Name: Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a medir a cinética de transcrição da RNA polimerase II em células humanas vivas usando marcadores fluorescentes e FRAP. Este método permite visualizar a síntese de mRNA em tempo real.

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YS-T é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC), o Israel Science Foundation (ISF) (250/06), ISF-Bikura, Cancer Research Fund Israel (ICRF), alemão-israelense Fundação para Pesquisa e Desenvolvimento Científico (GIF ), EUA-Israel Binacional Science Foundation (BSF), alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP), e os ministérios israelenses de Ciência e Saúde, e é o Jane Stern Fellow Família Lebell em Ciências da Vida da Universidade Bar-Ilan University. YB é grato à Fundação Azrieli para a atribuição de uma bolsa Azrieli.

O sistema celular utilizado deve conter uma construção gene integrado que inclui MS2 seqüências de repetição para a marcação do mRNA em células vivas. Neste protocolo, usamos uma linha celular humana U2OS abrigando um gene de maneira estável β-actina integrada, que é fluorescente etiquetado no DNA, RNA e proteínas 8, da seguinte forma (Figura 1A): A 5 'do gene contém operador lac ( Laco) repete - estas são usadas para marcar o gene (DNA) e, assim, identificar o locus de integração genômica. A proteína fluorescente etiquetado lac repressor (LacI) se ligará à repete Laco e tag do DNA. Os mRNAs são marcados com YFP-MS2 proteínas que se ligam ao MS2 repete (tronco-loops). O produto do gene é CFP-actina e, portanto, a indução do gene irá resultar no aparecimento de CFP-tagged citoesqueleto de actina. A modificação genética é transfectadas em uma linhagem de células U2OS Tet-On estável e sua expressão está sob controle transcricional Tet. 1. Revestimento de célula e transfecção: <ol><li> 48 horas antes das medições, semente ~ 2 * 10 5 células em placas de cultura de fundo de vidro tecido (35 milímetros pratos petri com 14 milímetros de vidro de fundo micropoços (,16-0,19 mm de espessura;. Cat. P35G-1.5-14-C , Mattek, Ashland, MA)). Adicionar 2 ml de meio para as células, a fim de atingir confluência 50-80%. </li><li> 24 horas antes do experimento, transitoriamente transfecção as células com construções que expressam os marcadores fluorescentes para marcação de DNA eo mRNA. Use FuGENE6 reagentes de transfecção (Roche). Os construtos utilizados: <ol type="a"><li> YFP-MS2-NLS irá marcar o tronco MS2-loops nas transcrições mRNA. A seqüência de localização nuclear (NLS) fornece a seqüência de entrada para a proteína nuclear YFP-MS2. </li><li> opcional - CFP-LacI ou RFP-LacI que ligará o laço se repete na 5 'do gene e rotular o locus do gene. Lócus de marcação do gene auxilia no rastreamento do gene durante o experimento FRAP, mas não é necessário. </li></ol></li><li> Incubar as células durante pelo menos 12 horas, para obter boa expressão das proteínas transitória transfectadas (ver nota). </li><li> 6 - 12 horas antes do experimento adicionar 1,5 mcg / ml doxiciclina (Sigma) para as células para ativar do Tet induzível gene-PCP-actina. </li></ol> Notas: * É importante não se atingir níveis muito elevados de expressão das proteínas transfectadas para não mascarar o sinal obtido especificamente a partir do site a transcrição, em relação ao sinal de fundo. Níveis de expressão pode ser controlada por: a) ajustar o tempo entre a transfecção e da experiência; b) alterando a força do promotor (por exemplo, CMV é mais forte que o promotor L30); c) adição de um sinal de exportação nuclear (NES) para o YFP-MS2-NLS proteína, o que ajudará a distribuir o sinal YFP em toda a célula. * O fluoróforo usado para as medições devem ser preferencialmente fotoestável aquisições em todo tempo, por isso verde / amarelo fluoróforos que emitem são melhores do que fluoróforos vermelho. Informações sobre os fluoróforos diferentes podem ser encontrados na ref 10. * Determinar que os canais de luz diferente não sangram-through para o outro. Use slides contendo espécimes rotulados com cada um dos marcadores separadamente, medida em cada slide a intensidade de ambos os canais, e depois calcular a sangrar-through. 2. FRAP: O experimento pode ser realizado em qualquer microscópio que é capaz de adquirir imagens tanto e realizando fotobranqueamento com um feixe de laser. Normalmente, os experimentos FRAP são realizadas com um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). No entanto, como no nosso caso, o experimento é relativamente longo (15-30 min), e estamos seguindo um locus de pequeno porte dentro do núcleo, é importante ser capaz de manter o gene do site lócus / transcrição em foco durante todo o experimento. Isso exige uma rápida imagem em 3 dimensões ao longo do tempo (4D), e as taxas de aquisição, tais são difíceis de obter através de um microscópio de varredura confocal. Por isso, usamos um sistema 3D-FRAP (fotométricos), construído em um grande campo Olympus IX81 microscópio (63X Plan-Apo, 1,4 NA) equipado com um EM-CCD (Quant-EM, Roper), que pode adquirir imagens em alta velocidade (até 30 imagens / seg). O sistema tem 405 nm e 491 nm lasers que podem ser sincronizados com a câmera para permitir fotobranqueamento em uma região específica de interesse (ROI) da amostra. O microscópio é equipado com uma fonte Lambda DG-4 luz (Sutter) e um estágio XY e Z (prévia) que permite que imagens rápidas e precisas no Z-eixo. Todo o equipamento é integrado e controlado por Metamorph (dispositivos Molecular). Os experimentos em células vivas, são realizados a 37 ° C com 5% de CO 2, utilizando um sistema de câmara de live-célula (Tokai). <ol><li> Procedimento: Meia hora antes do experimento, ligue o microscópio de aquecimento do dispositivo e laser. Durante a experiênciamento a temperatura deve permanecer constante, caso contrário, pode causar mudanças de foco durante os tempos de aquisição de comprimento. Potência do laser deve ser estável para produção de energia consistente. </li><li> Sincronizar o laser com a câmara: <ol><li> Busca de uma área na placa que não contém células (utilizando DIC). </li><li> Use o canal de mesma luz que será usada para os experimentos. Aqui usamos o laser 491 nm para o canal YFP. </li><li> Aponte o laser para o meio da imagem. </li><li> Use o botão de sincronizar (desde macro). </li><li> Tente pontos diferentes no campo para garantir que o laser ea câmera são sincronizados. </li></ol></li><li> Escolha uma célula bom candidato para o experimento. Apesar de trabalhar com linhagens de células estáveis, descobrimos que nem todas as células têm níveis de expressão similar. Bons candidatos seriam as células que: a) exibem uma YFP-MS2-tagged clara local transcrição acima do difusa YFP-MS2 fundo, e b) ter YFP-MS2 livre suficiente de proteína na célula, de modo a ser capaz de recuperar totalmente após a fotobranqueamento (exemplo na figura 1B - compare as duas células, a célula à esquerda não é um bom candidato para clareamento). </li><li> Escolha condições adequadas de medição. O procedimento FRAP requer a aquisição de muitas imagens, e por isso é importante para o equilíbrio entre os tempos de exposição razoável e usando como luz mais baixa possível. Altos níveis de luz podem afetar a célula devido à fototoxicidade, e fará com que fotobranqueamento. Recomenda-se manter os parâmetros de imagem constante entre diferentes experimentos. Células são gravadas no canal YFP com 150 vezes a exposição ms, e no canal PCP para a detecção de CFP-laci (locus genômica). Após o locus CFP-LacI tag permite a detecção do gene, mesmo quando o YFP-MS2 sinal de mRNA é Foto-descoloração (opcional). Para cada aquisição, 7 Z-fatias são tomadas a cada 350 nm. O site de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491. </li><li> Realizar o experimento completo, mas sem branqueamento. O experimento FRAP mede o tempo que leva para o site de transcrição para retornar ao estado estacionário. Primeiro, queremos verificar se o site de transcrição ativa é funcional e estável no estado estacionário. Por isso, realizamos um experimento FRAP completa, mas sem branqueamento para garantir que a intensidade medida do local a transcrição não muda durante o período do experimento. Nós usamos esta experiência para também testar nossas condições de imagem através da medição da fotobranqueamento total causado pela série de imagens completo. Como regra geral, o photobleach filme completo não deve ser superior a 30% da intensidade inicial. Isto pode ser medido através da razão de intensidade do mesmo ponto no núcleo da última imagem, divididos por primeira imagem (razão deve ser maior que 0,7). </li><li> FRAP: O sinal YFP-MS2 no local de transcrição ativa é branqueada utilizando o laser nm 491. 6 pré-bleach imagens são adquiridas. Pós-bleach imagens são adquiridas em uma seqüência de três freqüências de tempo: 15 imagens a cada 3 seg, 15 imagens a cada sec 6, e 26 (ou 45 para os experimentos de comprimento) imagens a cada 30 seg. As mudanças na freqüência de adquirir imagens permite adquirir imagens durante os tempos que mostram a mudança de maior intensidade (inicial de recuperação), e menos imagens para o final, quando as mudanças no sinal são menos proeminentes. </li></ol> Notas: Este experimento difere da FRAP "regular" em que: * FRAP de mRNA no local transcrição medidas a ligação do YFP-MS2 proteínas para o mRNA nascente, ao passo que experimentos FRAP típico medir a mobilidade de diferentes proteínas na célula. Portanto, não há interesse em medir a piscina difusivo de YFP-MS2 proteínas. Quando o tempo entre o branqueamento ea primeira imagem adquirida é relativamente longo, é possível desconsiderar essa piscina difusão do livre-YFP MS2 proteínas. * Uma vez que a recuperação do sinal YFP-MS2 é relativamente longo (15-30 min), é importante para manter o local de transcrição em foco. É por isso que uma série de Z-slices é adquirido em cada ponto do tempo. 3. Normalização dos dados FRAP: O 4D FRAP dados são analisados ​​usando o software livre de análise de imagem ImageJ (NIH, Bethesda, MD; <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Seguinte é a análise realizada com macros disponíveis através do software ImageJ, mas é claro que a auto-escrito macros podem ser geradas. <ol><li> Z-pilhas são projetadas máxima em cada ponto do tempo, resultando em um filme 2D ao longo do tempo para análise posterior. </li><li> O site de transcrição é controlado em cada quadro e a intensidade média é medido utilizando a ferramenta Rastreador Spot. 11 Os dados são salvos em uma folha de Excel para análise posterior. </li><li> Para cada ponto do tempo, as intensidades média de outras regiões de interesse (ROI) são medidos da seguinte forma (usando o Analisador de Séries Temporais plug-in de ImageJ): a) A parte de trássolo é retirado de um ROI fora da célula = B (t). b) Um ROI no nucleoplasma, mas, tanto quanto possível do local de bleach = C (t). c) O site de transcrição = S (t) (medida pelo rastreador spot). </li><li> Corrigir os dados para a fotodegradação causada durante o exame: Subtrair o fundo de todas as outras medidas e corrija a lixívia. Sc (t) é a intensidade corrigida do site transcrição no tempo t. </li></ol> eq. 1: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq1.jpg" alt="Equação 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 1"><ol start="5"><li> Normalizar os dados: em primeiro lugar calcular a média das imagens pré-sanitária, o que mostra a intensidade do site transcrição no steady-state (= &lt;Sc (pre-bleach)&gt;). </li></ol> Então normalizar os dados: eq. 2 <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq2.jpg" alt="Equação 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 2"> Os dados são normalizados por pelo menos 10 experimentos. Calcular a média dos experimentos eo desvio-padrão (STD) para as barras de erro em cada ponto do tempo (Figura 1C). Notas: A difusão da proteína YFP-MS2 durante a análise FRAP foi desconsiderada uma vez que a taxa de difusão de livre nucleoplásmica YFP-MS2 é muito rápido, enquanto o limite YFP-MS2 está associada com alta afinidade ao mRNA, e não reconectados à transcrição site. É por isso que a primeira imagem após o clareamento deve ser removido antes da análise. 4. Analisando os dados usando um modelo matemático: A fim de recuperar os parâmetros cinéticos a partir deste tipo de conjunto de dados, foi utilizado o modelo mais simples descrito que pode caber este tipo de dados. A explicação completa deste modelo específico pode ser lido aqui 5. O modelo contém as seguintes equações que descrevem o esquema na figura 2A: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq3.jpg" alt="Equação 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 3"> <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq4.jpg" alt="Equação 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 4"> Tendo os parâmetros do modelo, é possível calcular a taxa de alongamento: <img src="/files/ftp_upload/2898/2898eq5.jpg" alt="Equação 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equação 5"> Analisamos a curva usando Berkeley Madonna ( <a href="http://www.berkeleymadonna.com">http://www.berkeleymadonna.com</a> ), como já modelado 5, mas outras opções estão disponíveis (MatLab, Cell Virtual, COPASI etc.) Os dados foram ajustados ao modelo e constantes de velocidade foram extraídos. Damos o código em Berkeley Madonna. A fim de melhor ajustar os dados foi calculado o estado de equilíbrio e depois ajustar os dados experimentais normalizados para o modelo normalizado. 5. Resultados representativos: Nós Foto-descoloração do sinal de mRNA marcado no local de transcrição ativa usando laser de alta potência, e seguiu a recuperação da YFP-MS2 sinal ao longo do tempo. O sinal fluorescente no local transcrição consiste na cinética de estado estacionário da síntese de mRNA, assim como mRNA liberado do site. Medir a intensidade local de transcrição ao longo do tempo sem branqueamento dá um sinal de 'constante' (figura 1C, os pontos vermelhos), que implica que este gene está atualmente em um estado relativo constante. Isto significa que o sinal que se acumula no mRNA recentemente transcrito é igual ao sinal que sai quando um mRNA é liberado a partir do site de transcrição. Quando Foto-descoloração, este sistema continua em seu estado estacionário, mas agora é possível medir o tempo que leva para o sinal para se recuperar. Portanto, a recuperação da fluorescência em sua maioria depende das propriedades de alongamento da polimerase. O sistema FRAP 3D permitiu a obtenção do volume 3D completa nuclear durante a recuperação FRAP e, portanto, nenhum sinal foi perdido durante os experimentos. Para calcular os parâmetros cinéticos a partir dos dados, a curva normalizada foi montado para o alongamento modelo cinético que descreve, que é baseado em equações diferenciais. 5 A vantagem de usar um modelo simples ODE é que ele pode estar apto para apenas um pequeno número de parâmetros . O passo inicial do modelo (ponto de entrada) é o alongamento, ou seja, o processo responsável pela síntese nova MS2-binding sites. A etapa final (ponto de saída) é a liberação mRNA no nucleoplasma. O modelo é baseado nas curvas de recuperação, que consistem em dois componentes cineticamente resolvido, uma rápida e mais lenta. O componente rápido refere-se a elongação, enquanto que o componente mais lento foi modelada como polimerase pausa durante o alongamento. Os dois estados da polimerase foram modeladas como alongamento com uma transição estocásticos para uma pausa. Nós otimizamos as equações diferenciais deste modelo, que rendeu uma velocidade de alongamento de 3,3 kb / minuto com uma transição estocásticos para uma taxa mais lenta de síntese (pausa para um tempo acumulado de 2,5 minutos). Modelagem mostrou that esta transição de alongamento para pausar afetado apenas 11% das polimerases que entrou alongamento. <table border="1"><tbody><tr><td> K fora </td><td> 0,0112 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_in </td><td> 0,0015 </td><td></td></tr><tr><td> K pause_out </td><td> 0,0067 </td><td></td></tr><tr><td> Tempo de alongamento </td><td> (K + para fora k pause_out) -1 </td><td> 56 seg </td></tr><tr><td> Tempo de pausa </td><td> (K pause_out) -1 </td><td> 2,5 minutos </td></tr><tr><td> Probabilidade de fazer uma pausa </td><td> (K pause_in) / (K + k pause_in out) </td><td> 11% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. O modelo resulta em uma tabela de parâmetros. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) O sistema de célula experimental utilizada para acompanhar a expressão gênica in vivo. Representação esquemática do gene CFP-actina construir. A 5'-end contém uma série de 256 repete Laco que estão vinculados por RFP-LacI (vermelho) e marcar o local da integração gene. Indução da transcrição do promotor CMV mínima é obtida pela ligação de reverter a tetraciclina ativador transcricional (rtTA ou Tet-On) para Tet-responsive elementos (TREs) na presença de dox. O mRNA transcrito contém a seqüência de codificação para CFP-β-actina, e 24 MS2 repete que estão vinculados pela proteína de fusão YFP-MS2. No final 3'-, uma parte de um módulo de coelho β-globina exon-intron-exon é seguido por um sinal de clivagem-poli. O esquema também descreve o ensaio de alongamento mostrando fluorescentes MS2 proteínas (amarelo) ligado ao mRNAs transcritos recém transcrito pela RNA Pol II. (B) Um site de transcrição ativa (YFP-MS2, célula à direita) foi Foto-descoloração ea recuperação de fluorescência foi monitorado ao longo do tempo (frames na parte inferior). Nós medimos a intensidade de fluorescência de ambos lixívia (linha média) e não-branqueada (linha inferior) sites de transcrição ativa. Nota da célula da esquerda não é adequado para um experimento fotobranqueamento. (C) As medições experimentais realizadas no CFP-actina sites da transcrição de genes. Nas curvas azul a recuperação das medições YFP-MS2 FRAP. Em vermelho, uma célula não-branqueada a partir do mesmo experimento mostrando o sinal YFP-MS2 no local de transcrição no estado estacionário. <img src="/files/ftp_upload/2898/2898fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. (A) Esquema do modelo que descreve a cinética de entrada e saída de mRNAs marcados com YFP-MS2 moléculas no local de transcrição. (B) YFP-MS2 dados FRAP e da simulação equipados (a média de dez experimentos foi montado o modelo) . Os resíduos calculados do ajuste são apresentados na parte inferior.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método para medir a atividade da polimerase cinética em células vivas podem ser divididos em duas partes. A primeira parte descreve o procedimento de &quot;molhado&quot;, que permite a medição e recuperação dos dados cinéticos de transcrição de mRNA, enquanto que na segunda parte, os dados são analisados ​​utilizando um modelo de ODE. 5 A série de estudos têm agora utilizada esta abordagem para extrair cinética de transcrição em células vivas 5, 6, 8, 12-14. A principal diferença entre estes estu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Doxiciclina </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> FuGENE reagentes de transfecção 6 </td><td> Roche </td></tr></tbody></table>

medição da cinética de transcrição mrna em células living single

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo de transcrição in vivo é importante. Pol cinética II foram medidos utilizando métodos bioquímicos ou moleculares. 1-3 Nos últimos anos, com o desenvolvimento de novos métodos de visualização, tornou-se possível seguir a transcrição como ocorre em tempo real em células vivas único. 4 Aqui nós descrevemos como para realizar a análise de Pol II alongamento cinética em um gene específico nas células vivas. 5, 6 Usando uma linha de célula na qual um locus gene específico (DNA), seu produto mRNA, eo produto final pode ser a proteína fluorescente etiquetado e visualizados in vivo , é possível detectar a transcrição de mRNAs real sobre o gene de interesse. 7, 8 O mRNA é fluorescente etiquetado com o sistema MS2 mRNAs para marcação in vivo, onde o 3&#39;UTR de transcritos no mRNA de conter 24 MS2 haste-laço repete, que fornecem altamente específicos sítios de ligação para a proteína casaco YFP-MS2 que rotula o mRNA como é transcrito. 9 Para monitorar a cinética de transcrição usamos a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) método. Por fotobranqueamento as transcrições YFP-MS2-tagged nascente no local da transcrição e, em seguida, após a recuperação deste sinal ao longo do tempo, obtemos a taxa de síntese dos mRNAs recém-feitos. 5 Em outras palavras, YFP-MS2 recuperação de fluorescência reflete a geração de novos MS2-tronco-loops nas transcrições nascente e sua ligação por fluorescentes YFP-MS2 livre moléculas entrem a partir do nucleoplasma circundante. As curvas de recuperação FRAP são então analisados ​​por modelos mecanicistas matemática formalizada por uma série de equações diferenciais, a fim de recuperar os parâmetros de tempo cinética de transcrição.

Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

A atividade transcricional da RNA polimerase II (Pol II) é um processo dinâmico e, portanto, a medição da cinética do processo transcricional em ...

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a dinâmica transcricional da polimerase de RNA dois em células vivas enquanto ela transcreve um gene específico em tempo real. Para acompanhar a transcrição em uma sequência gênica específica, um construto gênico é integrado de forma estável em uma linhagem celular humana. Esse gene entra em várias cópias em um único local aleatório no genoma e forma um lócus gênico contendo uma matriz em tandem desse gene específico.Quando a expressão gênica é ativada, a RNA polimerase II é recrutada para o gene e se move ao longo da fita de DNA na direção a jusante, gerando a molécula de mRNA para permitir a marcação e detecção do mRNA transcrito. Uma série de sequências únicas ou repetições MS2, que servem como sítios de ligação para uma proteína fluorescente YFP-MS2, foi fundida à sequência do gene. A taxa na qual os loops MS2-STEM são formados corresponde à taxa de transcrição; a recuperação da fluorescência após fotobranqueamento, ou FP, é então utilizada para detectar visualmente a transcrição em andamento.Um feixe a laser intenso é direcionado ao sítio de transcrição ativa para fotobranquear as moléculas de YFP MS two, e a recuperação da fluorescência é monitorada. A taxa na qual o sinal de fluorescência se recupera reflete a velocidade com que a RNA polimerase two está transcrevendo. É obtida uma curva de recuperação que mostra a medida do aumento na intensidade de YFP MS two no sítio de transcrição.Com o tempo, a cinética transcricional pode então ser extraída desses dados. Os resultados obtidos mostram que as taxas de alongamento da RNA polimerase II in vivo podem ser medidas e que essas são muito mais rápidas do que as medidas anteriores in vitro. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como abordagens bioquímicas, é que aqui podemos medir a cinética dentro de uma única célula viva em um gene específico.Esses métodos podem fornecer informações sobre o processo mais básico de transcrição de mRNA que ocorre em cada célula do nosso corpo. A demonstração visual desses métodos é importante, pois existem várias etapas que precisam ser realizadas inicialmente. Realizamos experimentos com células sob um microscópio, e essas etapas precisam ser seguidas pela análise de dados utilizando software de computador, a fim de analisar a cinética de alongamento da RNA polimerase II em um gene específico em células vivas.Este protocolo utiliza uma linhagem celular humana U2 OS, na qual o gene da beta actina integrado de forma estável, seu produto de RNA mensageiro e o produto proteico final podem ser marcados fluorescentemente. É mostrada aqui uma representação esquemática da construção do gene da beta actina CFP que foi integrada nas células U2 OS. A indução transcricional a partir do promotor mínimo de CMV é obtida pela ligação do ativador transcricional reverso de tetraciclina aos elementos responsivos à tet, ou tres, na presença de doxiciclina; o RNA mensageiro transcrito contém a sequência de revestimento para a beta actina CFP e 24 repetições de MS2 que são ligadas pela proteína de fusão YFP-MS2.Um sítio de transcrição ativo aparecerá amarelo devido à ligação das duas proteínas YFP MS2. O citoesqueleto de actina aparecerá azul devido à actina marcada com CFP. 48 horas antes do experimento de recuperação da fluorescência após fotobranqueamento ou experimento FRAPE, prepare as células U2OS para transfeção, semeando aproximadamente duas vezes 10 à quinta potência de células em placas de cultura tecidual com fundo de vidro e adicionando dois mililitros de meio às células para atingir 50 a 80% de confluência. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius. 24 horas depois, 24 horas antes do experimento FRAPE, transfete as células de forma transitória com um construto YFP MS2 que expressa o marcador fluorescente para marcação do RNA mensageiro. O construto YFP MS2 contém uma sequência de localização nuclear ou NLS que proporciona a entrada nuclear da proteína YFP MS2.Incube as células por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius para obter uma boa expressão das proteínas transfectadas transitoriamente. De seis a 12 horas antes do experimento, adicione doxiciclina às células para ativar o gene indutível de actina CFP TED e retorne as células ao incubador a 37 graus Celsius. Como nosso experimento é relativamente longo e estamos acompanhando um pequeno locus dentro do núcleo, é importante ser capaz de manter o sítio de transcrição do locus gênico em foco durante todo o experimento.Isso exigia uma aquisição de imagens rápida em três dimensões ao longo do tempo. Portanto, utilizamos um sistema 3D FRA em vez de um microscópio confocal de varredura a laser. Meia hora antes do experimento com células vivas, ligue o microscópio com dispositivo de aquecimento e o laser.O equipamento utilizado para esta demonstração é um sistema 3D frap montado sobre um microscópio de campo amplo Olympus IX 81, equipado com uma câmera EM CCD capaz de adquirir imagens em alta velocidade, até 30 imagens por segundo. O microscópio possui uma fonte de luz Lambda DG quatro e uma platina x, y e Z que permite imagens rápidas e precisas. No eixo Z, todos os equipamentos são integrados e controlados pelo software Metamorph.O experimento é realizado a 37 graus Celsius com 5%CO2 utilizando um sistema de câmara para células vivas. Para evitar alterações no foco durante os longos períodos de aquisição, a temperatura deve permanecer constante durante o experimento. Após a sincronização do laser e da câmera, uma célula candidata adequada deve ser escolhida para o experimento.Uma boa célula deve A exibir um sítio de transcrição claro do marcador YFP MS dois acima do fundo difuso de YFP MS dois, e B, possuir proteína YFP MS dois livre suficiente na célula para ser capaz de se recuperar completamente após o branqueamento fotônico. Em seguida, escolha condições de medição apropriadas. O procedimento frat exige a aquisição de muitas imagens.Portanto, é importante equilibrar tempos de exposição razoáveis com o uso da luz mais baixa possível. Para minimizar o fotodesvanecimento, as células no canal YFP devem ser imagiadas com tempos de exposição de 150 milissegundos para cada aquisição. Sete fatias Z serão obtidas a cada 350 nanômetros.O sítio de transcrição ativo será branqueado utilizando o laser de 491 nanômetros. As imagens pós-branqueamento serão adquiridas em uma sequência de três frequências de tempo: 15 imagens a cada três segundos, 15 imagens a cada seis segundos e 26 imagens a cada 30 segundos. Após a seleção de uma célula adequada e de condições de medição apropriadas, realize o experimento completo, mas sem o branqueamento, para verificar se o sítio de transcrição está funcional e estável em estado estacionário.Este teste avalia as condições de imageamento medindo o fotobranqueamento total causado pela série completa de imageamento. Em seguida, realize o experimento frab. Primeiro, adquira seis imagens pré-fotobranqueamento.Em seguida, utilize o laser de 491 nanômetros para blear o sinal YFP MS2 no local de transcrição ativa e adquira imagens pós-bleaching em uma sequência de três frequências de tempo: 15 imagens a cada três segundos, 15 imagens a cada seis segundos e 26 imagens a cada 30 segundos. Os dados de FRAP em 4D são analisados usando o software gratuito de análise de imagens Image.As pilhas JZ são projetadas no máximo em cada ponto temporal, resultando em um filme 2D ao longo do tempo. Para análises adicionais, o sítio de transcrição é rastreado em cada quadro e a intensidade média é medida. Utilizando a ferramenta de rastreamento de pontos, os dados são salvos em uma planilha do Excel para análises posteriores usando o plugin Time Series Analyzer do ImageJ. Meça as intensidades médias em outras regiões de interesse ou ROI para cada ponto temporal conforme segue: a) meça o fundo a partir de uma ROI fora da célula; b) meça uma ROI no nucleoplasma o mais distante possível do sítio de branqueamento; e c) meça o sítio de transcrição após correção para fotobranqueamento durante a aquisição de imagens. Normalize os dados de pelo menos 10 experimentos para recuperar os parâmetros cinéticos a partir desse tipo de conjunto de dados.O modelo mais simples descrito que pode ajustar esse tipo de dado, mostrado aqui, é o esquema do modelo que descreve a cinética de entrada e saída de RNAm marcados com YFP MS com duas moléculas no local de transcrição. Este modelo contém as seguintes equações que descrevem o esquema. Conhecendo os parâmetros do modelo, é possível calcular a taxa de alongamento usando esta equação.Mostrado aqui está um exemplo de uma célula na qual um sítio ativo de transcrição foi submetido à fotoesmaecimento, e a recuperação da fluorescência foi monitorada ao longo do tempo. A intensidade de fluorescência de sítios ativos de transcrição fotoesmaecidos e não fotoesmaecidos foi medida. Este gráfico mostra as medições experimentais realizadas nos sítios de transcrição CFP ACT e de genes.As curvas de recuperação das duas medições de FP do YFP MS estão em azul, medindo o sinal do YFP MS dois no local de transcrição. Ao longo do tempo, em uma célula não fotobranqueada do mesmo experimento, obteve-se um sinal constante indicado pelos pontos vermelhos, o que implica que este gene está atualmente em um estado estacionário relativo. A curva de recuperação da medição FRAP do YFP MS dois foi analisada usando o Berkeley Madonna para gerar esta simulação ajustada.Os resíduos calculados do ajuste são apresentados na parte inferior. Por fim, os resultados do modelo são mostrados nesta tabela de parâmetros. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da transcrição, como quais são as taxas de transcrição in vivo e quais processos co-transcricionais afetam a cinética.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como acompanhar o processo transcricional em tempo real. Esta técnica pode ser expandida para acompanhar a cinética de outros fatores de transcrição ou fatores de processamento de MNA em genes ativamente transcritos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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