Name: Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a induzir hipóxia em culturas celulares usando cloreto de cobalto e câmaras com mistura gasosa específica. Avalie a expressão de HIF-1 alpha por western blot e detecção de luminescência.

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1. Hipóxia induzida por solução de 2 CoCl Cloreto de cobalto hexa-hidratado (II) (CoCl 2 • 6H 2 O, MW = 237,9) é um indutor químico da hipóxia induzida por fator de 1,3 8. Este produto é solúvel em água (100 mg / ml), produzindo uma solução clara e vermelho. <ol><li> Prepare uma solução estoque 25 mM em água dd estéril, (preparar imediatamente antes do uso) </li><li> Use CoCl 2 na concentração final de 100μM em seus meios de cultura de células regulares para induzir hipóxia. </li><li> Adicione o CoCl 2 mídia contendo as suas células e incubar as culturas de 24 horas em uma incubadora convencional (37 ° C, 5% C0 2). </li></ol> A concentração acima funciona para as linhas de células que temos testado, mas cada linha celular deve ser testado em várias concentrações (para estabelecer uma curva dose-dependente), bem como em vários tempos de incubação, a fim de limitar a toxicidade relacionada com a droga e otimizar o ensaio. 2. Hipóxia induzida em Modular Incubadora Câmara <ol><li> Preparar pelo menos duas culturas de células idênticas (cultura twin). Culturas de células pode ser em barris, pratos ou travessas cultura. Para abrir a câmara, abre pela primeira vez as duas braçadeiras de plástico branco localizado na tubos ligados à câmara (tubos utilizados para a injeção / purga do gás hipóxico) e abra cuidadosamente o grampo anel de aço. </li><li> Solte o grampo. A tampa e bandejas podem agora ser removido. </li><li> Coloque a cultura de células na câmara hipóxica. Também colocar uma placa de Petri contendo água estéril na câmara para fornecer umidificação adequada das culturas. </li><li> Coloque a cultura de células "gêmeo" em normóxia como controle. </li><li> Verifique se o seu bandejas são garantidos e não em movimento, e depois fechar a câmara com a tampa. Posicionar corretamente a braçadeira anel de aço para garantir o fechamento hermético da câmara e fechá-lo. </li><li> Para criar hipóxia, conectar o tubo a um "tanque de hipóxia", contendo a 1% da mistura de gases O 2. Se você tiver um medidor de fluxo conectado ao seu tanque de sua câmara estará diretamente conectado a ele (gás tanque de fluxo metros-câmara). Usamos um medidor de fluxo incorporadas em nosso regulador. </li><li> É importante remover a maior parte se não estiver presente todo o oxigênio na câmara e em seus meios, para fazê-lo lavar a câmara através da abertura do tanque de gás a uma vazão de 20 litros por minuto por 7-10 minutos, em seguida, desligar rapidamente o fluxo de gás e fechar completamente a câmara, fechando ambos os grampos branco. </li><li> Retorno da câmara para uma incubadora convencional para o período de tempo desejado. Se você usar grandes culturas, permitem mídia em culturas de-gás para 1-2 horas e depois repetir flush. As etapas acima são baseados nas recomendações do construtor "(Billups-Rothenberg, Inc). Certifique-se de tanque de gás são devidamente protegidas em todos os tempos. </li></ol> Notas: <ul><li> , A fim de eliminar o O 2 contidas na mídia, é aconselhável a re-gás na câmara de uma vez depois de 1-3 horas. </li><li> Por tempo de incubação mais longo do que 48 horas também é aconselhado a re-câmara do gás. </li><li> Sensores de oxigênio (eletrodos / manômetro) que permitem medições do O 2 contidos em células / câmara irá proporcionar uma medição mais precisa do O intracelular / câmara de 2 contêm). </li><li> A cultura de células em intervalos de tempo diferentes para fazer uma curva de tempo-seria ajudar a determinar a expressão de tempo ideal de HIF-1α em suas células particular. </li></ul> 3. Avaliação de hipóxia <ol><li> HIF-1 de detecção de α por western blot. <ol><li> Reabrir a sua câmara como descrito na seção 2.2 e colocar imediatamente suas culturas no gelo. </li><li> Lyse hipóxia células tratadas e não-tratados com 5% de solução SDS nas placas, em seguida, transferir o lyzate célula para tubos, sonicate, spindown os restos celulares e recolher o sobrenadante. </li><li> Concentração medida de proteína usando kit BCA, prepare amostra pela adição de tampão de carregamento e aquecimento a 95 ° C por 5 min. </li><li> Electroforese de proteínas em um gel SDS 8% de poliacrilamida e transferência para membranas de nitrocelulose. </li><li> Bloquear a membrana em PBS contendo 5% de leite sem gordura seco e 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite em shaker. </li><li> Immunoblot durante a noite com anti-HIF-1α anticorpo primário monoclonal (1 / 600) no mesmo tampão a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min de cada vez e incube com HRP-anticorpo secundário (1 / 2000) em PBS + 0,1% Tween 20 por 45 min. </li><li> Lavar 3 vezes em PBS contendo 0,1% Tween 20 à temperatura ambiente, 5min / hora. </li><li> Use Pierce kit ECL e X-ray filme para mostrar a banda de proteína </li></ol></li><li> Elemento Responsive hipóxia (HRE). HIF-1α regula numerosos genes (ou seja, VEGF, EPO) por ligação a uma seqüência chamada elemento regulador hipóxia (HRE). Usando HRE associado a um gene marcador it é possível detectar atividade de HIF 9. Para utilizar este método, primeiro você precisa transfectar suas células com um plasmídeo HRE-luciferase usando um método de transfecção adaptado às suas células. Por exemplo usamos Lipofectamine 2000. Células precisam ser transfectadas pelo menos 4 horas antes de ser incubadas em hipóxia e normóxia. Desta vez, permite que o DNA para entrar nas células, para que este primeiro passo não é afetada pela hipóxia. O sinal de luciferase é detectada através de um kit de ensaio de luciferase. <ol><li> Incubar a sua HRE-transfectadas células em hipóxia na câmara modular ou usar HRE-transfectadas células incubadas com CoCl 2, incluem um controle normóxia. </li><li> Após o período de incubação desejado, remova o meio de crescimento das células. </li><li> Enxágüe células em PBS, remova o PBS. </li><li> Dispense 400μl do reagente de lise 1X em placa de cultura e raspar as células em anexo, depois transferi-los para um tubo de micro. </li><li> Pellet detritos por centrifugação breve. </li><li> 20μl mistura de células lisados ​​sobrenadante com 100μl de reagente de ensaio de luciferase e medir a luminescência com um luminômetro. </li></ol></li></ol> 4. Resultados representativos: Em células K562 (linha de células humanas de leucemia) cultivados dois dias em baixa de oxigênio, comparado à normóxia, hipóxia induz um aumento do HIF-1α proteína que foi detectada por western blot (Figura 1). Usando HRE-luciferase modificado 293 células (linhagem de células embrionárias de rins) cultivados em hipóxia, um aumento significativo de HIF-1α atividade foi detectada em células hipóxicas (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aumente o HIF-1α em células hipóxicas. K562 células foram cultura em normóxia e hipóxia (câmara hipóxica) por 48 horas e analisadas por western blot usando um anticorpo específico para o HIF-1α. Um anticorpo específico para actina foi usado para o controle de carga. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: HIF-1α atividade. HRE-luciferase modificado 293 células foram cultivadas em hipóxia e normóxia durante 48 horas e, em seguida, lisados ​​para detectar o sinal luciferase usando um kit de ensaio de luciferase e um luminómetro. Os resultados são expressos como a unidade de luminescência relativa (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Proliferação celular e viabilidade em condições de hipóxia variar muito, dependendo dos tipos de células. Portanto, você deve ajustar o número de células ou o número de culturas placas você começa com a certeza que terá número suficiente de células / proteínas para suas experiências. O método de cloreto de cobalto tem a vantagem de ser barato e rápido. Este produto imita hipóxia induzindo HIF-1/3α mas pode também regulam outros genes, certifique-se este produto está adaptado ao seu projeto, verificando o que outros efeitos pode ter sobre a função e fenótipo de suas células em particular, independentemente da &quot;imitam- efeito &quot;hipóxia. Outro medicamento também usado para imitar a hipóxia é o mesilato de desferroxamina (DFO, utilizado numa concentração de 100 mM final). O uso dessas drogas permite que o experimentador para abrir a placa de cultura / prato / frasco muitas vezes sem afetar a &quot;condição de hipóxia&quot;. O nível de oxigênio contido na mistura de gás pode variar de acordo com suas experiências e tipos de células como os valores variam de acordo com hipóxia dos tecidos e tipos celulares. De fato, algumas células são hipóxica em 5% O 2 outros precisam menos de 1% O 2 a ser hipóxica. 5% de CO 2 é adicionado à mistura de gás para estabilizar o pH das culturas, o resto do gás é geralmente nitrogênio. Câmaras hipóxicas têm a vantagem de não usar drogas que pode alternar o comportamento das células, independentemente da tensão de oxigênio. No entanto, nem todos os tipos de experimentação pode ser feito como o oxigênio re-entra na câmara em cada abertura e, assim, diminui a hipóxia. Você deve considerar este fator em seus experimentos; hipóxia / reoxigenação é uma condição específica que podem afetar alguns tipos de células. Uma alternativa é a utilização de estações de trabalho hipóxia (ligado a tanques de pré-mistura de gás ou de sistemas de gás de mistura) ou maior incubadora hipóxia (câmara de processamento de hipóxia com porta-luvas), que permite a experimentação de mudar de mídia e manipular as células em ambiente hipóxico contínua. Várias câmaras hipóxicas foram comercializados nos últimos dez anos e deve ser escolhido de acordo com o seu laboratório utilizado, projetos, espaço, tamanho, orçamento e. Sempre garantir o bom uso e condição da sua câmara para garantir condições de cultivo correto. Em geral quando se usa uma câmara, o nível de hipóxia pode ser modulada, selecionando as misturas de gases diversos (ou seja, 1%, 5% a 10% de oxigênio). Em relação à detecção de HIF-1α, é importante saber que algumas linhas de células cancerígenas HIF-1α expressar em normóxia. Portanto, é fundamental usar um normoxia-controle para determinar o nível basal de HIF nestas linhas celulares. HIF-1α também pode estar presente em normóxia não-malignas em células após estimulação celular ou stress. Isso também poderia ocorrer se essas células estão famintos, certifique-se culturas de células são o alimentar adequadamente e mantido.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> Cloreto de cobalto (II) </td><td> Sigma </td><td> C8661-25G </td></tr><tr><td> Câmara incubadora </td><td> Billups-Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-luciferase plasmídeo </td><td> Adgene </td><td> Plasmídeo 26731 </td></tr></tbody></table>

indução de hipóxia e testes em cultura de células

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hipóxia é definida como a redução ou falta de oxigênio nos órgãos, tecidos ou células. Esta diminuição da tensão de oxigênio pode ser devido a uma oferta reduzida de oxigênio (causas incluem rede de vasos sanguíneos insuficientes, defeito dos vasos sangüíneos e anemia) ou a um aumento do consumo de oxigênio relativo ao fornecimento (causada por uma maior taxa de proliferação celular súbita) . Hipóxia pode ser fisiológica ou patológica como em tumores sólidos 1-3 reumatóide etc artrite, aterosclerose, ... Cada tecidos e células têm uma capacidade diferente para se adaptar a esta nova condição. Durante a hipóxia, hipóxia induzida fator alfa (HIF) é estabilizado e regula vários genes como aqueles envolvidos na angiogênese ou transporte de oxigênio 4. A estabilização desta proteína é a marca registrada de hipóxia, portanto, a detecção de HIF é rotineiramente usado para triagem de 07/05 hipóxia. Neste artigo, propomos dois métodos simples para induzir hipóxia em culturas de células de mamíferos e testes simples para avaliar o estado hipóxico dessas células.

Aqui propomos métodos simples para induzir hipóxia em culturas de células e testes simples para avaliar o estado hipóxico das culturas.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

A hipóxia é definida como a redução ou a ausência de oxigênio em órgãos, tecidos ou células. Esta diminuição da tensão de oxigênio pode ser devida a um suprimento reduzido em...

O objetivo geral deste procedimento é induzir hipóxia em cultura celular. Isso é realizado primeiramente cultivando as células na presença de um indutor químico do fator indutível um hipóxico, ou cultivando as células em um incubador ou câmara de hipóxia preenchidos com uma mistura gasosa especial. Em seguida, a hipóxia é detectada mediante a verificação do nível de expressão da proteína HIF-1α em extratos proteicos celulares, ou pela medição de sua atividade utilizando um vetor ENC que codifica sequências de ligação para HIF-1α.Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram um aumento nos níveis de expressão e na atividade da HIF um alfa por meio de western blot e detecção de luminiscência. Meu nome é Danny U. Sou pesquisador no laboratório de Patrizia Inda. Hoje demonstrarei este procedimento para induzir hipóxia com cloreto de cobalto.Inicie preparando uma solução estoque de cloreto de cobalto a 25 milimolares em água destilada e estéril. Adicione a solução às células e cultive em uma concentração final de 100.Micromolar. Incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para induzir hipóxia.Utilizando uma câmara de incubação modular, prepare pelo menos dois cultivos celulares idênticos. No entanto, recomenda-se uma triplicata para cada condição. Abra a câmara de incubação modular abrindo primeiro os dois grampos de plástico brancos localizados nos tubos conectados à câmara e remova a tampa e as bandejas.Coloque a cultura celular na câmara hipóxica com uma placa de Petri contendo água estéril dentro da câmara para fornecer uma umidificação adequada das culturas. Coloque a segunda cultura celular em normoxia como controle para induzir hipóxia. Conecte a tubulação a um tanque de hipóxia contendo uma mistura gasosa com 1% de oxigênio.Se um medidor de fluxo estiver conectado ao seu tanque, a câmara será diretamente conectada a ele. Utilizamos um medidor de fluxo incorporado ao nosso regulador para remover todo o oxigênio presente na câmara e no meio. Purgue a câmara abrindo o tanque de gás a uma taxa de fluxo de 20 litros por minuto durante quatro a sete minutos.Em seguida, desligue rapidamente o fluxo de gás e feche completamente a câmara, fechando ambas as braçadeiras brancas. Retorne a câmara para uma estufa convencional pelo período de tempo desejado.Se estiver usando culturas grandes, deixe o meio e as culturas em DGAs por uma a duas horas e, em seguida, repita a lavagem para avaliar a hipóxia. Utilizando a detecção de HIF-1α por western blot, reabra a câmara conforme demonstrado anteriormente e coloque imediatamente as culturas sobre gelo. Lisar as células tratadas e não tratadas com hipóxia usando solução de SDS a 5%.Em seguida, transfira os lisados para tubos e sonique para extrair as proteínas, centrifugue para sedimentar os detritos celulares e colete o sobrenadante. A seguir, meça a concentração de proteína utilizando um kit BCA. Depois, prepare uma amostra para gel adicionando tampão de carga e aquecendo a 95 graus Celsius por cinco minutos.Se pare as proteínas em um gel de poliacrilamida SDS a 8% e transfira-as para uma membrana de nitrocelulose. Bloqueie a membrana em PBS contendo 5% de leite desnatado e 0,1% de tween 20, durante uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius, em agitador. Incube o blot durante a noite com um anticorpo primário monoclonal anti-HIF-1α no mesmo tampão a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave a membrana três vezes, por cinco minutos cada, em PBS contendo 0,1% de tween 20 à temperatura ambiente, depois incube com um anticorpo secundário conjugado à HRP em PBS contendo 0,1% de tween 20 por 45 minutos. Lave novamente três vezes, por cinco minutos cada, em PBS contendo 0,1% de tween 20 à temperatura ambiente.Em seguida, incubar a membrana em soluções de detecção quimioluminescentes e expô-la a filme radiográfico para medir a atividade de luciferase. Remover o meio de crescimento das células cultivadas. Lavar as células com PBS.Em seguida, adicione 400 microlitros de reagente de lise 1x ao recipiente de cultura. Raspe as células aderidas e transfira-as para um tubo microcêntrifuga. Pelotize os detritos por meio de uma breve centrifugação.Misture 20 microlitros do sobrenadante do lisado celular com cem microlitros do reagente de ensaio de luciferase e meça a luminiscência utilizando um luminômetro. Células K 5 62 foram cultivadas em normóxia ou hipóxia por 48 horas e analisadas por western blot utilizando um anticorpo específico para H one alpha. Um anticorpo específico para beta actina foi utilizado como controle de carga.Os resultados mostram um aumento na HIF-1α em células hipóxicas. Células 293 modificadas com luciferase sob controle do HRE foram cultivadas em hipóxia ou normóxia por 48 horas e, em seguida, processadas para detecção do sinal de luciferase utilizando um kit de ensaio de luciferase e um luminômetro aqui. Um aumento na atividade da HIF-1α também foi detectado em células hipóxicas.Os resultados são expressos como luminiscência relativa. Unidades Não se esqueça de que trabalhar com gases precisos pode ser extremamente perigoso e precauções, como fixar o cilindro de oxigênio corretamente na parede ou bancada, abrir e fechar adequadamente o cilindro de oxigênio, bem como controlar a pressão, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Biologia

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Aprenda a induzir hipóxia em culturas celulares usando cloreto de cobalto e câmaras com mistura gasosa específica. Avalie a expressão de HIF-1 alpha por western blot e detecção de luminescência.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

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