos são normalmente utilizados, pois o EPS em esteiras, uma matriz adesiva, liga-se 2,3 DNA durante a lise direta. Como resultado de métodos mais duros de extração, o DNA torna-se fragmentado em tamanhos pequenos 4,5,6. O DNA, assim, torna-se inadequado para os grandes inserir clonagem do vetor. A fim de contornar essas limitações, apresentamos uma metodologia melhorada para extrair DNA HMW de boa qualidade e quantidade de tapetes microbianos hipersalinos. Nós empregamos um método indireto envolvendo a separação de células microbianas a partir da matriz mat fundo através de mistura e centrifugação diferencial. A combinação de procedimentos mecânicos e químicos foi usado para extrair e purificar o DNA das células microbianas extraído. Nosso protocolo produz cerca de 2 mg de HMW DNA (35-50 kb) por grama de amostra de esteira, com um A 260 / 280 relação de 1,6. Além disso, a amplificação do 16S rRNA genes 7 sugere que o protocolo é capaz de minimizar ou eliminar os efeitos inibitórios de contaminantes. Nossos resultados fornecem uma metodologia apropriada para a extração de DNA a partir de HMW tapetes microbianos para estudos funcionais metagenomic e pode ser aplicável a outras amostras ambientais a partir do qual a extração de DNA é um desafio.

Nós fornecemos um protocolo melhorado para a extração de DNA de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Células microbianas são separados da matriz mat antes da extração e purificação DNA. Isso aumenta a concentração, qualidade e tamanho do DNA. O protocolo pode ser usado para outras amostras refratário.

Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas

A análise e a interpretação bem-sucedidas e precisas de dados metagenômicos dependem da extração eficiente de DNA de alta qualidade e de alto peso molecular...

O objetivo geral deste procedimento é extrair DNA de alto peso molecular de matas microbianas hipersalinas. Isso é realizado primeiramente homogeneizando e extraindo células microbianas da mata microbiana. As células microbianas são então lisadas utilizando metodologia de congelamento-descongelamento e métodos químicos.A seguir, realiza-se a remoção de detritos celulares e RNA por meio de extrações orgânicas e RNAses, seguida pela extração de DNA. O passo final do procedimento é a precipitação e purificação do DNA. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram DNA de alta qualidade e concentração, com alto peso molecular.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os métodos diretos e agressivos de extração de DNA, é que ela utiliza DNA de alto peso molecular proveniente de uma amostra ambiental complexa para estudos funcionais de metagenômica. O met microbiano utilizado neste estudo foi obtido de uma lagoa hipersalina localizada em Eleuthera, Bahamas. Para extrair as células microbianas da matriz do tapete de fundo, primeiro misture aproximadamente 30 gramas do tapete completamente, sem triturar, com um pistilo de moagem estéril. O tapete está completamente homogeneizado quando não forem visíveis grumos na mistura.Em seguida, coloque o material opaco homogeneizado em um liquidificador e adicione cerca de 100 mililitros de cloreto de sódio. Bata em velocidade média por um minuto, seguido de resfriamento por um minuto a menos 20 graus Celsius. Repita isso, batendo e resfriando mais duas vezes; ao final da batedura, transfira a suspensão para um frasco de centrífuga de 250 mililitros e complete o volume restante vazio com cloreto de sódio um molar.Agite em temperatura ambiente durante 30 minutos; após esse período, centrifugue a suspensão em baixa velocidade por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um frasco, com o mínimo de perturbação ao sedimento. Adicione cloreto de sódio fresco ao sedimento em forma de pellet.Agite novamente e misture por 30 minutos. Em seguida, centrifugue como antes e transfira o sobrenadante para um novo frasco. Repita a adição de cloreto de sódio fresco, a agitação, a centrifugação e a remoção do sobrenadante mais três vezes.Combine os sobrenatantes das cinco extrações celulares e centrifugue alíquotas de 200 mililitros em alta velocidade durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenatante e re-suspenda cada pellet celular em 10 mililitros de hexametafosfato de sódio. Combine as suspensões celulares provenientes dos quatro tubos e adicione hexametafosfato de sódio para completar o volume até 200 mililitros.Lave as células agitando-as à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a agitação, centrifugue as células em alta velocidade por 15 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 200 mililitros de te, lavando as células novamente mediante agitação à temperatura ambiente por 10 minutos. Por fim, centrifugue novamente em alta velocidade por 15 minutos a quatro graus Celsius.Após descartar o sobrenadante Resus, suspenda o pellet celular em 15 mililitros do meio para preparar alíquotas de 200 microlitros de células microbianas. As células microbianas podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius até o momento de serem utilizadas para extrações de DNA. Para iniciar o procedimento de extração e purificação de DNA a partir das células microbianas, adicione cloreto de sódio, SDS e etanol beamr capto a cada uma das alíquotas de 200 microlitros de células microbianas.Aliquotar oito tubos no total. Misturar suavemente invertendo de quatro a seis vezes, submergir a mistura em nitrogênio líquido por dois minutos, seguido por descongelação a 65 graus Celsius por cinco minutos, repetir a submersão em nitrogênio líquido e a descongelação a 65 graus Celsius mais duas vezes.Estenda o descongelamento final por 10 minutos. Após a terceira rodada de congelamento e descongelamento, adicione 200 microlitros de acetato de potássio a cada tubo e coloque no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue a 10.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, utilize uma ponteira de pipeta de grande diâmetro para transferir o sobrenadante para um novo tubo. Adicione três microlitros de RNAs A e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação de uma hora, adicione um volume igual de clorofórmio.Agite brevemente por inversão e centrifugue a 15.000 Gs por 10 minutos. À temperatura ambiente, transfira a camada superior do sobrenatante para um novo tubo. Repita o procedimento de extração com clorofórmio.Novamente, transfira a camada superior do sobrenatante para um novo tubo. Adicione um volume igual de isopropanol gelado ao sobrenatante e incube no gelo por 30 minutos. Para precipitar o DNA, centrifugue em velocidade máxima, para formar o pellet de DNA, descarte o sobrenatante e lave cada pellet de DNA com um mililitro de etanol 70% gelado.Repita a centrifugação da lavagem com etanol 70% em velocidade máxima por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Repita a lavagem com etanol 70% e seque o pellet de DNA ao ar por 10 minutos.Resuspenda cada pellet de DNA em aproximadamente 25 microlitros de te. Incube a 65 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, reúna todos em um único tubo e complete o volume para 500 microlitros com te. Adicione polietilenoglicol e misture suavemente por inversão, depois incube no gelo por 10 minutos.Centrifugue para formar o pellet de DNA. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante após lavar o DNA com etanol a 70% gelado. Seque ao ar por 10 minutos, ressuspenda em 30 a 50 microlitros de TE ou água grau molecular e aqueça a 65 graus Celsius por cinco minutos.Armazene o DNA a menos 80 graus Celsius. Esta tabela mostra os resultados da medição da concentração e qualidade do DNA extraído do tapete microbiano hipersalino. O protocolo gerou aproximadamente dois microgramas de DNA por grama de amostra de tapete, com uma razão A260/A280 de 1,6 e uma razão A260/A230 de 0,7.Embora a razão A260/A230 tenha parecido baixa, nenhuma inibição de aplicações moleculares downstream, como a amplificação por PCR dos genes do RNA ribossômico 16S, foi observada em um estudo separado. Quando o tamanho do DNA foi determinado por eletroforese em gel com campo pulsado, os resultados indicaram DNA de alto peso molecular ou H-M-W-D-N-A de aproximadamente 35 a 50 quilobases. Aqui, a linha M é um marcador de alto peso molecular e as linhas um e dois são réplicas de DNA metagenômico extraído do tapete halofílico eleuthra. A mancha de DNA acima de 35 quilobases pode ser excisada e purificada para clonagem em vetores de inserção ampla ou outras aplicações moleculares apropriadas.Após este procedimento, outros métodos, como clonagem P-C-R-D-G-G-E ou sequenciamento de DNA, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, qual é a diversidade funcional da comunidade microbiana em estudo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

Descrito aqui é um método para a extração, purificação e controle de qualidade do DNA genômico do patógeno fúngico biotrófico obrigatório, oídio, para uso em sequenciamento de genoma de leitura longa.

Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

Apresentamos o processo de isolamento, propagação e caracterização de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos de habitats aquáticos. O protocolo descreve o isolamento bacteriano, a identificação pelo método 16S rRNA e o teste de seu potencial degradador de hidrocarbonetos. Este artigo ajudará os pesquisadores na caracterização da biodiversidade microbiana em amostras ambientais e, especificamente, na triagem de micróbios com potencial de biorremediação.

Isolamento, Propagação e Identificação de Espécies Bacterianas com Propriedades Metabolizadoras de Hidrocarbonetos de Habitats Aquáticos

Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.

Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

Extração aprimorada de DNA de baixo peso molecular de águas residuais para avaliação abrangente da resistência antimicrobiana 

Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.

Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio

Biologia de comunidades microbianas - Entrevista

Aprenda a extrair DNA de alto peso molecular de esteiras microbianas hipersalinas. Este protocolo melhora a qualidade e concentração do DNA ao separar células microbianas da matriz antes da extração.

Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas

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